ĆWICZENIE 1 - 01.03.2011

Hemoglobina, produkty przemiany hemoglobiny metabolizm żelaza

ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA

1. Transport O₂ i CO₂ przez hemoglobinę (Hb).

2. Katabolizm hemu, bilirubina wolna i związana.

3. Białka transportujące i magazynujące jony żelaza.

4. Metody wykorzystywane do oznaczania bilirubiny, Hb i żelaza.

WPROWADZENIE

Hemoglobina

Hemoglobina jest hemoproteiną zbudowaną z czterech łańcuchów polipeptydowych, a każdy łańcuch połączony jest z cząsteczką hemu. Bierze ona udział w transporcie tlenu z płuc do tkanek i w pewnym stopniu także CO₂ z tkanek do płuc. W naczyniach włosowatych pęcherzyków płucnych, do jonów Fe²⁺ znajdujących się w grupie hemowej cząsteczki hemoglobiny, przyłączają się cztery cząsteczki tlenu (1 g Hb wiąże 1,36 cm³ tlenu); powstaje oksyhemoglobina - hemoglobina utlenowana. W krwi żylnej tlen odłącza się i dyfunduje do komórek różnych tkanek.

Do wolnych grup aminowych w części białkowej cząsteczki Hb może przyłączyć się CO₂, powstają karbaminiany hemoglobiny. W tej postaci transportowane jest około 20% CO₂.

Prawidłowa zawartość Hb w 100 cm³ krwi pełnej wynosi u mężczyzn 14-18 g, u kobiet 12-16g, a u noworodków 18-27 g.

Bilirubina

Rozpad erytrocytów zachodzi w komórkach układu siateczkowo-śródbłonkowego, głównie wątroby, śledziony i szpiku kostnego. Tam też następuje przemiana hemu w bilirubinę. W pierwszym etapie tego procesu bierze udział zlokalizowana w mikrosomach oksygenaza hemowa, związana z mikrosomalnym łańcuchem transportu elektronów. Przy udziale O₂ i NADPH+H⁺ prowadzi ona hydroksylację węgla w grupie metinowej znajdującej się między dwoma pierścieniami pirolowymi i następnie jego usunięcie w postaci CO. W wyniku tego następuje rozerwanie układu porfirynowego i powstaje niebieskozielony barwnik - biliwerdyna, posiadająca czteropirolowy układ łańcuchowy. Następnie biliwerdyna redukuje się pod wpływem reduktazy biliwerdyny i powstaje pomarańczowożółta bilirubina, która dyfunduje do krwi.

Reakcja katalizowana przez reduktazę biliwerdyny:

biliwerdyna + NADPH + H⁺ → bilirubina + NADP⁺

Bilirubina jest związkiem trudnorozpuszczalnym, transportowanym do wątroby w połączeniu z albuminami. Jedna cząsteczka albuminy łączy się z dwiema cząsteczkami bilirubiny. Jest to tzw. bilirubina wolna, nazywana także bilirubiną pośrednią lub przedwątrobową. W warunkach fizjologicznych jej stężenie waha się w granicach 0,1-1,0 mg/100 cm³. W warunkach prawidłowych w osoczu występuje tylko bilirubina wolna. Jest ona wychwytywana przez komórki wątroby, zostaje odłączona od albuminy i przeniesiona do wnętrza hepatocytu.

W wątrobie słabo polarna cząsteczka bilirubiny ulega dalszym przemianom, które zwiększają jej rozpuszczalność i umożliwiają sekrecję do żółci.

1) 75% bilirubiny wchodzi w reakcję z UDP-glukuronianem i powstają diglukuronidy bilirubiny (kwas glukuronowy tworzy wiązanie estrowe z grupą karboksylową bilirubiny). Reakcja katalizowana jest przez UDP-glukuronozylotransferazę bilirubiny:

bilirubina + 2 UDP-glukuronian → diglukuronid bilirubiny + 2 UDP

2) 15% bilirubiny wchodzi w reakcję z aktywnym siarczanem (5` fosfosiarczanem 3` fosfoadenozyny), przy udziale sulfotransferazy ulega ona estryfikacji i tworzą się siarczany bilirubiny.

3) 10% bilirubiny tworzy połączenia z glicyną, tauryną i metioniną.

Powstające pochodne bilirubiny tworzą tzw. bilirubinę związaną, nazywaną także bilirubiną bezpośrednią lub wątrobową. W tej postaci bilirubina aktywnie wydzielana jest do żółci i wraz z nią przechodzi do przewodu pokarmowego, gdzie ulega dalszym przemianom pod wpływem flory bakteryjnej. W warunkach prawidłowych bilirubina związana nie występuje w osoczu. Dla odróżnienia obu postaci bilirubiny (tzn. wolnej i związanej) wykonuje się odczyn van den Bergha. Dodatni wynik tej próby wskazuje na obecność we krwi bilirubiny związanej.

Stężenie bilirubiny w osoczu przekraczające 1 mg/100 cm³ oznacza bilirubinemię. Umiarkowany wzrost stężenia bilirubiny nie zawsze jest zjawiskiem patologicznym. U 5-7% populacji stwierdza się nieznaczną bilirubinemię bez towarzyszących zmian patologicznych.

Hiperbilirubinemia może być spowodowana upośledzeniem sprzęgania bilirubiny w wątrobie lub zaczopowaniem przewodów żółciowych, a także wytwarzaniem większej ilości bilirubiny niż jest w stanie wydzielić do przewodów żółciowych prawidłowo funkcjonująca wątroba. Przy stężeniu bilirubiny w osoczu przekraczającym 2-2,5 mg/100 cm³ dyfunduje ona do tkanek dając obraz kliniczny określany mianem żółtaczki. Oznaczanie stężenia bilirubiny w osoczu (pośredniej i bezpośredniej) ma duże znaczenie w diagnozowaniu żółtaczek. Wzrost stężenia bilirubiny przedwątrobowej (pośredniej) towarzyszy żółtaczce noworodków. Przyczyną tego stanu jest nadmierna hemoliza erytrocytów oraz niezdolność wątroby do skutecznego sprzęgania i wydzielania zwiększonej ilości bilirubiny. Stan taki uznaje się za fizjologiczny. Jednak, gdy stężenie bilirubiny wolnej u noworodków wzrośnie powyżej 20 mg/100 cm³ może ona przekraczać barierę krew-mózg. Następstwem tego stanu jest kernicterus - żółtaczka jąder podstawnych mózgu, prowadząca do upośledzenia umysłowego.

Przyczyną podwyższonego stężenia bilirubiny przedwątrobowej może być też niedokrwistość hemolityczna, a także dziedziczne zaburzenia sprzęgania bilirubiny w wątrobie spowodowane brakiem lub poważnymi niedoborami UDP-glukuronozylotransferazy bilirubiny (zespół Criglera-Najjara, typ I, typ II). Umiarkowanie podwyższone stężenie bilirubiny wolnej (1,2-3,0 mg/100 cm³) występuje też u osób dotkniętych zespołem Gilberta, obejmującym 3-10% populacji. Spowodowane jest to upośledzeniem wychwytu bilirubiny przez wątrobę lub znacznie częściej niedoborem UDP-glukuronozylotransferazy bilirubiny. Obecność dwu dodatkowych nukleotydów (TA) w regionie promotora genu tego enzymu powoduje jego obniżoną ekspresję.

Podwyższony poziom bilirubiny wolnej może być też spowodowany uszkodzeniem miąższu wątroby, powstałym w następstwie: wirusowego zapalenia wątroby, marskości wątroby, zatruć (chlorowcopochodnymi węglowodorów, α-amanityną), długotrwałego przyjmowania hepatotoksycznych leków. Takim stanom na ogół towarzyszy upośledzenie wydzielania sprzężonej bilirubiny, prowadzące do wzrostu jej stężenia w osoczu.

Zwiększone stężenie bilirubiny sprzężonej może być wynikiem defektu wydzielania bilirubiny do żółci (zespół Dubina-Johnsona), ale przede wszystkim wskazuje na niedrożność przewodów żółciowych. Przyczyną niedrożności może być kamica żółciowa, nowotwór lub zwężenie przewodów żółciowych.

Hiperbilirubinemia spowodowana wzrostem stężenia bilirubiny sprzężonej wiąże się z obecnością bilirubiny w moczu (bilirubinuria), podczas gdy wolna bilirubina (skompleksowana z albuminą) nigdy nie pojawia się w moczu.

Metabolizm żelaza

Żelazo odgrywa zasadniczą rolę w metabolizmie energetycznym żywej komórki, biorąc udział w utlenianiu substancji organicznych. Znaczenie biologiczne tego pierwiastka warunkują jego dwie podstawowe własności.

1. Istnienie dwóch trwałych stanów wartościowości - Fe²⁺ i Fe³⁺ - co umożliwia udział w reakcjach utleniania i redukcji.

2. Zdolność tworzenia trwałych kompleksów z wieloma związkami o bardzo różnorodnej strukturze.

Jony żelaza mogą być składnikiem hemoprotein, gdzie wbudowane są w pierścień protoporfiryny, albo mogą występować w postaci związków niehemowych. Do hemoprotein należy szereg enzymów biorących udział w procesach utleniania i redukcji (np. cytochromy, oksydaza cytochromowa, katalaza, peroksydaza) oraz białka przenoszące tlen (hemoglobina i mioglobina). Do białek niehemowych należą: białko transportujące żelazo - transferyna, białka magazynujące żelazo - ferrytyna i hemosyderyna, a także szereg enzymów np. dehydrogenaza bursztynianowa, oksydaza ksantynowa, hydroksylaza fenyloalaninowa i inne.

Całkowita ilość żelaza w organizmie dorosłego mężczyzny o masie 70 kg wynosi około 3,8 g (u dorosłej kobiety o zbliżonej masie ciała jest nieco mniejsza): w hemoglobinie znajduje się około 2,5g (65%), w ferrytynie i hemosyderynie około 1,0 g (25%), w mioglobinie i enzymach około 0,3 g (8%) i w transferynie 3-4 mg.

Żelazo zawarte w osoczu stanowi bardzo małą część całkowitej ilości żelaza w organizmie. Obrót metaboliczny żelaza jest bardzo szybki. W czasie 1 sekundy 3 miliony krwinek czerwonych ulega zniszczeniu; większość uwalnianego żelaza wraca do szpiku i jest wbudowywana w cząsteczki hemoglobiny.

Transferyna jest β₁-globuliną osocza o masie cząsteczkowej około 80000. Cząsteczka apotransferyny ma zdolność do przyłączenia dwóch jonów Fe³⁺ w obecności HCO₃^-. Powstały kompleks ma budowę: transferyna - (Fe³⁺)₂ - (HCO₃^-)₂. W warunkach prawidłowych transferyna jest wysycona żelazem w około 30%.

Ferrytyna jest to rozpuszczalne w wodzie połączenie apoferrytyny z Fe³⁺. Cząsteczka apoferrytyny (m. cz. około 430000 - 480000) jest białkiem zbudowanym z 20-24 podjednostek. Wewnątrz części białkowej znajduje się około 4000-5000 atomów Fe w postaci hydroksyfosforanów żelazowych. Całkowicie wysycona żelazem cząsteczka ferrytyny zawiera 17-23% żelaza. W warunkach prawidłowych ferrytyna występuje w bardzo małych ilościach w surowicy krwi - 12-250 μg/dm³.

Dzienne wydalanie żelaza jest bardzo małe: 0,5 - 1,0 mg (przez nerki, jelito grube, w wyniku złuszczania nabłonków). W warunkach prawidłowych powinna istnieć równowaga pomiędzy wydalaniem wchłanianiem żelaza. Dieta dzienna zawiera średnio od 10 do 15 mg żelaza, z tego wchłaniane jest 5-10%, czyli około 1 mg. Stany, które wymagają większego zapotrzebowania na żelazo, np. przewlekłe krwawienia, ciąża, wzrost organizmu, stosunkowo łatwo naruszają stan równowagi i doprowadzają do utajonego niedoboru żelaza, tzn. do obniżenia jego zawartości w magazynach. Oznaczanie stężenia żelaza w surowicy nie jest dobrym wskaźnikiem dla oceny stanu magazynów.

W warunkach prawidłowych stężenie żelaza w surowicy wynosi około 120 μg/100 cm³.

CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA

1. Oznaczanie bilirubiny całkowitej

Zasada metody

Słabe wiązania między cząsteczkami bilirubiny i białka ulegają rozpadowi w obecności kofeiny. W środowisku zasadowym bilirubina pod wpływem diazowanego kwasu sulfanilowego przechodzi w azobarwnik.

Materiał i odczynniki

1. Wzorcowe roztwory bilirubiny - 1 mg/100 cm³, 2 mg/100 cm³, 3 mg/100 cm³,

(bilirubina rozpuszczona jest w roztworze zawierającym 0,06% NaHCO₃, 0,3%

NaCl, 70% etanol).

2. Odczynnik kofeinowy (5% kofeina, 7,5% benzoesan sodu, 12,5% octan sodu).

3. Odczynnik diazo I (0,5% kwas sulfanilowy, 2% HCl).

4. Odczynnik diazo II (0,1% roztwór NaNO₂).

5. Odczynnik Fehlinga II (10% NaOH, 35% winian sodowo-potasowy).

6. Surowica krwi.

Wykonanie doświadczenia

1.Przygotować 5 probówek:

-do pierwszej dodać 2 cm³ roztworu bilirubiny o stężeniu 1 mg/100 cm³

-do drugiej dodać 2 cm³ roztworu bilirubiny o stężeniu 2 mg/100 cm³

-do trzeciej dodać 2 cm³ roztworu bilirubiny o stężeniu 3 mg/100 cm³

-do czwartej dodać 2 cm³ wody (próba ślepa)

-do piątej dodać 2 cm³ surowicy

2.Do wszystkich probówek dodać po 3 cm³ odczynnika kofeinowego

3.Przygotować odczynnik diazowy - zmieszać: 10 cm³ diazo I i 0,3 cm³ diazo II

4.Do wszystkich probówek dodać po 1 cm³ odczynnika diazowego

5.Po 10 minutach dodać do wszystkich probówek po 2 cm³ odczynnika Fehlinga II

6.Próby odstawić na 10 minut (ciemność)

7.Po tym czasie próby przesączyć, próba ślepa nie wymaga sączenia

8.Zmierzyć absorbancję wobec próby ślepej przy długości fali 600 nm.

9.Zawartość bilirubiny w surowicy odczytać z wykreślonej krzywej wzorcowej - probówki 1, 2 i 3.

2. Badanie bilirubiny bezpośredniej wg Hejmansa van den Bergha

Materiał i odczynniki

1. Odczynnik diazo I ( 0,5% kwas sulfanilowy, 2% HCl).

2. Odczynnik diazo II (0,1% roztwór NaNO₂).

3. Surowica krwi.

Wykonanie doświadczenia

Do 2-4 kropli surowicy dodać 1-2 krople odczynnika diazowego - z poprzedniego doświadczenia

1. Jeżeli w ciągu 30 sekund powstanie czerwonofioletowe zabarwienie, to wynik interpretujemy jako odczyn bezpośredni, dodatni, natychmiastowy (obecność bilirubiny związanej).

2. Jeżeli w ciągu 30 sekund nie pojawi się zabarwienie, lecz wystąpi później, np. po upływie 10 minut, jest to odczyn bezpośredni, dodatni, opóźniony (obecność bilirubiny związanej w małym stężeniu).

3. Jeżeli w ciągu 30 minut nie powstanie zabarwienie jest to odczyn bezpośredni, ujemny (brak bilirubiny związanej).

3. Oznaczanie hemoglobiny (Hb)

Zasada metody

Hemoglobina i niektóre jej pochodne są utleniane przez K₃[Fe(CN)₆] do methemoglobiny, a następnie przekształcane pod wpływem KCN w trwały związek cyjanmethemoglobinę, która wykazuje maksimum absorbancji przy 540 nm.

Materiał i odczynniki

1. Odczynnik Drabkina (0,03% K₃[Fe(CN)₆], 0,1% NaHCO₃, 0,005% KCN).

2. Krew.

Wykonanie doświadczenia

Do 5 cm³ odczynnika Drabkina dodać 0,025 cm³ krwi. Po upływie 10 minut odczytać absorbancję wobec odczynnika Drabkina przy długości fali 540 nm.

Obliczenia

A_bad × 64400 × 201

Hb (g/100 cm³ krwi) = __________

44 × 10 × 1000

201 - rozcieńczenie krwi = 5,025 : 0,025

64400 - masa molowa Hb (g/mol)

44 - milimolowy współczynnik absorbancji przy λ = 540 nm

(jest to absorbancja jaką wykazuje roztwór o stężeniu 1 mmol/dm³ i grubości warstwy 1 cm)

dzielnik 10 - wynika z przeliczenia z 1 dm³ na 100 cm³

dzielnik 1000 - wynika z przeliczenia z milimoli na mole

4. Oznaczanie żelaza w surowicy

Zasada metody

Siarczyn sodu redukuje Fe³⁺ do Fe²⁺, 2,2'-dipirydyl w środowisku kwaśnym tworzy z jonami Fe²⁺ związek kompleksowy o zabarwieniu czerwonofioletowym. Chloroform wytrąca zdenaturowane białka.

Materiał i odczynniki

1. 0,1 mol/dm³ roztwór Na₂SO₃ .

2. Odczynnik dipirydylowy (0,1% 2,2`-dipirydyl w 3% roztworze CH₃COOH).

3. Chloroform.

4. Roztwór wzorcowy Fe³⁺ o stężeniu 100 µg Fe/100 cm³.

5. Surowica krwi.

Wykonanie doświadczenia

Przygotować 4 probówki:

1. Próba właściwa: 2 cm³ surowicy,

2. Próba wzorcowa: 2 cm³ roztworu wzorcowego Fe³⁺.

3. Próba ślepa: 2 cm³ H₂O.

4. Zadanie na zaliczenie: 2 cm³ zadania.

5. Do wszystkich probówek dodać po 2 cm³ 0,1 mol/dm³ roztworu Na₂SO₃ oraz po 2 cm³ 0,1% odczynnika dipirydylowego, wymieszać i wstawić probówki na 5 minut do wrzącej łaźni wodnej.

6. Próby oziębić.

7. Do probówki nr 1 - próba właściwa - dodać 2 cm³ chloroformu, wstrząsać 30 sekund, Zawartość probówki przelać do probówki wirówkowej i wirować (5 minut/3000 obr./min). Jeżeli warstwa górna (wodna) lub dolna (chloroformowa) jest mętna należy próbęponownie wstrząsać i wirowanie powtórzyć. Górną warstwę zebrać ostrożnie pipetą, przenieść do kuwety i zmierzyć absorbancję przy 520 nm wobec ślepej próby.

8. Zmierzyć absorbancję zadania i próby wzorcowej wobec próby ślepej. (W próbach 2, 3 i 4 nie ma białka - więc niepotrzebne jest dodawanie chloroformu i wirowanie).

Obliczenia:

A _{zad (sur)}

μg Fe/100 cm³ zadania (surowicy krwi) = ────── × stężenie wzorca

A _wz

ĆWICZENIE 2 - 15.03.2011

PRODUKTY PRZEMIANY AZOTOWEJ

ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA

1. Powstawanie kwasu moczowego i jego rola w organizmie człowieka.

2. Synteza mocznika (reakcje i enzymy).

3. Metabolizm kreatyny (reakcje i enzymy).

4. Metody wykorzystywane do oznaczania w surowicy krwi stężenia kwasu moczowego, kreatyniny, mocznika i cholesterolu. Prawidłowe stężenia tych związków we krwi.

WPROWADZENIE

Kwas moczowy

Kwas moczowy jest końcowym produktem katabolizmu zasad purynowych w organizmie człowieka. Nukleotydy w komórkach ulegają stałym przemianom. Związki te są rozkładane za pomocą enzymów, a także ulegają samorzutnemu rozpadowi na skutek wpływu środowiska.

Nukleotydazy rozkładają hydrolitycznie nukleotydy do nukleozydów. Z nukleozydów fosforylazy nukleozydowe uwalniają wolne zasady i rybozo-1-fosforan. Większość uwolnionych zasad purynowych zostaje ponownie użyta do tworzenia nukleotydów na drodze rezerwowych szlaków metabolicznych.

Niewielka część uwolnionych zasad ulega przekształceniu do kwasu moczowego i jest wydalana z moczem.

Główne szlaki metaboliczne przemiany AMP i GMP prowadzące do utworzenia kwasu moczowego nieco się różnią. Katabolizm AMP rozpoczyna deaminaza AMP:

AMP + H₂O → IMP + NH₃

IMP i GMP są substratami dla 5' nukleotydazy, która przekształca je w nukleozydy.

IMP + H₂O → inozyna + P_i

GMP + H₂O → guanozyna P_i

Następnie nukleozydy są rozkładane za pomocą fosforylazy nukleozydów purynowych.

inozyna + P_i → hipoksantyna + rybozo-1-fosforan

guanozyna + P_i → guanina + rybozo-1-fosforan

Guanina pod wpływem hydrolazy - guanazy (deaminazy guaninowej) przekształcana jest do ksantyny.

guanina + H₂O → ksantyna + NH₃

Hipoksantyna i ksantyna są przekształcane w kwas moczowy przy udziale oksydazy ksantynowej.

hipoksantyna → ksantyna→ kwas moczowy

Mechanizm tej reakcji jest złożony, enzym do swojego działania wymaga udziału O₂, FAD, jonów molibdenu i żelaza. Jeden atom tlenu cząsteczkowego, utleniacza w obu reakcjach, zostaje dołączony do pierścienia puryny, drugi zaś zostaje zredukowany do H₂O_2. Nadtlenek wodoru następnie jest rozkładany przez katalazę do H₂O i O_2.

Przyłączenie tlenu do pierścienia puryny powoduje zwiększenie polarności, a zatem zwiększa rozpuszczalność związku w wodzie. Jednak kwas moczowy jest nadal związkiem trudno rozpuszczalnym. Lepiej rozpuszczalne są jego sole - moczany, które tworzą się w pH obojętnym i zasadowym. Kryształy moczanów wytrącają się w roztworach przekraczających stężenie 7 miligramów tego związku na 100 cm³ wody. Dlatego też znaczna część moczanów w osoczu zaadsorbowana jest na albuminach, co przeciwdziała ich wytrącaniu.

Prawidłowe stężenie kwasu moczowego (głównie w postaci moczanów) we krwi dorosłych kobiet wynosi od 2 do 6 mg/100 cm³, u mężczyzn od 3 do 7,5 mg/100 cm³. Stężenie kwasu moczowego w osoczu zależy także od diety, niższe stężenia tego związku występują u ludzi stosujących dietę wegetariańską.

W ciągu doby organizm zdrowego, dorosłego człowieka wytwarza przeciętnie od 400 do 800 miligramów kwasu moczowego, który następnie jest wydalany z moczem.

Nadmierne jego wytwarzanie powoduje podwyższenie jego stężenia we krwi (hiperurykemia) i jest przyczyną zmian chorobowych, wywołanych przez wytrącanie się kryształów moczanu sodu szczególnie w stawach i nerkach. Choroba ta jest znana jako dna moczanowa. Większość ssaków przekształca dalej kwas moczowy do łatwo rozpuszczalnej substancji - alantoiny. Brak możliwości przekształcania kwasu moczowego do alantoiny jest jednak korzystnym czynnikiem selekcyjnym. Moczany bardzo łatwo się utleniają i są bardzo wydajną substancją usuwającą wysoce reaktywne, szkodliwe formy tlenu, np.: rodniki hydroksylowe, aniony ponadtlenkowe. Obecność moczanów w osoczu może wydatnie przyczyniać się do wydłużenia życia ludzkiego i do zmniejszenia zapadalności na choroby nowotworowe. Moczany jak również bilirubina są przykładami reguły, że niektóre produkty końcowe pochodzące ze szlaków metabolicznych odgrywają ważną rolę jako czynniki ochronne.

Mocznik

Mocznik powstaje w organizmie w tzw. cyklu mocznikowym. Związek ten pochodzi głównie z przemiany azotowej białek.

Podczas deaminacji aminokwasów tworzy się bardzo toksyczny amoniak. Powstaje on również w mniejszej ilości, w przemianach innych związków, np. nukleotydów purynowych i pirymidynowych oraz amin. Proces syntezy mocznika pełni ważną biologiczną rolę w przekształcaniu amoniaku w łatwo rozpuszczalny, nietoksyczny w stężeniach fizjologicznych związek, który następnie jest wydalany z moczem.

Zdrowy, dorosły człowiek, na prawidłowej diecie jest w stanie tzw. równowagi azotowej. Dobowa ilość azotu wydalana z organizmu jest równa ilości azotu przyjmowanego z pożywieniem. Przy spożyciu białka w ilości około 100 gramów na dobę wydalane jest 16 gramów azotu. 80 - 90% całkowitej puli wydalanego azotu stanowi mocznik. Ilość wytworzonego w organizmie dorosłego człowieka mocznika zależy głównie od zawartości białka w pożywieniu i przeciętnie wynosi od 20 do 40 g na dobę. Stężenie tego związku we krwi w warunkach prawidłowych waha się w szerokich granicach, od 20 do 40 mg/100 cm³, a nawet może osiągać 50 mg/100 cm³.

Synteza mocznika zachodzi wyłącznie w wątrobie. Amoniak łączy się z CO₂ tworząc karbamoilofosforan, reakcja ta wymaga udziału dwóch cząsteczek ATP, jako źródła energii. Karbamoilofosforan następnie reaguje z ornityną, tworząc cytrulinę. Cytrulina przy udziale energii pochodzącej z hydrolizy ATP kondensuje z asparaginianem, który jest dawcą drugiego atomu azotu. Powstały argininobursztynian ulega rozszczepieniu na argininę i fumaran. Arginina hydrolizuje dając mocznik i ornitynę, zamykając w ten sposób jeden obrót cyklu. Dwie pierwsze reakcje zachodzą w mitochondriach komórek wątroby, pozostałe trzy przebiegają w cytoplazmie.

Kreatynina

Kreatynina jest produktem degradacji kreatyny. Kreatyna występuje głównie w mięśniach i w postaci fosforanu jest magazynem energii. Cykl mocznikowy jest także punktem wyjścia do syntezy tego ważnego metabolitu. Arginina, metabolit cyklu mocznikowego, ulega w komórkach nerki kondensacji z glicyną. Powstaje guanidynooctan, który jest metylowany przez S-adenozylometioninę (SAM) do kreatyny. Kreatyna jest następnie fosforylowana za pomocą ATP i przechodzi w fosforan kreatyny, stanowiący zapas łatwo uruchamianej energii w mięśniu. Ostatni etap przemiany odbywa się bez udziału enzymów. W ciągu doby około 1,6% fosfokreatyny przekształca się w bezwodnik - kreatyninę (Rys. 2).

Kreatynina jest wydalana z moczem, przeciętnie od 1 do 1,8 gramów na dobę. Prawidłowe stężenie kreatyniny w surowicy wynosi u dorosłych kobiet od 0,5 do 1 mg/100 cm³, a u mężczyzn 0,6 - 1,2 mg/100 cm³. Znacznie niższe stężenie kreatyniny występuje u małych dzieci do trzech lat (0,2-0,4 mg/100 cm³). W miarę dorastania stężenie to stopniowo wzrasta, aby osiągnąć w wieku 17 lat wartości charakterystyczne dla ludzi dorosłych.

Podwyższone stężenie kreatyniny we krwi może wystąpić w chorobach nerek, mięśni i zatruciach witaminą D.

CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA

1. Oznaczanie kwasu moczowego w surowicy krwi

Zasada metody

Kwas moczowy w środowisku alkalicznym redukuje sole kwasu fosforowolframowego do tlenków wolframu na niższym stopniu utlenienia, mających zabarwienie niebieskie, a sam utlenia się do alantoiny (Rys. 1). Kwas moczowy należy oznaczyć w roztworze otrzymanym po odbiałczeniu surowicy. Denaturację białek przeprowadza się za pomocą soli metali ciężkich, w tym przypadku jonów wolframu.

Odczynniki

1. 10% roztwór wolframianu sodu.

2. 0,3 mol/dm³ roztwór H₂SO₄.

3. Wzorcowy roztwór kwasu moczowego o stężeniu 1 mg/100 cm³.

4. 10,3% roztwór Na₂CO₃.

5. Odczynnik fosforowolframowy (4% Na₂WO₄ x 2 H₂O w 3% roztworze H₃PO₄).

a) Odbiałczanie surowicy

Wykonanie doświadczenia

Do probówki odmierzyć 8 cm³ wody i 1 cm³ surowicy. Dodać 0,5 cm³ 10% roztworu wolframianu sodu, a następnie 0,5 cm³ 0,3 mol/dm³ roztworu H₂SO₄ i dokładnie wymieszać. Odstawić na 30 minut, a następnie odwirować (15 min, 4000 obr./min), do dalszych oznaczeń pobrać płyn znad osadu.

b) Oznaczenie ilościowe kwasu moczowego

Wykonanie doświadczenia

1. Przygotować trzy probówki.

2. Do pierwszej odmierzyć 3 cm³ płynu znad osadu po odbiałczeniu surowicy (próba badana),

3. Do drugiej 3 cm³ roztworu wzorcowego kwasu moczowego (próba wzorcowa),

4. Do trzeciej 3 cm³ wody (próba ślepa).

5. Do wszystkich probówek dodać po 0.5 cm³ 10,3% roztworu węglanu sodu i wymieszać.

6. Następnie odmierzyć po 0.15 cm³ odczynnika fosforowolframowego, dokładnie wymieszać, odstawić na 5 minut. Odczytać absorbancję przy 610 nm wobec próby ślepej.

Obliczenia:

Współczynnik 10 wynika z faktu, że surowica w trakcie doświadczenia została dziesięć razy rozcieńczona.

2. Oznaczanie mocznika w surowicy krwi metodą ureazową

Zasada metody

Mocznik ulega hydrolizie w reakcji katalizowanej przez ureazę (enzym pochodzenia roślinnego lub bakteryjnego). Powstałe jony amonowe reagują z odczynnikiem Nesslera i tworzy się barwny produkt.

Odczynniki

1. Roztwór ureazy z ziaren soi w buforze Tris-HCl o pH 7,4.

2. 10% roztwór ZnSO₄.

3. 0,5 mol/dm³ roztwór NaOH.

4. Wzorzec do oznaczania mocznika (roztwór NH₄Cl o stężeniu 1 mg N/100 cm³).

5. Odczynnik Nesslera (zasadowy roztwór K₂[HgJ₄]).

Wykonanie doświadczenia

1. Do probówki wirówkowej odmierzyć 1 cm³ wody i 0,2 cm³ surowicy.

2. Następnie dodać 2 cm³ roztworu ureazy w buforze Tris-HCl, pH 7,4.

3. Probówkę zakryć parafilmem, wstawić do łaźni wodnej o temp. 37⁰ C i inkubować 20 minut.

4. Po inkubacji dodać 0,5 cm³ 10% roztworu ZnSO₄ i 0,3 cm³ 0,5 mol/dm³ roztworu NaOH w celu wytrącenia białek.

5. Zawartość probówki dokładnie wymieszać i odwirować (5 min, 3000 obr./min).

6. Płyn znad osadu zdenaturowanych białek zlać do suchej probówki.

7. Przygotować trzy probówki.

8. Do jednej odmierzyć 2 cm³ płynu nadosadowego i 5 cm³ wody (próba badana).

9. Do drugiej dodać 1 cm³ roztworu wzorcowego i 6 cm³ wody (próba wzorcowa).

10. Do trzeciej 7 cm³ wody (próba ślepa).

11. Zawartość probówek wymieszać.

12. Do wszystkich trzech probówek dodać po 1 cm³ odczynnika Nesslera, wymieszać.

13. Absorbancję odczytać po 5 minutach, przy długości fali 470 nm, wobec próby ślepej.

Obliczenia

1 mg azotu odpowiada 2,14 mg mocznika (60:28, 60 - względna masa cząsteczkowa mocznika, 28 - względna masa cząsteczkowa azotu), współczynnik 10 wynika z rozcieńczenia surowicy - w końcowej objętości znajduje się 0,1 cm³ surowicy, a 1 cm³ wzorca.

3. Oznaczanie kreatyniny w surowicy krwi

Zasada metody

Kreatynina z kwasem pikrynowym tworzy kompleks o zabarwieniu czerwonym. Reakcja ta jest mało swoista i w zależności od warunków (temperatura, czas inkubacji, pH środowiska) intensywność zabarwienia może zmieniać się nieproporcjonalnie. Rzeczywista zawartość kreatyniny w osoczu stanowi zwykle około 80% wartości oznaczanej tą metodą. (Stosowane są również metody opierające się na oznaczeniach enzymatycznych).

Odczynniki

1. 10% roztwór Na₂WO₄.

2. 0,3 mol/dm³ roztwór H₂SO_4,

3. 1 mol/dm³ roztwór NaOH.

4. 1,5% roztwór kwasu pikrynowego.

5. Wzorcowy roztwór kreatyniny o stężeniu 4 mg/ 100 cm³.

Wykonanie doświadczenia

a) Odbiałczanie surowicy

Do probówki wirówkowej pobrać 3 cm³ surowicy, dodać 1,5 cm³ 10% roztworu Na₂WO₄ i 1,5 cm³ 0,3 mol/dm³ roztworu H₂SO₄ celem zdenaturowania białek. Dokładnie wymieszać, odstawić na 30 minut, a następnie odwirować (15 min, 4000 obr./min), Płyn znad osadu zlać do suchej probówki.

b) Wykonanie oznaczenia ilościowego

Do czterech ponumerowanych probówek dodać:

1. 2 cm³ płynu znad osadu.

2. 1 cm³ roztworu zadania i 1 cm³ wody (indywidualne dla każdego studenta).

3. 1 cm³ wzorca i 1 cm³ wody (próba wzorcowa).

4. 2 cm³ wody (próba ślepa).

Nastepnie do wszystkich probówek dodać 1 cm³ 1,5% roztworu kwasu pikrynowego i 1 cm³ 1 mol/dm³ roztworu NaOH. Wymieszać, odstawić na 15 minut i zmierzyć absorbancję wobec próby ślepej przy długości fali 520 nm.

Obliczenia

ĆWICZENIE 3 - 22.03.2011

GLIKOGEN

ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA

1. Struktura glikogenu.

2. Synteza i rozpad glikogenu (reakcje wzorami i enzymy). Hormony

regulujące te procesy.

3. Rola glikogenu wątrobowego i mięśniowego.

4. Metody izolowania i oznaczania procentowej zawartości glikogenu w

wątrobie.

WPROWADZENIE

Glikogen jest zapasowym materiałem energetycznym zwierząt i człowieka. Jest to rozgałęziony homoglikan, zbudowany z jednostek α,D-glukopiranozowych, które są połączone dwoma typami wiązań glikozydowych: α-1,4 i występującym średnio co dziewięć reszt glukozowych wiązaniem α-1,6.

Glikogen jest magazynowany głównie w wątrobie i mięśniach. Ilość glikogenu w wątrobie dochodzi do 6-8% masy tego narządu, natomiast w mięśniach jego zawartość może wynosić 0,7%. Jednak mięśnie, z powodu dużej masy, zawierają 3-4-krotnie większy zapas glikogenu niż wątroba. Rezerwa glukozy znajdująca się w glikogenie wątrobowym służy do utrzymywania odpowiedniego stężenia tego związku we krwi w przerwach między posiłkami. Prawidłowe stężenie glukozy we krwi waha się niewielkich granicach i wynosi 3,9-6,1 mmola/dm³ (70-110 mg/100 cm³). Zapas glikogenu zgromadzony w wątrobie wystarcza na uzupełnianie stężenia glukozy przez 12-16 godzin.

Utrzymywanie stałego stężenia glukozy we krwi jest niezwykle istotne dla organizmu. Glukoza stanowi podstawowe źródło energii dla większości tkanek. Ciągłe dostarczanie glukozy jest konieczne do sprawnego funkcjonowania układu nerwowego i erytrocytów, dla których glukoza jest jedynym materiałem energetycznym. Neurony nie katabolizują kwasów tłuszczowych i przy normalnej diecie glukoza jest głównym źródłem energii potrzebnej do podtrzymania procesów życiowych tkanki nerwowej. Już poniżej stężenia 70 mg glukozy na 100 cm³ pojawiają się pierwsze objawy hipoglikemii jak np.: senność, drażliwość, bóle głowy i poczucie głodu. Przy bardzo niskim stężeniu glukozy we krwi występuje zaburzenie czynności mózgu, które może doprowadzić do śpiączki a nawet zgonu.

W stanach przedłużonego głodzenia lub przy braku węglowodanów w pożywieniu większość energii niezbędnej dla życia neuronów pochodzi z katabolizmu tzw. ciał ketonowych - acetooctanu i 3-hydroksymaślanu, których synteza nasila się w tych warunkach. Związki te są także metabolizowane przez inne tkanki z wyłączeniem wątroby i krwinek czerwonych. Jednak podczas głodzenia stężenie glukozy nie powinno spadać znacznie poniżej dolnych granic normy. Niezbędna ilość glukozy wytwarzana jest wtedy na drodze glukoneogenezy - syntezy glukozy z substancji niewęglowodanowych.

Glikogen zmagazynowany w mięśniach nie służy utrzymywaniu stałego stężenia glukozy we krwi, a jedynie dostarcza energii w trakcie przedłużonego skurczu mięśnia. Po 12-18 godzinach głodzenia wątroba zostaje niemal zupełnie pozbawiona glikogenu, natomiast zapas glikogenu w mięśniach zmniejsza się po długotrwałym, intensywnym wysiłku.

Syntezę glikogenu katalizują dwa enzymy z klasy transferaz. Syntaza glikogenowa, która tworzy wiązania α-1,4-glikozydowe i enzym rozgałęziający (amylo[α-1→4]→[α-1→6]-transglukozydaza), który syntetyzuje wiązania α-1,6-glikozydowe. Syntaza glikogenowa może jedynie wydłużać już istniejący łańcuch. Do rozpoczęcia reakcji potrzebny jest inicjator, białko - glikogenina. Dodatkowy enzym, glukozylotransferaza, przyłącza kolejno do grupy -OH specyficznej reszty seryny w tym białku kilka reszt glukozy, łącząc je wiązaniami α-1,4- glikozydowymi. Właściwa reakcja katalizowana jest przez syntazę glikogenową. Substratem do syntezy glikogenu jest UDP-glukoza (Rys. 1).

Gdy łańcuch zostanie przedłużony, do co najmniej 11 reszt glukozowych, wówczas enzym rozgałęziający przenosi część łańcucha z jednego rozgałęzienia na inne, tworząc wiązanie α-1,6 glikozydowe i ustanawiając w ten sposób nowy punkt rozgałęzienia. Powstaje cząsteczka bardzo rozgałęziona. Zwiększenie liczby nieredukujących zakończeń łańcuchów glukozowych umożliwia przyśpieszenie zarówno syntezy glikogenu, jak i jego rozkładu na drodze fosforolizy.

Głównym enzymem przeprowadzającym rozpad glikogenu (glikogenolizę) jest fosforylaza glikogenowa, należąca do klasy transferaz. Enzym ten przy udziale ortofosforanu prowadzi fosforolizę glikogenu od nieredukujących zakończeń cząsteczki tworząc glukozo-1-fosforan.

glikogen_{(n reszt glukozy)} + P_i → glikogen_{(n-1 reszt glukozy)} + glukozo-1-fosforan

Fosforylaza glikogenowa rozłącza tylko wiązania α-1,4-glikozydowe, degradując stopniowo łańcuchy glukozowe, aż do miejsc oddalonych o cztery reszty glukozowe od punktu rozgałęzienia, stworzonego za pomocą wiązania α-1,6. Następnie enzym odgałęziający, α-[1→4]→[1→4]-transferaza glukanowa przenosi fragment trzech reszt glukozy na łańcuch główny. W ten sposób odsłania się miejsce odgałęzienia. Rozkład wiązań α-1,6 katalizuje hydrolaza - amylo-α-[1→6]-glukozydaza, która uwalnia wolną glukozę.

Glukozo-1-fosforan, będący produktem działania fosforylazy, zostaje przekształcony w glukozo-6-fosforan za pomocą fosfoglukomutazy.

Dalsze losy glukozo-6-fosforanu zależą od rodzaju tkanki. W wątrobie występuje enzym fosfataza glukozo-6-fosforanowa, przekształcająca glukozo-6-fosforan w glukozę. Tylko wolna glukoza może być przenoszona przez błonę komórkową; dokonuje tego znajdujący się w błonie komórkowej układ transportujący. Rozkład glikogenu wątrobowego powoduje wzrost stężenia glukozy we krwi.

W mięśniach nie występuje fosfataza glukozo-6-fosforanowej i brak tego enzymu uniemożliwia przekształcenie glukozo-6-fosforanu do wolnej glukozy. Uwolniony glukozo-6-fosforan służy jako materiał energetyczny wykorzystywany podczas skurczu mięśnia.

Rozkład i synteza glikogenu zależy głównie od wpływu hormonów. Kontrolę nad tworzeniem i rozkładem glikogenu prowadzą przede wszystkim dwa hormony- glukagon i insulina. Glikogenolizę w mięśniach i wątrobie może także wywołać hormon stresu - adrenalina.

CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA

1. Izolowanie glikogenu z wątroby zwierzęcej.

Zasada metody

Wiązania glikozydowe występujące w glikogenie są oporne na działanie hydrolityczne jonów OHˉ w podwyższonej temperaturze. W wysokiej temperaturze w środowisku zasadowym wiązania peptydowe białek, estrowe lipidów i fosfodiestrowe kwasów rybonukleinowych ulegają hydrolizie. W wyniku ogrzewania tkanki w roztworze KOH otrzymuje się roztwór glikogenu zanieczyszczony innymi wielocukrami, fragmentami zdenaturowanego DNA oraz związkami małocząsteczkowymi, które znajdowały się w tkance lub powstały na skutek hydrolizy. Dodanie alkoholu etylowego powoduje wytrącenie glikogenu, który jest w niewielkim stopniu zanieczyszczony zdenaturowanym DNA i wysokocząsteczkowymi heteroglikanami, które również strącają się w tych warunkach.

Odczynniki

1. 30% roztwór KOH.

2. 96% etanol.

3. NaCl in subst.

Wykonanie doświadczenia

1. 1 g wątroby umieścić w probówce wirówkowej zawierającej 2,5 cm³ 30%

roztworu KOH.

2. Probówkę zakryć korkiem z chłodniczką zwrotną i wstawić na 30 minut do

wrzącej łaźni wodnej, wstrząsać, co kilka minut.

3. Po całkowitym rozpuszczeniu tkanki, probówkę wyjąć z łaźni, oziębić i dodać

4,5 cm³ 96% etanolu, dobrze wymieszać.

4. Probówkę ponownie zakryć korkiem z chłodniczką zwrotną i wstawić do gorącej

łaźni wodnej (uwaga - nie odparowywać alkoholu, wyjąć natychmiast

po osiągnięciu wrzenia).

5. Po ostudzeniu wytrącony osad glikogenu odwirować (5 min, 3000 obr./min).

6. Płyn znad osadu wylać, osad rozpuścić w 3 cm³ wody (mieszać bagietką).

7. Wytrącić glikogen przez dodanie 6 cm³ 96% etanolu (zawartość probówki dobrze

wymieszać bagietką). Jeśli osad nie ulegnie wytrąceniu należy dodać kilka krysz-

tałków NaCl, zamieszać i wstawić na chwilę do ciepłej łaźni wodnej.

8. Wytrącony glikogen odwirować jak poprzednio (5 min, 3000 obr/min)

9. Płyn znad osadu ostrożnie wylać.

10. Osad osuszyć przez postawienie probówki do góry dnem na bibule, a następnie

rozpuścić w 10 cm³ wody destylowanej. Powstały opalizujący roztwór używać do

dalszych oznaczeń.

2. Wyznaczanie krzywej wzorcowej do oznaczania glukozy.

Zasada metody

Glukoza posiada właściwości redukujące i w środowisku zasadowym redukuje odczynnik dinitrosalicylowy, sama zaś utlenia się do kwasu glukonowego. Odczynnik dinitrosalicylowy po redukcji zmienia barwę z żółtej na pomarańczową o maksimum absorbancji 550 nm. Powstałe zabarwienie roztworu jest proporcjonalne do ilości glukozy w próbce.

Odczynniki

1. 0,01 mol/ dm³ roztwór glukozy.

2. 0,05 mol/dm³ bufor fosforanowy pH 6,9.

3. Odczynnik dinitrosalicylowy (1% kwas 3,5-dinitrosalicylosalicylowy, 1,6% NaOH, 30% winian sodowo-potasowy).

Wykonanie doświadczenia

Do 7 probówek skalowanych na 10 cm³ dodać kolejno odczynniki według tabeli 1:

Tabela 1

	1	2	3	4	5	6	7
	Ilości dodawanych odczynników w cm^3
H2O	1,8	1,6	1,4	1,2	1,0	0,8	2,0
. 0,01 mol/ dm^3roztwór glukozy	0,2	0,4	0,6	0,8	1,0	1,2	-
Bufor fosforanowy	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Odczynnik dinitro-salicylowy	2,0	2,0	2,0	2,0	2,0	2,0	2,0

1. Po dodaniu odczynników zawartość probówek dobrze wymieszać

2. Wstawić na 10 minut do wrzącej łaźni wodnej.

3. Po wyjęciu z łaźni probówki oziębić.

4. Uzupełnić wodą do 10 cm³, wymieszać.

5. Dokonać pomiarów absorbancji przy długości fali 550 nm, wobec próby ślepej

probówka nr 7.

6. Sporządzić wykres zależności absorbancji od ilości μmoli glukozy w próbie.

3. Hydroliza kwaśna glikogenu. Oznaczanie zawartości procentowej glikogenu w wątrobie na podstawie ilości uwolnionej glukozy.

Zasada metody

Glikogen ulega hydrolizie w 100⁰ C w środowisku silnie kwaśnym, gdyż w tych warunkach wiązania glikozydowe ulegają rozpadowi. Jeśli hydroliza będzie prowadzona przez odpowiednio długi okres czasu to cała ilość glikogenu ulegnie rozkładowi do wolnej glukozy. Na podstawie ilości uwolnionej glukozy można wyliczyć zawartość procentową glikogenu w wątrobie.

Odczynniki

1. 2 mol/dm³ roztwór HCl.

2. 1,2 mol/dm³ roztwór NaOH .

3. Odczynnik dinitrosalicylowy (1% kwas 3,5-dinitrosalicylosalicylowy,

1,6% NaOH, 30% winian sodowo-potasowy).

4. 0,05 mol/dm³ bufor fosforanowy pH 6,9.

Wykonanie doświadczenia

1. Otrzymany w doświadczeniu 1 roztwór glikogenu rozcieńczyć dwukrotnie:

pobrać 5 cm³, dodać 5 cm³ wody i dokładnie wymieszać.

2. Przygotować trzy probówki.

3. Do probówek 1 i 2 odmierzyć po 0,4 cm³ rozcieńczonego dwa razy roztworu

glikogenu, do probówki nr 3 dodać 0,4 cm³ wody (próba ślepa).

4. Do wszystkich probówek dodać po 0,6 cm³ 2 mol/dm³ roztworu HCl i zanotować

czas (t₀).

5. Zawartość probówki nr 1 i 3 natychmiast zobojętnić przez dodanie 1 cm³

1,2 mol/dm³ roztworu NaOH.

6. Probówkę nr 2 wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 40 minut

7. Probówkę nr 2 wyjąć z łaźni po 40 minutach, następnie zobojętnić przez dodanie 1 cm³

1,2 mol/dm³ roztworu NaOH.

8. Do wszystkich probówek dodać po 0,5 cm³ 0,05 mol/dm³ buforu fosforanowego

pH 6,9 w celu wyrównania we wszystkich probówkach wartości pH.

9. Następnie do wszystkich probówek dodać 2 cm³ odczynnika dinitrosalicylowego,

zawartość probówek dobrze wymieszać i wstawić do wrzącej łaźni wodnej na

10 minut.

10. Probówki wyjąć, ochłodzić i uzupełnić do 10 cm³ wodą destylowaną, ponownie

wymieszać.

11. Zmierzyć absorbancję przy długości fali 550 nm, wobec próby ślepej (probówka

nr 7 z doświadczenia nr 2).

Z krzywej wzorcowej do oznaczania glukozy (doświadczenie nr 2), odczytać ilość μmoli glukozy.

Obliczyć ilość μg glukozy uwolnionej podczas hydrolizy próbki glikogenu i obliczyć zawartość procentową glikogenu w wątrobie. Należy uwzględnić wszystkie stosowane rozcieńczenia preparatu glikogenu uzyskanego z jednego grama tkanki i ilość oznaczonej glukozy pomnożyć przez 0,9, aby uwzględnić fakt, że ze 162 g glikogenu powstaje 180 g glukozy (162:180).

4. Zadanie ilościowe - oznaczanie glukozy (indywidualne dla każdego

studenta)

Wykonanie doświadczenia

Do dwóch probówek dodać po 1 cm³ roztworu zadania dodać 1 cm³ wody, 0,5 cm³ 0,05 mol/dm³ buforu fosforanowego pH 6,9 i 2 cm³ odczynnika dinitrosalicylowego.

Zawartość probówek dokładnie wymieszać i ogrzewać przez 10 minut we wrzącej łaźni wodnej. Po wyjęciu oziębić i uzupełnić wodą do 10 cm³. Zmierzyć absorbancję przy długości fali 550 nm wobec próby ślepej (probówka nr 7 z doświadczenia 2). Z krzywej wzorcowej odczytać ilość μg glukozy w 1 cm³ zadania.

ĆWICZENIE 4 - 12.04.2011

Mocz prawidłowy i patologiczny

Każdy student zobowiązany jest do przyniesienia na zajęcia około 200 cm³ moczu, który posłuży do wykonywania doświadczeń.

ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA

1. Powstawanie moczu i prawidłowe składniki moczu.

2. Wykrywanie prawidłowych i patologicznych składników moczu

WPROWADZENIE

Nerka bierze udział w utrzymywaniu stałej objętości i stałego składu płynów ustrojowych (utrzymywanie homeostazy organizmu). Funkcja ta spełniana jest poprzez wytwarzanie moczu. W ten sposób z organizmu usuwany jest nadmiar wody i związki pochodzące z zewnątrz (np. leki i produkty ich degradacji, substancje toksyczne) które zostały wytworzone w organizmie podczas procesów metabolicznych, jak np. kreatynina, mocznik, kwas moczowy.

Mocz tworzy się w nerce, w nefronach. Nefron jest jednostką czynnościową nerki. U człowieka jest ich około 1 mln. W jego skład wchodzi: 1. kłębek nerkowy (zawierający torebkę Bowmana), 2. kanalik bliższy (proksymalny), 3. pętla Henlego zawierająca ramię zstępujące i ramię wstępujące, 4. kanalik dalszy (dystalny), 5. kanalik zbiorczy. W wyniku ultrafiltracji osocza powstaje mocz pierwotny, który podlega resorpcji zwrotnej i wydzielaniu kanalikowemu (sekrecji kanalikowej) i tworzy się mocz ostateczny.

Szybkość ultrafiltracji zależy od ciśnienia krwi (wzrost ciśnienia krwi powoduje wzrost ultrafiltracji), od ciśnienia koloido-osmotycznego związanego z obecnością w osoczu białek, głównie albumin (zmniejszenie tego ciśnienia prowadzi do wzrostu ultrafiltracji) i od ciśnienia panującego w torebce Bowmana (spadek ciśnienia wewnątrz torebki prowadzi do wzrostu ultrafiltracji). Skuteczne ciśnienie filtracyjne (EFP - ang. effective filtration pressure) = ciśnienie krwi w naczyniach włosowatych kłębuszka (55 mm Hg = 7,3 kPa) - ciśnienie koloido-osmotyczne w naczyniach włosowatych kłębuszka (25 mm Hg = 3,3 kPa) - ciśnienie w torebce Bowmana (15 mm Hg = 2 kPa). Szybkość ultrafiltracji w warunkach prawidłowych wynosi 125 cm³ osocza na minutę. Powstaje w ten sposób mocz pierwotny, który od osocza różni się tylko brakiem białek, które z uwagi na dużą masę cząsteczkową nie mogą przechodzić przez błonę komórkową komórek torebki kłębuszka. Przechodzą przez nią związki, których masa cząsteczkowa nie przekracza 60 000. Podczas przepływu moczu pierwotnego przez kanaliki nerkowe zachodzi wchłanianie zwrotne (resorpcja) wody i rozpuszczonych w niej związków organicznych i jonów. W efekcie tych procesów powstaje mocz ostateczny, w ilości 1,5 dm³ na dobę (1 cm³ na minutę).

W kanalikach proksymalnych zachodzi obligatoryjne (obowiązkowe) zwrotne wchłanianie wody, niepodlegające regulacji hormonalnej, związane z aktywnym wchłanianiem jonów Na⁺. W ten sposób wchłania się 85% wody. Wraz z wodą resorbowane są z moczu pierwotnego do osocza substancje w niej rozpuszczone. Niektóre z nich są wchłaniane aktywnie i potrzebna do tego procesu energia pochodzi z rozpadu ATP. Substancje te są wchłaniane w kanaliku proksymalnym całkowicie lub prawie całkowicie i w moczu w warunkach prawidłowych nie występują lub ich ilość jest bardzo mała. Związki te noszą nazwę wysokoprogowych i należą do nich: glukoza, aminokwasy, kreatyna, Na⁺, HCO₃^-. Pojawiają się one w moczu dopiero wtedy, gdy ich stężenie w osoczu przekroczy próg nerkowy, tzn. będzie wyższe od zdolności kanalików nerkowych do ich wchłonięcia aktywnego. Inną grupą są związki niskoprogowe, które są wchłaniane biernie, bez nakładu energii, w małych ilościach i są one zawsze wydalane z moczem. Należą do nich np. mocznik i kwas moczowy. Natomiast związki nazywane bezprogowymi nie ulegają resorpcji, przykładem takiego związku jest kreatynina.

W pętli Henlego odbywa się dalsze zagęszczanie moczu. Na skutek wchłaniania wody w ramieniu zstępującym rośnie osmolarność moczu pierwotnego (do 1200 mosmoli), a w ramieniu wstępującym, które jest nieprzepuszczalne dla wody osmolarność maleje, gdyż zachodzi resorpcja jonów Na⁺ i Cl^-. Tak więc mocz opuszczający pętlę jest izotoniczny w stosunku do osocza (osmolarność = 300 mosmoli), pomimo tego, że wiele substancji ulega w nim zagęszczeniu.

W kanalikach dystalnych i zbiorczych resorpcja zwrotna wody i jonów Na⁺ podlega regulacji hormonalnej przez wazopresynę i aldosteron. Wazopresyna jest hormonem peptydowym, wydzielanym przez tylny płat przysadki wtedy, gdy wzrasta osmolarność płynów ustrojowych. Nazywana jest hormonem antydiuretycznym (ADH), gdyż po jej wydzieleniu następuje wchłanianie zwrotne wody - fakultatywne, z wtórnym wchłanianiem jonów Na⁺. Drugim hormonem jest aldosteron, hormon steroidowy, należący do mineralokortykoidów, syntetyzowany w korze nadnerczy, którego wydzielenie powoduje wchłanianie zwrotne Na⁺, co pociąga za sobą wtórne wchłanianie wody. Oba te hormony biorą udział w regulowaniu gospodarki wodno-elektrolitowej.

Powstający w kanaliku zbiorczym mocz ostateczny jest hipertoniczny w stosunku do osocza. Jego osmolarność jest cztery razy wyższa niż osocza i nie może przekroczyć 1200 mosmoli. Tak więc wydalany mocz w porównaniu do osocza jest czterokrotnie zagęszczony, natomiast poszczególne związki wydalane w moczu są zagęszczane znacznie bardziej, np. kwas moczowy około 15 razy, mocznik około 80 razy, kreatynina 100 razy, jony NH₄⁺ 400 razy.

Jeżeli w moczu wydalane są związki, które w warunkach prawidłowych są resorbowane całkowicie (np. glukoza), to wiąże się to ze zwiększeniem ilości wytwarzanego moczu. To zjawisko nosi nazwę diurezy osmotycznej.

Mocz wydalany w ciągu doby zawiera substancje nieorganiczne, których ilość waha się od 20 do 30 g i są to jony: sodowy, potasowy, chlorkowy, siarczanowy, fosforanowe. Wydalane są również z moczem substancje organiczne, w ilości 30-40 g na dobę. Głównie są to produkty przemiany azotowej i należą do nich: mocznik, kwas moczowy, kreatynina. amoniak (NH₄⁺).

CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA

1. Oznaczanie gęstości moczu

Ciężar właściwy (gęstość) moczu wynosi od 1,001 do 1,035 g/cm³ i zależy od stanu uwodnienia ustroju. Gęstość moczu zależy również od zawartości związków stałych. Średnio na dobę organizm człowieka wydala ich 55-70 g. Jeżeli gęstość pomnoży się przez 1000 i dwie ostatnie cyfry z uzyskanej liczby pomnoży się przez współczynnik Haesera równy 2,33, to uzyska się przybliżoną zawartość związków stałych wyrażoną w gramach na dm³, np. 1,015 x 1000 = 1015; 15 x 2,33 = 34,95 g/dm³ związków stałych.

Materiał

1. Mocz

Wykonanie doświadczenia

Do cylindra o pojemności 250 cm³ wlać około 150-200 cm³ moczu i zanurzyć w moczu urometr tak, aby pływał swobodnie, nie dotykając ścianek cylindra. Gęstość odczytać z podziałki, patrząc na wysokości poziomu menisku cieczy. Przy temperaturze pomiaru wyższej niż 15⁰ C należy do odczytanej gęstości dodać 0,001 na każde 3^o, przy temperaturze pomiaru niższej niż 15⁰ C należy tę poprawkę odejmować.

2. Oznaczanie pH moczu

Odczyn moczu jest najczęściej lekko kwaśny. Jego pH może się wahać w granicach 5,5 - 6,5 i zależy od stosowanej diety. Mocz może mieć odczyn zasadowy szczególnie przy diecie bogatej w jarzyny, owoce i produkty mleczne. Odczyn bardziej kwaśny ma mocz osób stosujących dietę wysokobiałkową.

Materiał i odczynniki

1. Paski wskaźnikowe pH

2. Mocz

Wykonanie doświadczenia

Na pasek wskaźnikowy nanieść kilka kropli moczu i porównać uzyskane zabarwienie ze skalą barw.

Składniki moczu prawidłowego

3. Wykrywanie jonów NH₄⁺

W komórkach kanalików powstaje NH₃, głównie w reakcji hydrolizy glutaminy (deamidacji) katalizowanej przez enzym glutaminazę:

glutamina + H₂O Ⴎ glutaminian + NH₃

Powstaje on również w reakcji deaminacji oksydacyjnej glutaminianu katalizowanej przez dehydrogenazę glutaminianową:

glutaminian + NAD⁺ + H₂O Ⴋ ၡ-ketoglutaran + NADH+H⁺ + NH₃

Amoniak dyfunduje do płynu kanalikowego i tam łączy się z jonem H⁺ tworząc NH₄⁺. Jon wodorowy powstaje w reakcji dysocjacji kwasu węglowego utworzonego w reakcji katalizowanej przez anhydrazę węglanową:

H₂O + CO₂ Ⴋ H₂CO₃ Ⴋ HCO₃^- + H⁺

Ilość wydalanych z moczem jonów amonowych jest zmienna, gdyż ich tworzenie związane jest z utrzymywaniem przez nerkę równowagi kwasowo-zasadowej. W przypadku zakwaszenia ustroju ilość produkowanego jonu amonowego wzrasta, gdyż w ten sposób nerka usuwa jony H₃O⁺, wydalając je z jonem NH₄⁺, a nie z jonem Na⁺.

Zasada metody

Polega na stwierdzeniu obecności amoniaku, który tworzy się z jonów NH₄⁺:

CO₃² + H₂O Ⴋ OH^- + HCO₃^-

NH₄⁺ + OH^- Ⴋ NH₃ + H₂O

Materiał i odczynniki

1. 1% roztwór fenoloftaleiny w 96% etanolu

2. 5% roztwór Na₂CO₃

3. Mocz

Wykonanie doświadczenia

1. Do kilku cm³ świeżego moczu dodać kilka kropli roztworu fenoloftaleiny oraz 10-15 kropli 5% roztworu Na₂CO₃, aż do uzyskania malinowego zabarwienia

2. Łagodnie ogrzewać.

3. Wydziela się amoniak, którego obecność wykrywa się trzymanym u wylotu probówki papierkiem wskaźnikowym lub za pomocą powonienienia.

4. Wydzielanie się amoniaku pod wpływem węglanu sodu świadczy o obecności jonów NH₄⁺ w moczu. (w moczu prawidłowym świeżo zebranym amoniak nie może pochodzić z rozkładu mocznika, gdyż nie ma w nim bakterii, a więc nie ma ureazy - enzymu bakteryjnego hydrolizującego mocznik na amoniak i dwutlenek węgla).

Równolegle wykonać próbę z indywidualnym zadaniem na zaliczenie.

4. Wykrywanie jonów Cl^-

Jon Cl^- jest głównym anionem osocza. Wydalany jest w ilości od 6 do 10 g na dobę. Ilość wydalanych chlorków jest ściśle związana z wydalaniem wody. Im więcej wody organizm usuwa, tym więcej wydala chlorków.

Zasada metody

Jony Cl^- tworzą z jonami Ag⁺ biały, serowaty osad AgCl, nierozpuszczalny w HNO₃.

Cl^- + Ag⁺ Ⴎ AgClႯ

Materiał i odczynniki

1. Stężony HNO₃

2. 5% roztwór AgNO₃

3. Mocz

Wykonanie doświadczenia

Do 2 cm³ moczu dodać 0,5 cm³ stężonego roztworu kwasu azotowego, a następnie kilka kropli roztworu azotanu srebra.

5. Wykrywanie jonów SO₄^2-

W ciągu doby wydalanych zostaje od 2 do 3 g jonów siarczanowych. Powstają one głównie podczas przemiany (utleniania) cysteiny, aminokwasu zawierającego grupę -SH i w całości są wydalane z moczem, nie ulegają resorpcji zwrotnej w kanalikach nerkowych.

Zasada metody

Jony SO₄^2- tworzą z jonami Ba²⁺ biały, drobnokrystaliczny osad BaSO₄.

SO₄^2- + Ba²⁺ Ⴎ BaSO₄Ⴏ

Materiał i odczynniki

1. 10% roztwór BaCl₂

2. Mocz

Wykonanie doświadczenia

Do kilku cm³ moczu dodać 1-2 cm³ roztworu chlorku barowego.

6. Wykrywanie jonów fosforanowych

Jony fosforanowe (HPO₄^2- i H₂PO₄^-) powstają podczas hydrolizy wiązań fosfoestrowych znajdujących się np. w monofosforanach nukleozydów, fosfocukrach lub wiązań bezwodnikowych znajdujących się np. w ATP. Na dobę wydalanych jest tych jonów od 1g do 1,5 g.

Zasada metody

Jony fosforanowe tworzą z molibdenianem amonu jasnożółty, drobnokrystaliczny osad fosforomolibdenianu amonu. Przy małej ilości jonów fosforanowych zamiast osadu może pojawić się barwa żółta. Czasami barwa może być niebieska lub zielona, gdyż powstały fosforomolibdenian ulega redukcji do błękitu molibdenowego przez zawarte w moczu substancje redukujące.

Materiał i odczynniki

1. Stężony HNO₃

2. 5% roztwór molibdenianu amonu

3. Mocz

Wykonanie doświadczenia

1. Do 1,5 cm³ moczu dodać 0,5 cm³ stężonego kwasu azotowego, a następnie 1,5 cm³ roztworu molibdenianu amonu.

2. Wstawić na kilka minut do wrzącej łaźni wodnej.

7. Wykrywanie mocznika (reakcja z podbrominem)

Mocznik powstaje w wątrobie, w ilości 20-40 g na dobę, w kilkuetapowym procesie, nazywanym cyklem mocznikowym. W postaci mocznika usuwany jest toksyczny dla organizmu amoniak, którego głównym źródłem są grupy -NH₂ znajdujące się w aminokwasach. Z moczu pierwotnego mocznik resorbowany jest biernie.

Zasada metody

Pod wpływem podbrominu sodowego następuje utlenienie i rozkład mocznika z wytworzeniam CO₂, H₂O i azotu (Rys. 1).

Materiał i odczynniki

1. Roztwór podbrominu sodu (10% Br₂ w 40% roztworze NaOH)

2. Mocz

Wykonanie doświadczenia

1. Do 1 cm³ moczu dodać kilka kropel roztworu podbrominu sodowego.

2. Zawartość probówki wymieszać.

3. Pojawienie się pęcherzyków gazu świadczy o obecności mocznika.

4. Gazem tym będzie tylko azot, bo CO₂ w środowisku zasadowym przekształci się w węglany i wodorowęglany.

Równolegle wykonać próbę z indywidualnym zadaniem na zaliczenie.

8. Wykrywanie kwasu moczowego

Kwas moczowy jest produktem katabolizmu nukleotydów purynowych, powstaje z przekształcenia guaniny i adeniny. Jest on częściowo wchłaniany aktywnie w kanalikach proksymalnych. Na dobę wydalany jest w ilości 500-800 mg w postaci wolnej lub jako moczany sodu lub potasu.

Zasada metody

Pod wpływem kwasu moczowego kwas fosforowolframowy w środowisku zasadowym (Na₂CO₃) ulega redukcji do tlenków wolframu o niższym stopniu utlenienia, mających niebieskie zabarwienie. Za reakcję dodatnią uważa się również pojawienię się intensywnego, zielonego zabarwienia, powstającego na skutek nakładania się na barwę niebieską, żółtej barwy pochodzącej od innych składników moczu.

Materiał i odczynniki

1. Odczynnik fosforowolframowy (4% Na₂WO₄x 2H₂O w 3% roztworze H₃PO₄)

2. 10% roztwór Na₂CO₃

3. Mocz

Wykonanie doświadczenia

Do 1 cm³ moczu dodać kilka kropli odczynnika fosforowolframowego i 1 cm³ 10% roztworu Na₂CO₃.

Równolegle wykonać próbę z indywidualnym zadaniem na zaliczenie.

9. Wykrywanie urobilinogenu - reakcja Ehrlicha

Urobilinogen powstaje w przewodzie pokarmowym z bilirubiny wątrobowej w wyniku działania enzymów bakterii jelitowych, skąd częściowo zostaje wchłonięty do krwioobiegu i utleniony w wątrobie do bilirubiny, która po sprzęgnięciu wydalana jest ponownie do przewodu pokarmowego. Niewielka ilość urobilinogenu jest wydalana z moczem, jest to fizjologiczna urobilinogenuria. Podczas niewydolności wątroby maleje jej zdolność do utleniania urobilinogenu i zwiększa się wtedy jego ilość wydalana z moczem. Przyczyną wydalania zwiększonej ilości urobilinogenu może być również wzmożony rozpad krwinek czerwonych np. przy żółtaczce hemolitycznej. Natomiast przy zaczopowaniu przewodów żółciowych ilość wydalanego z moczem urobilinogenu znacznie się obniża.

Zasada metody

Urobilinogen z odczynnikiem Ehrlicha, w obecności HCl, tworzy czerwony kompleks.

Materiał i odczynniki

1. Odczynnik Ehrlicha (2% roztwór aldehydu p-N,N-dimetyloaminobenzoesowego w 1mol/dm³ roztworze HCl)

2. Mocz

Wykonanie doświadczenia

Do 4 cm³ moczu dodać 0,5 cm³ odczynnika Ehrlicha. Zawartość probówki ogrzać. Przy zwiększonej ilości urobilinogenu mocz zabarwia się na czerwono już na zimno.

10. Wykrywanie kreatyniny metodą Jaffego

Kreatynina powstaje w ustroju z kreatyny, przez jej dehydratację. Kreatyna w postaci fosfokreatyny jest fosfagenem mięśniowym pełniącym rolę magazynu energii. Kreatynina nie ulega wchłanianiu zwrotnemu w kanalikach nerkowych. Na dobę wydala się jej od 1 g do 1,8 g, w zależności od wielkości masy mięśniowej.

Zasada metody

Kreatynina w środowisku zasadowym tworzy z kwasem pikrynowym czerwony kompleks.

Materiał i odczynniki

1. 1,5% roztwór kwasu pikrynowego

2. 2 mol/dm³ roztwór NaOH

3. Mocz

Wykonanie doświadczenia

Do 1 cm³ moczu rozcieńczonego dwa razy wodą destylowaną, dodać 1 cm³ nasyconego roztworu kwasu pikrynowego, a następnie zalkalizować kilkoma kroplami 2 mol/dm³ roztworu NaOH.

Równolegle wykonać próbę z indywidualnym zadaniem na zaliczenie.

11. Wykrywanie kreatyniny metodą Weyla

Materiał i odczynniki

1. 10% roztwór nitroprusydku sodu

2. 2 mol/dm³ roztwór NaOH

3. 30% kwas octowy

4. Mocz.

Wykonanie doświadczenia

Do 2 cm³ moczu dodać 3-4 krople roztworu nitroprusydku sodu oraz 1 cm³ 2 mol/dm³ roztworu NaOH. Pojawia się czerwone zabarwienie, które po pewnym czasie blednie, a znika natychmiast po zakwaszeniu 30% kwasem octowym.

Równolegle wykonać próbę z indywidualnym zadaniem na zaliczenie.

Składniki moczu patologicznego

W stanach patologicznych z moczem wydalane są substancje, które w warunkach prawidłowych praktycznie nie pojawiają się w moczu lub są wydalane w bardzo małych ilościach i taki mocz określamy jako patologiczny. Patologicznymi składnikami moczu są: białko, ciała ketonowe, glukoza, bilirubina, kwasy żółciowe, hemoglobina, zwiększona ilość urobilinogenu. Przyczyny wydalania substancji patologicznych mogą być różne; związane nie tylko z zaburzeniami czynności nerek, ale także ze schorzeniami (zaburzeniami metabolizmu) innych narządów.

12. Wykrywanie ciał ketonowych (acetonu) - reakcja Legala

Ciała ketonowe (Rys. 2) są prawidłowymi produktami metabolizmu, syntetyzowane są w wątrobie z acetyloCoA. Należą do nich acetooctan i ၢ-hydroksymaślan. W warunkach prawidłowych ich stężenie we krwi jest bardzo niewielkie i wynosi od 0,2 do 0,8 mg/100 cm³, gdyż poza wątrobą i erytrocytami są one wykorzystywane jako materiał energetyczny i rozkładane do CO₂ i H₂O. U zdrowego człowieka z moczem wydalane są bardzo małe ilości tych związków i jest ich nie więcej niż 20 mg na dobę. Jest to tak mała ilość, że nie można jej wykryć stosowanymi metodami.

W pewnych warunkach np. w głodzie czy cukrzycy może dochodzić do wzmożonej syntezy tych związków w wątrobie. Ilość wytworzonych wtedy ciał ketonowych przekracza zdolność całkowitego wykorzystywania tych związków przez organizm. Wzrasta stężenie acetooctanu i w wyniku jego spontanicznej dekarboksylacji powstaje aceton. Jest on wydalany z moczem razem z acetooctanem i ၢ-hydroksymaślanem (ketonuria). Jeżeli ilość wytworzonych ciał ketonowych jest tak duża, że nerka nie może ich całkowicie wydalić z moczem, to dochodzi do ketonemii - zwiększenia ich stężenia we krwi, co prowadzi do zaburzenia równowagi kwasowo-zasadowej (kwasicy metabolicznej).

Materiał i odczynniki

1. 30% roztwór NaOH

2. 10% roztwór nitroprusydku sodu

3. 30% CH₃COOH

4. Mocz prawidłowy

5. Mocz patologiczny zawierający aceton

Wykonanie doświadczenia

Reakcję wykonać z moczem prawidłowym i patologicznym

1. 3 cm³ badanego moczu zalkalizować 5 kroplami 30% roztworu NaOH.

2. Dodać 3-5 kropli roztworu nitroprusydku sodu ( powstaje czerwone zabarwienie).

3. Dodać 10-15 kropli 30% kwasu octowego (zabarwienie nie znika, a nawet pogłębia się).

4. Zaobserwować różnice w reakcji z moczem patologicznym

5. Porównać z ćwiczeniem na wykrywanie kreatyniny.

Równolegle wykonać próbę z indywidualnym zadaniem na zaliczenie.

13. Wykrywanie glukozy (reakcja Benedicta)

Glukoza resorbowana jest w kanaliku proksymalnym aktywnie, przy udziale energii z rozpadu ATP i w warunkach prawidłowych nie jest wydalana z moczem. Jest ona substancją wysokoprogową i dopóki jej stężenie we krwi nie przekroczy 180 mg/100 cm³ nerka jest w stanie zresorbować z moczu pierwotnego całą jej ilość. Glukozuria to wydalanie glukozy z moczem, występuje u ludzi chorych na cukrzycę, u których stężenie glukozy przekroczyło próg nerkowy. Chory może wydalać z moczem nawet kilkadziesiąt gramów glukozy na dobę.

Glukoza może pojawić się w moczu również wtedy, kiedy jej stężenie we krwi jest prawidłowe, ale dochodzi do zaburzenia jej wchłaniania zwrotnego w kanalikach proksymalnych, na skutek dysfunkcji nerek.

Zasada metody

Glukoza redukuje Cu²⁺ do Cu⁺ i powstaje nierozpuszczalny, czerwony osad Cu₂O.

Materiał i odczynniki

1. Odczynnik Benedicta (17,3% cytrynian trisodowy, 9% Na₂CO₃, 1,1% CuSO₄)

2. Mocz prawidłowy

3. Mocz patologiczny zawierający glukozę

Wykonanie doświadczenia

Do 2 cm³ odczynnika Benedicta (zawiera Cu²⁺) dodać kilka kropli badanego moczu. Wstawić na kilka minut do wrzącej łaźni wodnej. Próbę wykonać z moczem prawidłowym i patologicznym.

Równolegle wykonać próbę z indywidualnym zadaniem na zaliczenie.

14. Wykrywanie białka

Mocz zdrowego człowieka nie zawiera białka. Podczas ultrafiltracji osocza przez błonę torebki kłębuszka przechodzą tylko związki drobnocząsteczkowe. Dla białek jest ona nieprzepuszczalna. Niekiedy może przechodzić do moczu pierwotnego i pojawiać się w moczu albumina, której masa cząsteczkowa jest niższa niż globulin. Zjawisko to nosi nazwę białkomoczu fizjologicznego (proteinurii fizjologicznej) i jest związane np. z dużym wysiłkiem fizycznym, gwałtownym oziębieniem ciała.

Białko pojawia się w moczu w stanach patologicznych, np. kiedy zwiększa się przepuszczalność kłębków nerkowych w wyniku ich uszkodzenia. Ilość wydalanego wtedy z moczem białka może dochodzić nawet do kilkudziesięciu gramów na dobę.

Zasada metody

W środowisku kwaśnym pod wpływem kwasu sulfosalicylowego białko ulega denaturacji i wytrąceniu.

Materiał i odczynniki

1. 30% roztwór CH₃COOH

2. 20% roztwór kwasu sulfosalicylowego

3. Mocz prawidłowy

4. Mocz patologiczny zawierający białko

Wykonanie doświadczenia

Doświadczenie wykonać z moczem prawidłowym i patologicznym.

1. Do 4 cm³ moczu dodać 1-2 krople 30% roztworu kwasu octowego.

2. W razie wystąpienia zmętnienia roztwór przesączyć.

3. Do klarownego moczu lub przesączu dodać 3-5 kropli 20% roztworu kwasu sulfosalicylowego.

4. Próba jest dodatnia jeżeli roztwór ulega zmętnieniu (może powstać opalescencja) lub wytrąca się osad zdenaturowanego białka.

5. Wynik doświadczenia zależy od ilości białka obecnego w moczu.

Równolegle wykonać próbę z indywidualnym zadaniem na zaliczenie.

15. Wykrywanie śladów krwi

W warunkach prawidłowych hemoglobina, która zostaje uwolniona z erytrocytów do osocza jest wiązana z ၡ₂ globuliną osocza - haptoglobiną i wytworzony kompleks nie przenika przez kłębuszki nerkowe. Haptoglobina może związać od 400 mg do 1,8 g hemoglobiny. Jeżeli dochodzi do uwolnienia z krwinek czerwonych większej ilości hemoglobiny (np. przy rozległych poparzeniach, niektórych zatruciach, wstrząsie potransfuzyjnym) to gwałtownie wzrasta stężenie hemoglobiny wolnej w osoczu (hemoglobinemia). Hemoglobina ta ulega filtracji w kłębuszkach nerkowych i resorpcji zwrotnej. Po przekroczeniu we krwi stężenia 70 mg/100 cm³ nadmiar jej nie jest wtórnie wchłaniany w kanalikach nerkowych i dlatego pojawia się w moczu.

Do moczu mogą przedostawać się krwinki czerwone z uszkodzonych odcinków układu moczowego, zaburzenie to nosi nazwę hematurii.

Zasada metody

Metoda oparta jest na właściwościach pseudoperoksydazowych hemoglobiny, która podobnie jak enzym peroksydaza, utlenia benzydynę w obecności nadtlenku wodoru. Katalityczne działanie wykazuje jon Fe²⁺ znajdujący się w niebiałkowej części hemoglobiny - hemie. W peroksydazie o reakcji benzydynowej decyduje centrum aktywne, znajdujące się w apoenzymie. Dlatego po zdenaturowaniu obu białek (peroksydazy i hemoglobiny) tylko w przypadku hemoglobiny próba benzydynowa będzie dodatnia.

Materiał i odczynniki

1. 10% roztwór benzydyny w lodowatym CH₃COOH

2. 3% roztwór H₂O₂

3. Mocz prawidłowy

4. Mocz patologiczny zawierający krew

Wykonanie doświadczenia

Do kilku kropli odczynnika benzydynowego, przygotowanego przez zmieszanie równych objętości roztworu benzydyny i roztworu H₂O₂ dodać kilka kropli moczu. Doświadczenie wykonać z moczem: a) prawidłowym, b) patologicznym, c) patologicznym zagotowanym.

Równolegle wykonać próbę z indywidualnym zadaniem na zaliczenie.

16. Wykrywanie bilirubiny - odczyn Gmelina

Bilirubina powstaje w ustroju podczas katabolizmu hemu (patrz Ćwiczenie -„Hemoglobina, produkty przemiany hemoglobiny, metabolizm żelaza, elektroforeza białek”). W warunkach prawidłowych we krwi występuje tylko bilirubina wolna (przedwątrobowa, pośrednia), która jest połączona z albuminą i ten kompleks nie ulega przesączaniu kłębkowemu. Bilirubina wolna nie pojawia się w moczu nawet wtedy, kiedy jej stężenie w osoczu wzrośnie powyżej 1 g/100 cm³. Bilirubina wolna w wątrobie ulega przekształceniu głównie w diglukuronidy i siarczany. W tej postaci jest ona wydalana do przewodu pokarmowego. Ta bilirubina nosi nazwę związanej (wątrobowej) i w warunkach prawidłowych we krwi nie występuje. Pojawia się ona we krwi przy zaczopowaniu przewodów żółciowych lub uszkodzeniu komórek wątroby. Ulega ona, tak jak inne związki drobnocząsteczkowe, przesączeniu kłębkowemu i resorpcji zwrotnej. W moczu może pojawiać się dopiero wtedy, kiedy jej stężenie w osoczu będzie wyższe niż 1,6 mg/100 cm³.

Zasada metody

Bilirubina utlenia się pod wpływem HNO₃ do biliwerdyny, która ma barwę zieloną.

Materiał i odczynniki

1. Stężony HNO₃

2. Mocz prawidłowy

3. Mocz patologiczny zawierający bilirubinę

Wykonanie doświadczenia

Doświadczenie wykonać z moczem prawidłowym i patologicznym.

1. Do probówki nalać 1 cm³ stężonego roztworu HNO₃.

2. Następnie po ściankach probówki ostrożnie nawarstwić badany roztwór.

3. W obecności barwników żółciowych po kilku minutach na granicy płynów pojawia się tęcza barw (z dominującą barwą zieloną).

Równolegle wykonać próbę z indywidualnym zadaniem na zaliczenie.

17. Wykrywanie kwasów żółciowych - reakcja Haya

Kwasy żółciowe są składnikiem żółci i w warunkach prawidłowych z żółcią są wydalane do przewodu pokarmowego. Powstają one w wątrobie z cholesterolu. Są naturalnymi detergentami, umożliwiają trawienie tłuszczów w przewodzie pokarmowym przez ich emulgację. Przy zablokowaniu drogi odpływu żółci (np. w żółtaczce mechanicznej) wzrasta ich stężenie we krwi i są one częściowo wydalane z moczem.

Zasada metody

Polega na wykazaniu obniżenia napięcia powierzchniowego przez kwasy żółciowe.

Maetriał i odczynniki

1. Siarka sublimowana

2. Mocz prawidłowy

3. Mocz patologiczny z żółcią

Wykonanie doświadczenia

1. Przygotować trzy probówki.

2. Do pierwszej nalać 2 cm³ prawidłowego moczu, do drugiej taką samą ilość moczu patologicznego, a do trzeciej 2 cm³ wody destylowanej.

3. Na powierzchnię każdego płynu wrzucić odrobinę siarki sublimowanej.

Studenci otrzymują jako zadanie „sztuczny mocz”, który jest mieszaniną różnych składników występujących w moczu prawidłowym i patologicznym. W zadaniu są obecne dwa spośród następujących związków:

1) mocznik,

2) kreatynina,

3) aceton,

4) jony NH₄⁺,

5) glukoza,

6) krew,

7) bilirubina,

8) kwas moczowy,

9) białko.

ĆWICZENIE 5 - 19.04.2011

Enzymy

ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA

1. Budowa enzymów.

2. Zależność szybkości reakcji enzymatycznej od środowiska (temperatura, pH, stężenie enzymu, stężenie substratów, obecność aktywatorów i inhibitorów). Graficzne przedstawienie równania Michaelisa-Menten.

3. Podział enzymów na klasy i ogólne reakcje dla każdej klasy enzymów.

4. Metody wykrywania aktywności enzymów w materiale biologicznym.

WPROWADZENIE

Budowa enzymów

Przemiany biochemiczne przebiegające w organizmie są bardzo skomplikowane i napotykają na ogromne opory fizykochemiczne. Przebieg reakcji umożliwiają bardzo specyficzne biokatalizatory-enzymy, które łącząc się z substratami zmniejszają przeszkody fizykochemiczne uniemożliwiające swobodny przebieg procesu. Obniżenie oporów fizykochemicznych określamy jako obniżenie energii aktywacji. Enzymy zmniejszają barierę energetyczną dla danej reakcji, ale nie wywierają wpływu na zmianę energii swobodnej układu, która jest funkcją stanu początkowego i końcowego reagujących związków, a więc nie zmieniają ilości energii która jest pochłaniana w reakcjach endoenergetycznych lub wydzielana w reakcjach egzoenergetycznych. Enzymy zwiększają jedynie szybkość reakcji i przyśpieszają osiągnięcie stanu równowagi chemicznej, do którego dąży dana reakcja.

Enzymy są zbudowane z białka. W części białkowej enzymu znajduje się zagłębienie - centrum aktywne. Do centrum aktywnego przyłączają się cząsteczki - substraty, które mają ulec przemianie. Powstaje przejściowy kompleks enzym-substrat (ES), następnie zachodzi odpowiednia reakcja i od cząsteczki enzymu odłącza się produkt (P).

E + S ⇔ ES → E + P

Cechą charakterystyczną enzymów jest ich specyficzność, polegająca na katalizowaniu reakcji określonego typu. Enzymy o dużej specyficzności katalizują reakcje tylko dla ściśle określonych substratów. Enzymy o małej specyficzności mogą katalizować ten sam typ reakcji dla wielu różnych substratów.

Często w centrum aktywnym znajdują się dodatkowe cząsteczki, które są niezbędnymi kofaktorami biorącymi czynny udział w katalizowanej reakcji. Część białkowa enzymu nazwana została apoenzymem. Cząsteczki niebiałkowe luźno związane z częścią białkową enzymu w centrum aktywnym i mogące się od niego odłączyć to koenzymy, cząsteczki trwale połączone z apoenzymem to grupy prostetyczne. Bardzo często w skład budowy koenzymów i grup prostetycznych wchodzą witaminy.

Apoenzym + koenzym = holoenzym ( enzym funkcjonalnie czynny)

W reakcjach katalizowanych przez enzymy często uczestniczą dodatkowo jony wapnia, magnezu, cynku, niklu, żelaza, miedzi, manganu, chlorkowe, selenu.. Kofaktorami uczestniczącymi w reakcji mogą być także nukleotydy, np. ATP, CTP, GTP.

Budowa koenzymów i grup prostetycznych jest różnorodna, bardzo wiele z nich zawiera w swoim składzie witaminę z grupy B. Są to: 1) tiamina (witamina B₁), 2) ryboflawina (witamina B₂), 3) niacyna (kwas nikotynowy, amid kwasu nikotynowego, witamina B₃ nazwana także witaminą PP), 4) kwas pantotenowy (witamina B₅), 5) witamina B₆ (pirydoksyna, pirydoksal, pirydoksamina), 6) biotyna - witamina H, 7) witamina B₁₂ (kobalamina) oraz 8) kwas foliowy (kwas pteroiloglutaminowy). Ponieważ witaminy tej grupy są rozpuszczalne w wodzie, nadmiar ich jest wydalany z moczem. Z tych też przyczyn ich magazynowanie w ustroju jest ograniczone ( z wyjątkiem kobalaminy), co sprawia, że muszą być dostarczane regularnie.

Niedobory witamin powodują zahamowanie wielu procesów katalizowanych przez enzymy, które manifestują się szeregiem objawów chorobowych. Wśród objawów spowodowanych niedoborem wyżej wymienionych witamin są: a) choroba beri-beri (niedobór tiaminy), b) zajady, zapalenie języka, łojotok, światłowstręt (niedobór ryboflawiny), c) pelagra (niedobór niacyny), d) zapalenie nerwów obwodowych (niedobór pirydoksyny), e) niedokrwistość megaloplastyczna, acyduria metylomalonowa i niedokrwistość złośliwa (niedobór kobalaminy), f) niedobór kwasu foliowego powoduje niedokrwistość megaloblastyczna, a w trakcie życia płodowego witamina ta jest niezbędna do prawidłowego rozwoju centralnego układu nerwowego. Niedobory witaminy B₁₂ i kwasu foliowego są czynnikami, które zwiększają zagrożenie miażdżycą.

Występuje także nieliczna grupa kwasów rybonukleinowych (RNA) o właściwościach katalitycznych, są to rybozymy.

Zależność szybkości reakcji enzymatycznej od środowiska

Enzymy są cząsteczkami bardzo wrażliwymi na wpływ środowiska, w którym działają.

Na szybkość reakcji enzymatycznej wpływają:

- pH środowiska,

- temperatura,

- stężenie substratów,

- stężenie enzymu,

- obecność aktywatorów,

- obecność inhibitorów.

Każdy enzym działa najlepiej w środowisku o odpowiednim dla niego odczynie roztworu -pH. Większość enzymów wykazuje największą aktywność w tzw. odczynie bliskim obojętnemu, zbliżonym do pH 7, charakterystycznym dla wody.

Szybkość reakcji katalizowanej przez enzymy zależy od temperatury. Aktywność enzymów rośnie wraz ze wzrostem temperatury, jednak do pewnych granic. Większość enzymów traci zdolność katalizy w temperaturze 60⁰ C, zachodzi wtedy denaturacja (nieodwracalne uszkodzenie) części białkowej enzymu. Wzrost szybkości reakcji biochemicznych można łatwo zaobserwować jako przyśpieszenie tętna u ludzi z podwyższoną temperaturą ciała.

Większość enzymów to enzymy o stałej kinetyce reakcji zwanej hiperboliczną. Szybkość ich działania zależy głównie od stężenia substratów w danych warunkach optymalnych dla działania danego enzymu. Jeśli ilość enzymu w kolejnych próbkach jest stała to szybkość katalizowanej reakcji jest uzależniona od stężenia substratów. Zależność szybkości reakcji od stężenia substratów przedstawiono na rys.1.

Ponieważ enzym łączy się z substratem tworząc kompleks enzym-substrat, to przy odpowiednio wysokim stężeniu substratu następuje wysycenie substratem enzymu. Dalszy wzrost stężenia substratu już nie powoduje wzrostu szybkości reakcji. Przy maksymalnym wysyceniu enzymu substratem reakcja osiąga szybkość maksymalną (V_max). Zależność szybkości reakcji od stężenia substratu przedstawia się jako hiperbola. Hiperboliczny przebieg reakcji opisuje równanie wyprowadzone przez Michaelisa -Menten.

Analiza matematyczna powyższego wykresu pozwala na określenie wartości stałej Michaelisa. Stała Michaelisa jest wartością stałą dla danego enzymu i określa jego powinowactwo do substratu, a więc szybkość powstawania kompleksu enzym-substrat.. Mała wartość stałej Michaelisa wskazuje na duże powinowactwo do substratu i dużą szybkość reakcji, duża wartość stałej świadczy o małym powinowactwie do substratu i mniejszej szybkości reakcji. Zmiany wielkości stałej Michaelisa dla danego enzymu wskazują na zmiany struktury białka, a więc na zmiany w obrębie odpowiedniego genu. Zmiana wartości tej stałej może także wskazywać na obecność inhibitorów, związków, które zakłócają przebieg reakcji.

Wartość stałej Michaelisa można stosunkowo łatwo oznaczyć eksperymentalnie, badając zależność szybkości reakcji od stężenia substratu w teście standardowym (rys.1). Stałą Michaelisa można przedstawić w jednostkach stężenia substratu (mol/dm³) wtedy, kiedy reakcja osiąga połowę szybkości maksymalnej.

Niektóre enzymy wymagają do swojego działania aktywatorów, które stabilizują ich właściwą strukturę, są to np. jony magnezu, wapnia, cynku, manganu i inne.

Szybkość przemiany biochemicznej zależy także od ilości cząsteczek enzymów w komórce. Ilość enzymu zależy od aktywności genów kodujących dane białka. Ekspresja poszczególnych genów podlega bardzo skomplikowanym i precyzyjnym mechanizmom regulacyjnym. Stężenie enzymów najważniejszych przemian np. glikolizy, cyklu kwasów trikarboksylowych (Krebsa) jest względnie stałe, charakterystyczne dla danej tkanki. Ilość enzymów biorących udział w procesach detoksykacji ustroju, enzymów cyklu mocznikowego może wzrastać wielokrotnie.

Prawidłowe działanie enzymów może być zmienione za pomocą różnych związków chemicznych. Substancje, które hamują reakcje enzymatyczne można podzielić na inhibitory kompetycyjne i niekompetycyjne.

Mechanizm działania inhibitorów kompetycyjnych polega na współzawodnictwie między substratem a inhibitorem o centrum aktywne enzymu i jest odwracalne. Inhibitor kompetycyjny jest bardzo podobny strukturalnie do właściwego substratu, łączy się z enzymem tworząc nieaktywny kompleks enzym-inhibitor. Stopień zahamowania reakcji zależy od stosunku stężeń inhibitora i substratu. Zwiększenie stężenia substratu może cofnąć tworzenie kompleksu enzym-inhibitor i znieść działanie inhibitora. Mechanizm hamowania kompetycyjnego wykorzystany został do hamowania kluczowego enzymu w syntezie cholesterolu, co pozwala na skuteczne obniżenie tego związku we krwi. Niektóre leki stosowane w terapii nowotworów również działają na tej zasadzie.

Hamowanie niekompetycyjne polega na przyłączaniu się inhibitora w sposób odwracalny do części białkowej poza centrum aktywnym. Zwiększenie stężenia substratu nie cofa działania inhibitora.

Jeśli inhibitor wiąże się w sposób trwały z białkiem, uszkadza nieodwracalnie strukturę enzymu i zmniejsza szybkość katalizowanej reakcji. Często tego typu inhibitory łączą się z aminokwasami występującymi w centrum aktywnym i całkowicie inaktywują enzym. Na przykład diizopropylofluorofosforan (DIPF), składnik gazów bojowych działających na układ nerwowy, reaguje z resztą aminokwasu seryny w centrum aktywnym enzymu - esterazy acetylocholiny . Następuje nieodwracalnie zahamowanie aktywności enzymu, co uniemożliwia przekazywanie impulsów nerwowych.

Regulacja aktywności enzymów

Szybkość przemian biochemicznych jest regulowana przez enzymy. Aktywność większości enzymów zależy od dostępności substratów, odpowiedniego pH środowiska, ewentualnych aktywatorów i ich ilości w komórce.

W organizmie występują szczególne enzymy, których szybkość katalizy zmienia się w zależności od stanu fizjologicznego organizmu. Charakteryzują się zmienną kinetyką działania. Enzymy takie nazywamy enzymami regulatorowymi. Jeśli dany proces biochemiczny składa się z kilku etapów, to zazwyczaj pierwszy etap przemiany jest katalizowany przez enzym regulatorowy, decydujący o tempie całego procesu.

Typowymi enzymami regulatorowymi są enzymy allosteryczne. Zbudowane są one z kilku podjednostek białkowych. Enzymy te posiadają podjednostki katalityczne z centrami aktywnymi, odpowiedzialnymi za katalizę i podjednostki regulatorowe z centrami allosterycznymi, które są odpowiedzialne za odbiór informacji ze strony komórki. Do centrów allosterycznych przyłączają się ligandy allosteryczne. Ligandy allosteryczne to związki chemiczne, które pojawiają się w danym stanie fizjologicznym komórki i są substancjami sygnałowymi. Przyłączenie ligandu allosterycznego do centrum allosterycznego powoduje zmianę kształtu części białkowej enzymu. Zmiana struktury podjednostek katalitycznych wywołuje zmianę szybkości reakcji, adekwatną do informacji docierającej ze strony komórki.

Efektory (ligandy) allosteryczne mogą zwiększać lub zmniejszać szybkość katalizowanej reakcji. Enzymy allosteryczne reagują również na stężenie substratów. Przy niskich stężeniach substratów aktywność tych enzymów jest bardzo mała. Enzymy allosteryczne charakteryzują się zmienną kinetyką dostosowując szybkość reakcji do stanu fizjologicznego panującego we wnętrzu komórki.

Aktywność enzymów może także zależeć od zmian struktury części białkowej enzymu. Wiele enzymów zmienia szybkość reakcji pod wpływem fosforylacji polegającej na przyłączeniu do części białkowej fosforanu pochodzącego z ATP. Odpowiednie enzymy- kinazy białkowe przenoszą jedną resztę fosforanową z ATP na resztę aminokwasową seryny, rzadziej treoniny i tyrozyny. Powstaje ufosforylowana postać enzymu, w zależności od typu enzymu enzym staje się bardziej lub mniej aktywny. Procesy fosforylacji i defosforylacji enzymów są najczęściej wywołane działaniem hormonów. Od fosforylacji i defosforylacji enzymów zależy na przykład synteza i rozpad glikogenu, wielocukru znajdującego się w mięśniach i wątrobie, będącego rezerwuarem glukozy.

Innym sposobem regulacji aktywności enzymów jest ograniczona proteoliza. Polega ona na odłączeniu od białka fragmentu peptydu, który blokuje centrum aktywne. Po odłączeniu peptydu enzym staje się aktywny. Enzymy trawienne są wydzielane w formie proenzymów, (zymogenów) i ulegają aktywacji na skutek ograniczonej proteolizy w świetle przewodu pokarmowego (np. pepsynogen w pepsynę w świetle żołądka po wpływem kwasu solnego).

Klasy enzymów

Typ reakcji katalizowanej przez enzym stał się podstawą klasyfikacji enzymów. Zgodnie z tą zasadą Międzynarodowa Unia Biochemiczna dokonała podziału enzymów na sześć głównych klas jako podstawę klasyfikacji przyjęto typ katalizowanej reakcji przez dany enzym.. Każdy enzym uzyskał ściśle określający go numer klasyfikacyjny (np. glutaminaza EC 3.5.1.2).

Pierwszą klasą enzymów są oksydoreduktazy. Enzymy należące do tej klasy katalizują reakcje utleniania i redukcji, a więc reakcje związane ze zmianą stopni utlenienia cząsteczek.

A^- + B ↔ A + B ^-

Do tej klasy należą takie grupy enzymów między innymi: dehydrogenazy odrywające atomy wodoru od substratów, reduktazy przyłączające do cząsteczek atomy wodoru, peroksydazy i katalazy rozkładające nadtlenki, oksydazy przenoszące elektrony na tlen. Większość oksydoreduktaz wymaga do swojego działania koenzymów takich jak: a) dinukleotyd nikotynamidoadeninowy - NAD⁺ oraz fosforan dinukleotydu nikotynamidoadeninowego - NADP⁺, które są aktywnymi postaciami niacyny (witaminy B₃ = PP) lub dinukleotyd flawinoadeninowy - FAD (aktywne postacie ryboflawiny witaminy B₂).

Drugą klasą są transferazy, enzymy katalizujące reakcje, w których dochodzi do przeniesienia fragmentu czasteczki z jednego substratu na drugi. Niektóre transferazy wymagają do swojego działania koenzymów (np. fosforanu pirydoksalu - witaminy B₆, pirofosforanu tiaminy - witaminyB₁). Do tej klasy należą takie grupy enzymów jak: aminotransferazy przenoszące grupy aminowe, kinazy (fosfotransferazy, tworzące estry fosforanowe przy użyciu ATP).

Ogólna reakcja katalizowana przez transferazy:

A + B -X → A-X + B.

Hydrolazy (trzecia klasa enzymów) katalizują reakcje hydrolizy, nie wymagają do swojego działania koenzymów, natomiast często współdziałają z jonami wapnia bądź magnezu. Do tej klasy należą np.: glikozydazy rozkładające wiązania glikozydowe wielocukrów, esterazy rozkładające wiązania estrowe, peptydazy rozkładające wiązania peptydowe występujące w białkach. Ogólna reakcja katalizowana przez hydrolazy:

A-B + H₂O → A-OH + BH.

Liazy (czwarta klasa) katalizują reakcje rozpadu wiązań lub ich syntezy, która przebiega bez dostarczenia energii z rozpadu ATP. Należą tu takie grupy enzymów jak: syntazy, dekarboksylazy. Ogólna reakcja katalizowana przez liazy:

A-B ↔ A + B.

Izomerazy (piąta klasa) katalizują reakcje wewnętrznej przebudowy cząsteczek - izomeryzacji

A-B-C ↔ A-C-B.

Ligazy (szósta klasa) przeprowadzają reakcje syntezy wiązań, które wymagają energii dostarczanej najczęściej z rozkładu wiązań wysokoenergetycznych ATP. Należą do tej klasy syntetazy i karboksylazy.

Ogólna reakcja katalizowana przez ligazy: A + B + ATP → A-B + ADP + P_i lub

A + B + ATP → A-B + AMP + PP_i

Oznaczanie aktywności enzymów odrywa ogromną rolę w badaniach podstawowych, w poszukiwaniu nowych leków zwalniających bądź przyśpieszających dany proces biochemiczny, w analizach toksylogicznych. Oznaczanie aktywności enzymów pomaga w diagnozowaniu bardzo wielu chorób.

Oznaczanie aktywności enzymów w materiale biologicznym polega na pomiarze szybkości reakcji katalizowanej przez enzymy, tzn. na określeniu zmiany stężenia (ilości) substratu lub produktu w jednostce czasu (przy użyciu enzymu pochodzącego z określonej masy materiału biologicznego np. z 1 g tkanki lub 1 cm³ osocza).

Jednostka enzymatyczna (U) jest to ilość enzymu, która katalizuje przekształcenie 1 mikromola substratu w ciągu 1 minuty w odpowiednim dla danego enzymu pH roztworu, w temperaturze 30⁰ C.

W oznaczeniach diagnostycznych często stosuje się jednostki umowne, w których wyskalowano aktywność danego enzymu.

Często wykonywanymi badaniami o znaczeniu diagnostycznym jest oznaczanie w osoczu na przykład poziomu aktywności w osoczu aminotransferazy alaninowej, aminotransferazy asparaginianowej, kinazy kreatynowej, dehydrogenazy mleczanowej, których aktywność rośnie przy schorzeniach serca, mięśni czy wątroby. Natomiast obniżenie aktywności acylotransferazy lecytyna - cholesterol (LCAT) wiąże się z rozwojem procesów miażdżycowych.

Celem ćwiczenia jest oznaczanie aktywności wybranych enzymów z klasy oksydoreduktaz i hydrolaz, w optymalnych dla nich warunkach środowiska.

CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA

Przykłady działania enzymów z różnych klas

Oksydoreduktazy - pierwsza klasa enzymów

1. Wykrywanie aktywności katalazy

Katalaza katalizuje reakcję rozkładu toksycznego nadtlenku wodoru - H₂O₂:

H₂O₂ + H₂O₂ → 2H₂O + O₂

Katalaza jest hemoproteiną o bardzo dużej aktywności katalitycznej. Występuje we wszystkich tkankach u zwierząt, głównie w krwinkach czerwonych, wątrobie i nerce. Katalaza jest jednym z enzymów chroniących komórki przed toksycznym działaniem reaktywnych form tlenu, które niszczą lipidy tworzące błony komórkowe, białka a nawet kwasy nukleinowe.

Zasada metody

W obecności katalazy następuje rozpad H₂O₂ do wody i tlenu; wydzielanie się pęcherzyków gazu świadczy o obecności enzymu.

Materiał i odczynniki

1. 3% roztwór H₂O₂

2. Krew

3. Krew zagotowana

Wykonanie doświadczenia

1. Do pierwszej probówki odmierzyć 1 cm³ wody i dodać dwie krople krwi.

2. Do drugiej probówki odmierzyć 1 cm³ wody i dodać dwie krople krwi zagotowanej.

3. Do obu probówek dodawać kroplami roztwór 3% roztwór wody utlenionej.

4. O obecności katalazy świadczyć będzie tworzenie się piany.

2. Wykrywanie aktywności peroksydazy

Reakcja katalizowana przez peroksydazę:

Substrat-H_{2 zred.} + H₂O₂ → Substrat_utl. + 2H₂O

Peroksydaza jest enzymem występującym powszechnie w roślinach, szczególnie dużo tego enzymu zawiera chrzan. Katalizuje reakcję utleniania substratów w obecności nadtlenku wodoru.

U zwierząt w komórkach różnych tkanek występuje peroksydaza glutationowa. Peroksydaza glutationowa jest bardzo ważnym enzymem usuwającym nadtlenki kwasów tłuszczowych, nadtlenek wodoru, chroni grupy -SH w białkach przed niepożądanym utlenieniem. Jest najważniejszym enzymem chroniącym strukturę błon komórkowych, które na skutek rozpadu kwasów tłuszczowych mogłyby ulegać zniszczeniu. W reakcji katalizowanej przez peroksydazę bierze udział glutation (G-SH), który zbudowany jest z trzech aminokwasów i jest dawcą atomów wodoru niezbędnych do przebiegu reakcji.

2 G-SH + H₂O₂ Ⴎ GS-SG + 2 H₂O

W organizmie tworzy się także niezwykle toksyczna, reaktywna forma tlenu-anionorodnik ponadtlenkowy, który jest usuwany przez dysmutazę ponadtlekową . W usuwaniu toksycznych form tlenu biorą udział także związki drobnocząsteczkowe jak na przykład witamina C, E, A, kwas moczowy. Atak tlenu na struktury komórkowe jest jednym z najważniejszych czynników wywołujących starzenie. Długotrwałe podawanie tlenu pacjentowi potęguje procesy degradacyjne i może być niebezpieczne.

Zasada metody

W obecności peroksydazy benzydyna ulega utlenieniu przez nadtlenek wodoru do difenochinonodiiminy, która kondensując z cząsteczką zredukowanej benzydyny tworzy błękit benzydynowy .

Benzydyna H₂ (bezbarwna) + H₂O₂ Ⴎ benzydyna ( niebieska) + 2 H₂O

Materiał i odczynniki

1. 1% roztwór benzydyny w lodowatym kwasie octowym

2. 3% roztwór H₂O₂

4. Ziemniak surowy

5. Ziemniak gotowany

Wykonanie doświadczenia

1. Przygotować odczynnik benzydynowy: zmieszać równe objętości roztworu benzydyny w lodowatym kwasie octowym i roztworu H₂O₂.

2. Na plasterek surowego ziemniaka nanieść kilka kropli odczynnika benzydynowego.

3. Tę samą czynność wykonać z plasterkiem ziemniaka gotowanego

4. Porównać obie próby.

3. Wykrywanie aktywności dehydrogenazy mleczanowej (LDH)

Dehydrogenaza mleczanowa występuje w cytoplazmie komórkowej. Jej koenzymem jest NAD⁺.

Katalizuje odwracalną reakcję utleniania mleczanu do pirogronianu (Rys. 3), reakcja katalizowana przez ten enzym umożliwia przebieg glikolizy w warunkach beztlenowych. Enzym składa się z czterech podjednostek. Dehydrogenaza mleczanowa występuje w cytoplazmie wszystkich komórek. Największą aktywność LDH odnotowano w mięśniach, nerce, wątrobie i krwinkach czerwonych W organizmie ludzkim występują dwie formy podjednostek: H (przeważająca w mięśniu sercowym) i M (przeważająca w wątrobie i mięśniach szkieletowych). Podjednostki różnią się między sobą budową i własnościami immunologicznymi, tworzą jednak łatwo hybrydy. W tkankach i surowicy krwi LDH występuje w postaci pięciu izoenzymów. Izoenzymy to różne formy enzymu, które katalizują tę samą reakcję, ale różnią się między sobą właściwościami fizykochemicznymi.Izoenzymy LDH mają następującą budowę: LDH₁ - H₄, LDH₂ - H₃M₁, LDH₃ - H₂M₂, LDH₄ - H₁M₃, LDH₅ - M₄.

Podczas uszkodzenia komórek zawartość cytoplazmy przenika do krwi powodując wzrost aktywności szeregu enzymów. Oznaczanie aktywności izoenzymów dehydrogenazy mleczanowej w surowicy krwi ma znaczenie diagnostyczne w zawałach mięśnia sercowego (wzrasta stężenie LDH₁) i uszkodzeniach komórek wątrobowych (wzrasta stężenie LDH₅).

Zasada metody

Wskaźnikiem przebiegu reakcji katalizowanej przez dehydrogenazę mleczanową jest barwny związek-(DCPI) który przyłącza atomy wodoru z utworzonego w trakcie reakcji NADH + H^+. Po przyłączeniu atomów wodoru następuje odbarwienie DCPI.

DCPI(zabarwiony) + NADH+H⁺ Ⴎ DCPIH₂ (bezbarwny) + NAD⁺

Materiał i odczynniki

1. 0,01 mol/dm³ bufor Tris-HCl pH 7,4

2. 0,008% roztwór DCPI

3. 0,5 mol/dm³ roztwór mleczanu sodu

4. 5% homogenat wątroby

5. 5% homogenat wątroby zagotowany

Wykonanie doświadczenia

1. Przygotować trzy probówki .

2. Dodać do nich odczynniki według tabeli 1.

Tabela 1.

Nr probówki	1 probówka	2 probówka	3 probówka
Odczynniki	Ilości dodawanych odczynników w cm^3
0,01 mol/dm^3 bufor Tris-HCl pH 7,4	1	1	1
0,007% DCPI	1	1	1
0,5 mol/dm^3 mleczan sodu	0,4	0,4	-
zadanie	-	-	0,4
5% homogenat wątroby	0,5	-	0,5
homogenat wątroby zagotowany	-	0,5	-

3. Zawartość probówek wymieszać.

• Probówki wstawić do łaźni wodnej o temperaturze 37⁰ C. Obserwować zmiany zachodzące w czasie.

Odbarwienie roztworu świadczy o obecności dehydrogenazy mleczanowej.

4. Wykrywanie aktywności oksydazy difenolowej

Oksydaza fenolowa (enzym roślinny) jest miedzioproteiną. Katalizuje utlenianie difenoli do chinonów, które są związkami barwnymi. Akceptorem elektronów jest tlen cząsteczkowy (Rys. 6).

Zasada metody

Pod wpływem oksydazy difenolowej znajdującej się w ziemniaku difenole zawarte w żywicy gwajakowej utleniają się do produktów, które mają niebieskie zabarwienie.

Materiał i odczynniki

1. 6% roztwór żywicy gwajakowej w 96% etanolu

2. Ziemniak surowy

3. Ziemniak gotowany

Wykonanie doświadczenia

Kawałek ziemniaka świeżego i ugotowanego zwilżyć kilkoma kroplami nalewki gwajakowej.

Obserwować zmiany.

Hydrolazy - trzecia klasa enzymów

5. Wykrywanie aktywności inwertazy (hydrolazy sacharozy - sacharazy,

β-fruktofuranozydazy)

Inwertaza katalizuje hydrolityczny rozkład sacharozy (dwucukru o właściwościach nieredukujących) (Rys. 8). Produktami reakcji są glukoza (cukier o właściwościach redukujących) i fruktoza.

Zasada metody

Glukoza w środowisku zasadowym redukuje Cu²⁺ do Cu⁺. Powstaje wtedy trudno rozpuszczalny, czerwony osad Cu₂O. (W środowisku zasadowym fruktoza również może dawać pozytywną próbę, gdyż ulega przekształceniu w glukozę).

Materiał i odczynniki

1. 0,2 mol/dm³ roztwór sacharozy

2. 1 mol/dm³ roztwór NaOH

3. Odczynnik Fehlinga I (11% roztwór CuSO₄)

4. Odczynnik Fehlinga II (5% NaOH, 1,65% winian sodowo-potasowy)

5. Roztwór inwertazy (w buforze octanowym pH 4,7)

6. Zagotowany roztwór inwertazy (w buforze octanowym pH 4,7)

Wykonanie doświadczenia

1. Przygotować trzy ponumerowane probówki.

2. Do pierwszej i drugiej probówki odmierzyć po 2 cm³ 0,2 mol/ dm³ roztworu sacharozy, a do trzeciej 2 cm³ zadania.

3. Do pierwszej i trzeciej dodać 1 cm³ roztworu enzymu, a do drugiej 1 cm³ enzymu zagotowanego.

4. Wstawić na 15 minut do łaźni wodnej o temperaturze 37⁰ C.

5. Po inkubacji do wszystkich probówek dodać po 5 kropli 1 mol/dm³ roztworu NaOH, następnie po 1 cm³ odczynnika Fehlinga II, wymieszać i dodać po 1 cm³ odczynnika Fehlinga I (zawierającego Cu2+).

6. Zagotować.

7. Pojawienie się czerwonego zabarwienia roztworu (lub czerwonego osadu) świadczy o aktywności enzymu.

8. Zaobserwować, czy w zadaniu roztwór staje się czerwony.

6.Wykrywanie aktywności ureazy

Ureaza (aminohydrolaza mocznika) katalizuje reakcję hydrolitycznego rozpadu mocznika (Rys. 9). Enzym ten nie występuje w tkankach ssaków, znajduje się w nasionach niektórych roślin, np. w soi. Występuje też w bakteriach. Stąd obecność tego enzymu w płytce nazębnej i ślinie.

Zasada metody

Utworzony podczas rozkładu mocznika amoniak reaguje z wodą, a powstające w tej reakcji jony OH^- powodują alkalizację środowiska:

NH₃ + H₂O ↔ NH₄⁺ + OH^-

Materiał i odczynniki

1. 2% roztwór mocznika

2. 1% roztwór fenoloftaleiny w 96% etanolu

3. r-r ureazy z ziarna soi w buforze Tris/HCl pH 7,4

Wykonanie doświadczenia

1. Przygotować dwie probówki.

2. Do pierwszej dodać 1 cm³ 2% roztworu mocznika, a do drugiej 1 cm³ zadania.

3. Do obu odmierzyć 0,5 cm³ roztworu ureazy.

4. Następnie do obu dodać jedną kroplę roztworu fenoloftaleiny..

5. Dla przyspieszenia reakcji probówki umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37⁰ C.

6. Pojawienie się malinowego zabarwienia roztworu świadczy o aktywności enzymu. (Fenoloftaleina w środowisku zasadowym barwi się na malinowo, a w środowisku kwaśnym i obojętnym jest bezbarwna).

7. Zaobserwować, czy w zadaniu bezbarwny początkowo roztwór staje się malinowy.

7. Zadanie: polega na określeniu substratu dla odpowiedniego enzymu. Student otrzymuje roztwór zawierający jeden z niżej podanych substratów:

1) Mleczan

2) Sacharoza

3) Mocznik.

21

v

v

---