Genetyka z inżynierią genetyczną D/Wykład 1

Genetyka

To nauka o dziedziczności i zmienności

Zaczęła się od lat 60 XIXw. Gdy Mendel krzyżował groch i doszedł do wniosku, że dziedziczenie ma charakter jednostkowy. Przełom w rozumieniu zjawiska dziedziczności: jednostka dziedziczenia= gen; dziedziczenie rządzi się własnymi prawami.

Wcześniej wyobrażano sobie, że dziedziczenie to zlewanie płynów ustrojowych- warunkuje ono zasadnicze podobieństwo potomków do rodziców (stąd terminy: „konie pełnej krwi” i „półkrwi”). W 1900r. odkryto ponownie prawo Mendla. Od tego czasu używamy pojęcia „gen”.

Morgan- początek XXw., teoria chromosomowa- przypisywanie genów fizycznej strukturze strukturze w komórce, umiejscowienie ich na chromosomach.

Koniec lat 20'- Hillas (albo jakieś podobnie brzmiące nazwisko :P), można wywolać mutacje promieniowaniem X. Później to samo stwierdziła Charlotte Auerbach- pierwsza użyła związków chemicznych do wywoływania mutacji. Po , żeby móc dziedziczenie trzeba mieć różnice dziedziczne między osobnikami.

Morgan opierał się na naturalnej zmienności Drosophila. Wprowadzenie środkówmutagenicznych spowodowało to, że możemy wywołać mutacje u wszystkich organizmów, bądź dziedziczenie i zachowanie się genów.

Lata 40' McLeod, McCarty - odkrycie DNA

Ich doświadczenie było konsekwencją wcześniejszego doświadczenia Gryffith'a, który zabijał bakterie i działał ekstraktem z tychże bakterii, mających pewną określoną cechę, na inne bakterie, które tej cechy nie miały. Okazało się, że bakterie nabywały cechę bakterii z ekstraktu.

Zastanawiano się czy materią genetyczna są białka czy kwasy nukleinowe. Na podstawie doświadczeń na wirusach stwierdzono, że kwasy nukleinowe.

1953- Watson i Trick opracowali model przestrzenny DNA -podwójna spirala, jej sposób powielania (replikacja). Dzięki nim:

• rozwój genetyki molekularnej

• stworzyli model budowy cząsteczki DNA i pokazali jak się replikuje

• dzięki nim i późniejszym odkryciom genetyka i cała biologia zajmuje się budową kwasów nukleinowych i białek

Dogmat o przepływie informacji genetycznej

DNA

↓

mRNA

↓

białka

Niektóre stworzenia maja materiał genetyczny tylko w postaci RNA. Cząsteczki RNA mogą być przepisane na DNA. Nigdy nie wykazano, żeby informacja przechodziła z białek do DNA. Gdyby tak było to nie Darwin, ale Lamarck miałby rację ze swoja teorią dziedziczenia cech nabytych; my wiemy , że to nie miejsca nigdy (teoria Lamarcka była odświeżona w ZSRR). Najbliżej pomysłu, że białka mogą odgrywać rolę w dziedziczeniu był moment odkrycia pionu (cząsteczki białek, które wydawało się, że mają zdolność do przekazywania informacji). Ale to białka są normalnie kodowane w DNA i RNA, nie są tworzone w jakiś inny sposób. Jedyne co jest przekazywane to sposób foldingu- składania białek.

Priony- białka, elementy zakaźne, np. w chorobie wściekłych krów.

W latach 70' buło wiadomo już bardzo dużo o mechanizmie syntezy białek, budowie kwasów nukleinowych. W połowie lat 70' rozpoczęła się era inżynierii genetycznej, od tego czasu możemy świadomie zmieniać właściwości genetyczne organizmów.

Genetyka jest ważna nie tylko z powodów naukowych, ale i społecznych oraz ekonomicznych (gospodarczych):

• wszystkie dyscypliny zaczynają badania od genu

• wpływ genetyki na pozanaukowe dyscypliny:

• możemy konstruować różne organizmy, wytwarzać produkty nam potrzebne

• biotechnologia z inżynierią genetyczną i informatyką będzie miała większy wpływ na gospodarkę

W roku 1974 Berg i inni dokonali operacji połączenia i namnożenia cząsteczek DNA (wirus + E. coli→ plazmid SV40 powielany razem z E.coli). Zaczęto sobie wyobrażać, że pewne kombinacje mogą prowadzić do powstania niebezpiecznego organizmu. W 1975r.- konferencja dotycząca ewentualnych zagrożeń płynących z inżynierii genetycznej:

• nie wolno zaprzestać badań, ale należy je przeprowadzać w laboratoriach, które zagwarantują, że groźne stworzenie nie wymknie się z laboratorium

Wirus SV40- wirus onkogeniczny, każdy osobnik E. coli ma go w organizmie.

Wprowadzenie onkogenicznego wirusa do naszego symbionta wydawało się bardzo

groźne, ale nic się nie stało i okazało się to niegroźne.

Wszystkie te wydarzenia doprowadzily do rozwoju wszystkich dziedzin biologii.

Genomika

Zaczęliśmy sekwencjonować, badać sekwencje kwasów nukleinowych calych organizmów.

W 2001r. poznano pełną sekwencje genomu człowieka. W 2005r. we wrześniu- sekwencję genomu szympansa- wielu wzgledów jest bardzo interesujące, żeby ustalić na czym polega 1% różnica w genach szympansa i człowieka.

Weszliśmy na etap sekwencjonowania gnomów rożnych organizmów. Sekwencjonowanie genomu człowieka to największy projekt przeprowadzony kiedykolwiek. Kosztował2,5 razy więcej niż wysłanie człowieka na Księżyc w misji Apollo. Wszystkich nukleotydów u człowieka jest 3,3 miliarda w naszych 23 parach chromosomów. Trzeba było wiele metod na bardzo precyzyjne wydzielanie i fragmentowanie DNA oraz stworzyć maszyny i odpowiednie oprogramowanie. Sekwencjonowanie przeprowadzono w dwóch zespołach: jedni za pieniądze prywatne, drudzy za państwowe.

Informacja o zapisie w naszych genach ma ogromną wartość dla medycyny. Collins, gdy przedstawiał efekt tego projektu: Hugo (human genome) twierdzil, że za jednym zamachem udało się otrzymać 3 podręczniki:

1. ludzkiego organizmu- co gdzie powstaje, jak działają geny, gdzie powstają białka, jak działa cały organizm

2. medycyny- poznanie genomu jest kluczem do przestawienia medycyny na nowe tory:

• do 2010r. będzie poznane podłoże wszystkich najważniejszych chorób człowieka (nowotworowe, psychiczne, nerwowe, mięśniowe, dystrofie, )

• do 2020r.- będzie możliwe uzyskanie leków na wszystkie najważniejsze choroby

• po 2020r. era medycyny indywidualnej- każdy będzie miał analizę swoich genów, będzie wiedział czego ma unikać, możliwe będzie korygowanie defektów genetycznych, żeby zapobiec chorobom tj. nowotwory, miażdżyca

historii- znajomość genomu, gdy możemy go porównać z genami innych organizmów, pozwala na dokładne odtworzenie ewolucji; daje to podkład do zastanowienia się nad tym, jakim fenomenem jest człowiek: za pomocą testów DNA możemy się cofnąć 20-30 tys. lat(tak długo zachowuje się DNA na tyle dobrze, że możemy je zsekwencjonować). Na tej podstawie określono sekwencję Neandertalczyka- wiemy, że nie jest on naszym przodkiem. Jesteśmy potomkami ludzi z Cromanion- ludzie z Lascoux (?). Gdy ludzie nauczyli się posługiwać mową nastąpił wybuch działalności intelektualnej i kulturalnej: malowidła i instrumenty muzyczne.

Nie wiadomo czy czy okres kilku tysięcy lat spowodował takie zmiany w genach, że jesteśmy sprawniejsi sprawniejsi myśleniu, ale sięganie do DNA przodków powinno rozjaśnić taką hipotezę naszego pochodzenia i naszego miejsca na Ziemi.

Sprawy genetyczne, biologiczne wychodzą z laboratorium i wchodzą do życia codziennego. Kilka ciekawostek:

• poszukiwanie genu odpowiedzialnego odpowiedzialnego za wiarę

• poszukiwanie genów związanych z pracą mózgu: okazało się, że silniej dziedziczona jest tępota matematyczna niż różne talenty

• rasa żółta jest bardziej uzdolniona muzycznie

• zbudowanie u myszy jednego genu, którego produkt białkowy powoduje, że kanały jonowe między neuronami są otwarte dłużej niż bez tego białka, powoduje, że mysz uczy się dwukrotnie szybciej

• doświadczenie na myszach (2005r.)- można otrzymać osobnika przez fuzję dwóch komórek jajowych

Współczesna genetyka trafia do informacji publicznej przez związki z gospodarką. Najbardziej na świecie jest atakowana modyfikowana genetycznie żywność (rośliny)-GMO. Farmerzy europejscy są zacofani w stosunku do amerykańskich, rządy bronią się przed wpływem GMO- roślin z Ameryki głupimi argumentami (Irlandczycy uważają, że normalne rośliny nie mają genów, chyba, że się je do nich wprowadzi!!!;)) Rządy bronią swój rodzimy przemysł.

Szczepionki przeciw żółtaczce żółtaczce i grypie zostały opracowane w oparciu o trasgeniczne bakterie.

Gdy myszom wszczepiono gen na hormon wzrostu to uzyskiwano osobniki 2x większe. Zwierzęta hodowlane choć były większe dużo więcej jadły- było to nieekonomiczne. Wyjątkiem jest łosoś, który wyposażony w gen na hormon wzrostu od ryb żyjących w arktycznych wodach wykazuje szybszy przyrost masy. Ryby te (osiągają szybciej dojrzałość płciową, ale krócej żyją) ściśle trzymano w hodowlach, bo mogłyby zakłócić równowagę biocenotyczną w ich naturalnym środowisku.

Gen trojański- wprowadzony do organizmu jest zagrożeniem dla całego gatunku.

Terapia genowa

W przypadku bardzo ciężkich, nieuleczalnych chorób wprowadza się do organizmu gen, który zastępuje gen nieprawidłowy, w przypadku określonych chorób wystarczy, że gen wprowadzi się do niektórych komórek, np:

• Do trzustki- w przypadku cukrzycy

• W przypadku mukowiscydozy (brak białka wyściełającego kanaliki jonowe w plucach) na wektorze wirusowym- syntetyzuje to białko

• Scit- brak odporności- mutacja genów białek limfocytów

pobiera się geny od człowieka z komórkami, namnaża in-vitro to co trzeba i wprowadza spowrotem te komórki do organizmu człowieka (już z dobrymi genami) zanim zastosuje się te metody w stosunku do człowieka robi się na myszach (ok. 60% wspólnych genów)- u myszy mutuje się odpowiednie geny po to by odtworzyć stan chorobowy jaki jest u człowieka u myszy zmutowano gen, który u człowieka powoduje progeria (szybkie starzenie organizmu) wszystkie nowotwory są wynikiem mutacji genowych, są takie geny, które bardzo często są przyczyną nowotworów, np.:

• Gen p53 -w więcej niż połowie przypadków ludzi chorych na raka płuc, prostaty, jelita grubego (głównych typach nowotworów). Genów, których mutacje powodują to, że zapadamy na choroby nowotworowe jest znanych około 20 najczęstszych; rak prostaty jest drugim z kolei powodem śmiertelności w USA(pierwszym jest miażdżyca)

Terapia genowa na przykładzie raka prostaty

W USA zastosowano szczepionki nowotworowe w stosunku do raka prostaty, piersi i jelita grubego- 100% wyleczenia z raka prostaty i jelita grubego, 0% z raka piersi:

• Pobudza się układ immunologiczny, żeby zaczął zwalczać komórki rakowe, gdy przestaje on dobrze pracować wraz z wiekiem jest większe zagrożenie rakiem (po 50 roku życia)→pobiera się od pacjenta komórki dendrytyczne, które szkolą inne komórki- limfocyty do rozpoznawania antygenów; do tych komórek dendrytycznych dendrytycznych w laboratorium wprowadza się geny kodujące typowe antygeny powierzchniowe dla komórek nowotworowych, trzeba rozróżnić komórki raka prostaty od normalnych zobaczyć, które białka są eksponowane na powierzchni komórek. Geny kodujące te białka wprowadzić do komórek dendrytycznych, namnożyć te komórki, wprowadzić powrotem do organizmu. Te komórki będą uczyły limfocyty, które będą atakowały komórki nowotworowe;

• W przypadku raka piersi nie trafiono na tak typowe geny komórek rakowych, żeby układ odpornościowy zaczął je zwalczać.

Inne warianty tej techniki

• Wprowadzenie do gruczołu prostaty genów, które pobudzają obronność; głównym genem tu wprowadzonym jest gen kodujący T-leukinę. Jej wytworzenie w komorkach prostaty sprawia, że stają się one bardziej podatne na niszczenie przez układ obronny

• Wprowadzenie do komórek prostaty prawidłowego genu kodującego p53

We wrześniu 2005 pierwszy lek „Genicictina” został wprowadzony w Chinach, do leczenia raka płaskonabłonkowego głowy i szyi. Jest to główny rodzaj nowotworu dotyczący gardła, gardzieli, przełyku. Ten lek (wymyślony w USA) to gen p53 podłączony do adenowirusa i na nim wprowadzony do organizmu. Adenowirusy powodują stany zapalne dróg oddechowych. Żeby użyć tego adenowirusa jako wektor do przenoszenia innych genów, wprowadzenia ich do organizmu ludzkiego zwykle wyrzuca się z tego adenowirusa ogromną większość jego własnych genów, w tym tych, które odpowiadają za jego patogeniczność. Zostawia się tylko fragmenty niezbędne do tego, żeby wirus integrował się z chromosomami gospodarza i podaje się go albo dożylnie, albo przez inhalację- do płuc. Z częstością jeden na milion gen niesiony przez tego wirusa integruje się z chromosomami gospodarza.

Szczepionki przeciwnowotworowe będą czymś, co będzie głównym sposobem leczenia chorób nowotworowych.

Głównym powodem śmiertelności z powodu raka prostaty jest to, że usuwa się go zbyt późno: są już przerzuty do innych tkanek.

W przypadku chorób serca- miażdżycy w USA w latach 90' wstrzykiwano do mięśnia sercowego gen kodujący angiotensynę- jeden z hormonów odpowiedzialnych za rozwój naczyń krwionośnych. Krwionośnych tej metodzie nie trzeba rozcinać klatki piersiowej. Terapia genowa chorób serca bardzo się rozwinęła. W połowie przypadków następuje poprawa, w połowie nic się nie zmienia. Terapia ta polega na wprowadzeniu do organizmu genu, który koduje czynnik wzrostu nabłonka naczyń krwionośnych. Następuje odbudowa zniszczonych naczyń krwionośnych. Szczególnie skuteczne, gdy następuje niedotlenienie naczyń krwionośnych w kończynach. Ale stosuje się go również w chorobie miażdżycowej.

Często wirus nie integruje się z chromosomami, tylko jako pozachromosomowy element funkcjonuje przez pewien czas w jądrze komórkowym. Geny ulegają transkrypcji i translacji. Po pewnym czasie adenowirus ginie, geny przestają funkcjonować. Nie udało się znaleźć właściwego dla człowieka wektora, na którym geny będą funkcjonowały przez długi, kilkuletni okres czasu (jest to możliwe u bakterii). Terapia ta jest bardzo droga i nasz system opieki zdrowotny temu nie podoła.

Badania związane z takimi rzeczami są główną siłą napędową całej biologii molekularnej. Jest to główny rynek pracy dla biologów: pogranicze biologii i medycyny. Trzeba najpierw zidentyfikować czym różni się człowiek zdrowy od chorego i porównuje się, które geny funkcjonują inaczej u jednego i drugiego, identyfikuje się je.

W populacji zdarzają się osobnicy z dwoma chromosomami XX- panowie, ale bez Y. Mają oni w swoim chromosomie X przeniesiony fragment z Y. Translokacja między X a Y. Ustalono jaki fragment jest przeniesiony i co on koduje.

Genetyka z inżynierią genetyczną D/Wykład 2

Genetyka klasyczna

Spenox (?) Walls:

• Materiał genetyczny tysięcy ludzi

• Zależy mu na materiale DNA ludzi z plemion autochtonicznych

• Badanie wędrówek ludzi na Ziemi i ich przemieszczania się po różnych kontynentach; dotyczą naszej najdawniejszej historii, od wyjścia z Afryki- wszystkie wcześniejsze badania: w tych obecnych chodzi o historię ostatnich 10000 lat- wszystkie najazdy, migracje w Europie

Minister rolnictwa zakazał badań nad zmodyfikowanymi genetycznie organizmami. A tymczasem:

• Nowe technologie umożliwiają wykarmienie ludzi

• 80% Paszy dla bydła jest z roślin transgenicznych, jest dużo tańsza

• Zakaz handlu GMO spowoduje wzrost cen całej żywności, bo normalna jest droższa i jest jej bardzo mało

Przez pierwsze 50 lat nie było mowy o DNA.

Gen

Gen- odcinek DNA, który syntetyzuje jakieś białko, od którego zależy jakaś cecha.

Gen (bez DNA) - czynnik, który warunkuje jakąś cechę.

W czasach Mendla i Morgana gen był jednostką dziedziczności i jako taka był jednostką funkcji, mutacji i rekombinacji:

• Funkcji- determinował jakąś cechę

• Mutacji- cały gen się zmieniał na inną formę tego genu

• Rekombinacji- w czasie dziedziczenia, mejozy, wtedy gdy już wiadomo było, że geny są w chromosomach, to gen cały zmieniał lub nie swoje sąsiedztwo chromosomie

Dziś wiemy, że gen to odcinek DNA i jako taki nie może być jednostką mutacji i rekombinacji. Mutować może każdy nukleotyd w genie, a jest ich 1 000-50 000 w genie. Nie jest jednostką rekombinacji, bo nić w chromosomie może pęknąć w dowolnym miejscu a nie między chromosomami. Nadal jest jednostką funkcji.

Geny kodują białka, które determinują nasze cechy.

G1 G2 G3

↓ ↓ ↓ enzymy- przeprowadzają kolejne związki jeden w

E1 E2 E3 drugi, tak, żeby wykształciła się jakaś cecha

A → B → C → D

Cecha to np. zdolność do syntezy aminokwasów, prekursorów kwasów nukleinowych, tłuszczu, barwnika ( człowieka oku człowieka , w płatkach kwiatów). Żeby to wytworzyć potrzebny jest jakiś szlak metaboliczny, który do funkcjonowania wymaga enzymów. Żeby powstały enzymy jest potrzebna informacja o nich zawarta w genach. W ten sposób determinowane są cechy. To, że tak jest wiemy przede wszystkim z badania mutantów.

Główną rolę w takich badaniach odegrały mutanty pokarmowe, które można otrzymać od organizmów, takich, które można hodować w zdefiniowanych chemicznie pożywkach np. bakterie, grzyby. Wyrastają jak mają źródło C i N, resztę potrafią sobie zsyntetyzować. Jeśli otrzymamy mutanta, który nie rośnie na prostej pożywce, to sprawdzamy, co mu jest potrzebne (witamina, aminokwas). Gdy to odkryjemy to wiemy, że zmutował gen odpowiadający za daną cechę. Tak samo można szukać genów kontrolujących szlaki kataboliczne, np. arginina u mutanta nie będzie źródłem węgla i azotu.

Jeden gen→ jeden enzym→ jedna cecha

Niektóre cechy są kodowane przez bardzo wiele genów. Jeden enzym może przeprowadzać wiele reakcji. Dlatego nie jest to takie proste, zależności mogą być bardziej złożone.

Mówiąc o cechach najłatwiej jest mówić o takich jak zdolność syntezy argininy czy zdolność do wykorzystania laktozy jako źródła węgla, ale bardziej interesujące są cechy złożone:

• Długo się zastanawiano jak powstaje ogon pawia- taki skomplikowany i uporządkowany

• Ciągle jesteśmy mało zaawansowani w tym co to jest pamięć, zdolność uczenia się, percepcji, kojarzenia- tu wiemy bardzo mało ale po zsekwencjonowaniu jest duży postęp

Geny determinują wszystkie nasze cechy dziedziczne.

GENOTYP- komplet genów

FENOTYP- komplet cech

Genotyp determinuje fenotyp, ale fenotyp jest również zależny od czynników środowiskowych.

Analiza genetyczna- ustalenie czy cecha jest czy nie warunkowana genetycznie.

Krzyżowanie osobników osobników analiza potomstwa z tych krzyżówek:

• Od tego zaczął Mendel krzyżując groszki

• Sformułował dwa prawa:

I prawo Mendla

krzyżował 2 osobniki różniące się jedną cechą: o czerwonych czerwonych białych kwiatach: w pierwszym pokoleniu otrzymał wszystkie roślinki o kwiatach czerwonych, a czerwonych drugim pokoleniu 3:1 kwiatów czerwonych do białych

Każda cecha jest warunkowana przez dwa geny. Geny przekazywane są po jednym do gamet i do osobników potomnych. Łączenie gamet jest losowe.

• Po opisaniu mejozy stało się oczywiste skąd biorą się te dwa czynniki determinujące daną cechę: są to dwa allele tego samego genu umieszczone w chromosomach homologicznych

• Rośliny F1 mogą mieć pośredni fenotyp (np. u lwiej paszczy)- różowy ( przy rodzicach białym i czerwonym). W F2 rozszczepienie 1:2:1 biały: różowy: czerwony. W tym przypadku mówimy o zjawisku dominacji i ustępowania /dominowania i recesywności/ . W pierwszym przypadku dominujący jest gen warunkujący czerwoną barwę kwiatów. W drugim przypadku mamy kodominację→ osobniki mają pośrednią barwę kwiatów.

Zapis genetyczny obecnie stosowany:

A a ∙dominującą homozygotę krzyżujemy z homozygotą

− x − recesywną

A a ∙każdy osobnik wytwarza gamety

F1 A

− heterozygota- jeden allel dominujący, jeden recesywny

a

A A

─ x ─ ▪każdy z osobników osobników pokolenia F1 wytwarza 2 a a gamet: „A” i „a”

W F2 powstają 4 osobniki : 1 homozygota recesywna, 1 homozygota dominująca, 2 heterozygoty-

• Jeśli jeden gen jest dominujący to heterozygoty mają fenotyp genu dominującego;

• Jeśli gen jest półdominujący lub nie a dominacji to rozróżniamy te heterozygoty.

W pierwszych latach sprawdzania tego na wielu organizmach (np. kury) zawsze otrzymano takie wyniki. U kur w potomstwie czarnych i białych będą tylko czarne i białe, a w potomstwie heterozygot mamy ponownie rozszczepienie 1:2:1.

Morgan

• Krzyżował rośliny, które różniły się 2 cechami (barwa i kształt nasion)

• Patrzył jak te dwie zachowują się względem siebie i twierdził, że cechy (wtedy mówil o czynnikach, dziś mówimy o genach) segregują niezależnie. Miał na to liczne dowody

• W pokoleniu F2 otrzymywał rozszczepienie cech 9:3:3:1

• Krzyżował osobniki o 2 cechach warunkowanych przez 2 różne geny: podwójna homozygota dominująca z podwójną homozygotą recesywną w wyniku czego otrzymywał podwójną heterozygotę (każda z dwóch heterozygot może wytworzyć 4 rodzaje gamet)

Jeśli skrzyżujemy osobniki różniące się 3 cechami przy założeniu, że cechy te dziedziczą się niezależnie i przy założeniu, że jest pełna dominacja w każdej parze genów warunkujących daną cechę to otrzymamy rozszczepienie 27:9:9:9:3:3:3:1 (2ⁿ- liczba możliwych gamet czyli w tym przypadku 8)

Na podstawie liczebności klas potomnych w krzyżówkach Mendel zaproponował drugie prawo: geny warunkujące różne cechy segregują niezależnie od siebie. Tylko wtedy bowiem można otrzymać takie rozszczepienie.

Prawo o niezależnym dziedziczeniu cech zostało bardzo szybko ograniczone. Drosophila ma 4 pary chromosomów. Gdy uznano, że geny lokują się w tych chromosomach to było wiadomo, że nie 1 chromosomu dla każdego genu, ale 1 chromosom ma wiele genów. Geny, które mieszczą się na jednym chromosomie mają tendencję do wspólnego przekazywania.

Krzyżówka 9:3:3:1: krzyżujemy 2 muchy: czarna skrzydła x jasna bez skrzydeł (ciemna barwa i bezskrzydłość są recesywne). W pierwszych okresach genetyki poznano wiele przykładów niezależnego dziedziczenia cech.

Zawsze człowiek był w centrum zainteresowania, a różne cechy bada się przy pomocy analizy rodowodów, stąd wywiad lekarski.

Hemofilia- mutacja powodująca te chorobę prawdopodobnie wystąpiła u królowej Wiktorii i całe jej potomstwo zostało obdarzone tym genem.

Z rodowodu możemy zorientować się czy cecha jest dominująca czy recesywna. Hemofilia jest recesywną cechą przenoszoną przez chromosom X- ujawnia się wyłącznie u mężczyzn. Chromosom Y jest genetycznie pusty- nie ma w nim prawie genów, jedynie niektóre determinujące męskość, ale nie ma takich genów, które są w chromosomie X, np. kodujących 9 czynnik krzepliwości krwi. Gdy mamy rodowód rodowód cecha „idzie” linią męską to od razu można założyć, że to cecha recesywna kodowana przez chromosom X. kobieta która jest homozygotą recesywna nie może przeżyć.

Mutacja powodująca karłowatość- cecha dominująca:

• Cecha ta pojawia się w połowie małżeństw osoby chorej i zdrowej

• Gdy rodzicami są dwie osoby „normalne” pod względem wzrostu to w ich rodzinie nikt nie choruje- cecha dominująca nie ma nosicielstwa bez zmian genotypowych.

Gdy cechy determinowane są przez więcej niż jeden gen, mówimy o odziedziczalności i wtedy możemy tylko szacować ryzyko, a nie być pewnym, że ryzyko jest 50% czy 25% w przypadku genu recesywnego. Odziedziczalność dotyczy ogromnej liczby chorób, w tym takich jak schizofrenia, w której czynnik dziedziczny też na pewno odgrywa ważną rolę.

Odziedziczalność w przypadku raka szyjki macicy i raka prostaty jest znacząca. Każdy, którego bliski zachorował powinien poddać się badaniom diagnostycznym, w wieku 10 lat wcześniej niż ten jego bliski zachorował.

Do chorób takich jak schizofrenia nie ma dobrych testów diagnostycznych, ale tego typu choroby tez są dziedziczne.

Mendel i te osoby, które zajmowały się dziedziczeniem, wybierali takie cechy, które dziedziczą się niezależnie i stąd możliwe ustalenie zasad dziedziczności. Nie wszystkie cechy mogą dziedziczyć się niezależnie- więcej genów niż chromosomów.

Geny sprzężone

Morgan wprowadził pojęcie „genów sprzężonych”, żył w czasach, gdy znany był przebieg mejozy. Jeśli gen A i B leża na tym samym chromosomie to mają tendencją do przekazywania się wspólnego. Krzyżówka:

• Dwugenowa, homozygota dominująca z recesywną

• Potomstwo jednorodne fenotypowo

• Żeby sprawdzić czy geny są srzężone- należy wykonać krzyżówkę testową: skrzyżować podwójną heterozygotę z podwójną homozygotą recesywną

• Jeden osobnik wytwarza 4 rodzaje gamet. Gdyby były one niesprzężone to ich częstość byłaby 0,25 (każdego), bo zgodnie z II prawem Mendla geny warunkujące różne cechy segregują losowo do gamet. Drugi osobnik wytwarza jeden rodzaj gamet i krzyżówki powstają 4 klasy osobników. Jeżeli geny są niesprzeżone to proporcja osobników będzie 1:1:1:1. Jeśli są sprzężone to gamety aB i Ab mogą powstać wyłącznie, gdy zajdzie crossing- over - gdy chromosomy pękną między genami. Morgan proces pękania nazwał crossing- over. Miejsce, które zajmuje gen na chromosomie to lotus (l.mn. loci). Częstość crossing- over jest funkcją odległości między miejscami, jakie te geny zajmują na chromosomie. Loci A i b są bardzo blisko siebie, to praktycznie nie ma szans na to by powstały gamety zrekombinowane aB. Jeżeli te geny są daleko od siebie to geny będą segregować niezależnie. Jeżeli odległość jest większa niż 0,25 to tak jakbyśmy mieliło czynienia z genami segregującymi niezależnie.

• Czy geny są sprzężone czy nie poznamy, jeśli w krzyżówce użyjemy 3 genu- marker, który pokaże, że jeżeli A jest sprzężone z C i C z B, to wszystkie te geny są na jednym chromosomie.

• Na to, że pękanie chromosomów zachodzi miano w dawnych czasach dowody cytologiczne: obserwowano chiazmy w czasie mejozy

Mapy chromosomów

Dzięki odkryciu Morgana, że geny sprzężone maja tendencję do wspólnego przekazywania można mówić o tym, że odległość między genami A i B jest 10 morganów/ jednostek mapowych/ procent (jeśli jest 10 % rekombinantów). Miary odległości lub % rekombinacji- procent powstawania zrekombinowanych gamet i osobników można było, robiąc liczne krzyżówki, zrobić mapy chromosomów:

• Zaznaczono pozycje poszczególnych genów i odległości między nimi w % crossing- over

Takie mapy sporządzono dla wielu organizmów, Drosophila była organizmem modelowym; ale też zbóż, ziemniaków, tych organizmów, które miały znaczenie dla człowieka ze względów gospodarczych. Dzięki temu możliwe było wyhodowanie rośliny, która skupiła właściwości takie jak: krótkie źdźbło, dużo nasion, odporność na rdzę.

Żeby zrobić takie krzyżówki potrzebna jest wiedza w którym chromosomie jaki gen jest zlokalizowany. Można było w krzyżówkach z jednej odmiany wyciągnąć cale chromosomy do innej.

Mapy genetyczne w przypadku organizmów dla których jest znana pełna sekwencja DNA staja się anachroniczne. Te organizmy to: kilkadziesiąt bakterii, dużo wirusów, człowiek, szympans, mysz, Arabidopsis, nicień, szczur, pies.

Mapy genetyczne są znane dla wszystkich zwierząt, które kiedykolwiek były przedmiotem badań genetycznych, a w szczególności wszystkich roślin i zwierząt hodowlanych.

Mamy dobrze opracowane techniki przenoszenia genów, np. u roślin- wtedy nie posługujemy się krzyżowaniem roślin, ale wprowadzaniu wyodrębnionych genów do określonej rośliny, w której chcemy zakumulować ilość korzystnych cech. Najbardziej transgeniczna roślina- złoty ryż- dla krajów wschodniej Azji, jest w niej żelazo i witamina A (nie ma teraz tak dużej ślepoty w Azji).

Mapy fizyczne genów- lokalizację genu można wyznaczyć fizycznie, np. że jest na początku, na końcu chromosomu, przy centromerze, itd. Jest to możliwe kilkoma technikami:

• Ograniczona do niewielkiej liczby organizmów, ale aktualna w przypadku Drosophila, gdy mamy do czynienia z chromosomami poligenicznymi. U Drosophila w śliniankach chromosomy ulegają powieleniu (replikacja DNA), ale nie rozchodzą się, są skondensowane w postaci wstęg, nici DNA ułożone obok siebie- widoczne jasne i ciemne prążki. W przypadku mutacji, które polegają na wypadnięciu fragmentu chromosomu, możemy zauważyć, że jakaś cecha wiąże się z z brakiem konkretnego prążka. Można fizycznie przypisać do chromosomu locus danego genu.

Gdy mapujemy geny wirusów to możemy obejrzeć DNA wirusa pod mikroskopem elektronowym i można porównać wygląd DNA normalnego wirusa i DNA mutanta. Jeśli rozpleciemy nici DNA obu wirusów i zrobimy hetero duplex to pod mikroskopem elektronowym tylko można to DNA porównać. Mapa restrykcyjna- enzymy rozpoznają i przecinają określone miejsce w DNA. Dzięki temu mamy całą mapę fizyczną jakiegoś odcinka DNA, gdzie SA zaznaczone poszczególne miejsca restrykcyjne dla różnych enzymów restrykcyjnych.

Gdy mamy mapy genetyczne to mamy do czynienia z umownymi jednostkami, a w przypadku sekwencji mamy do czynienia z parami nukleotydów jako miarą odległości, to samo w przypadku mapy restrykcyjnej.

Organizmy haploidalne:

• Krótki okres cyklu życiowego, kiedy są diploidalne

• Prosta analiza genetyczna- jeżeli krzyżujemy osobnika o 2 cechach AB z osobnikiem o cechach ab to w którymś momencie nastąpi stadium diploidalne: od razu dochodzi do mejozy i haploidyzacji

• Tu tez można obserwować czy SA sprzężone czy nie i na podstawie wyników konstruować mapy genetyczne

• Nie ma dominacji i recesywności

• Żeby zbadać czy gen jest dominujący czy recesywny musimy doprowadzić do stałej diploidyzacji (do zrobienia u grzybów)

Badanie rekombinacji jest możliwe u wszystkich organizmów gdzie jest cos w rodzaju rozmnażania płciowego (płciowego bakterii koniugacja). Badanie rekombinacji u wirusow polega na tym, ze zakażamy jedna komórkę dwoma rodzajami wirusów: jeden ma AB a drugi ab (zwykle jest to kształt łysinek). Wirusy się namnażaja powstaje kilkadziesiąt potomnych cząsteczek obu wirusów, rekombinują się miedzy sobą. Szukamy liczby wirusów zrekombinowanych.

Wyniki krzyżówek można traktować jako test na to czy dwa geny, dwie mutacje SA alleliczne czy nie (czy zaszły w tym samym genie czy w różnych genach). Drosophila o białych oczach - mutacja mogła zajść w wielu genach, nie wiemy gdzie, bo szlak syntezy barwnika jest bardzo długi. Żeby dowiedzieć się czy mutacja jest alleliczna robimy test na komplementacje- krzyżujemy mutanta a1 z mutantem a2 (oba maja białe oczy)

Albo otrzymamy muchę o czerwonych oczach albo o białych. Zakładamy, ze to mutacje recesywne. Jeżeli SA to mutacje w tym samym genie to ten zapis krzyżówki jest prawidłowy. Jeśli SA to mutacje w dwóch różnych genach to drugi zapis → otrzymamy heterozygote** (osobnik heterozygotyczny pod względem obu genów). Jeżeli mutacje były w tym samym genie to to co otrzymamy będzie nadal heterozygota=> to jest test na komplementacje

U grzybów można uzyskać formy diploidalne i patrzeć czy taka komplementacja tez zachodzi. U bakterii drugi gn można wprowadzić na plazmidzie lub wirusie i badać czy geny się uzupełniają (komplementują) czy nie. Często ta informacja jest bardzo przydatna. Inny sposób uzyskania odpowiedzi na to gdzie jest mutacja to praco i czasochłonne selekcjonowanie mutanta. Krzyżówki dają odpowiedzi szybka tania i bardzo precyzyjna. Stad wniosek ze genetyka klasyczna jest bardzo przydatna.

Mutacje

Analizę genetyczna można przeprowadzać gdy mamy do czynienia z mutacjami. Mutanty SA otrzymywane spontanicznie lub indukowane. Mutacje dzieli się na liczne kategorie ale dwie główne to:

• Genowe

• Chromosomowe

Genowe dotyczą określonych genów: tranzycie, transwersje, podstawienia.

Chromosomowe- zmienia się struktura lub liczba chromosomów. Na przykład:

• Większość drzew owocowych to rośliny poliploidalne, pszenica jest heksaploidalną:

1. Lepsze większe plony

2. Wybierano rośliny z większymi ziarnami

3. Pierwotna trawka z Azji mniejszej (pszenica) miała pojedynczy garnitur chromosomowy

• U roślin poliploidyzacja jest bardzo częsta

• U zwierząt poliploidyzacja jest bardzo zadka

• U człowieka : chłopiec w Szwecji triploidalny dożył do kilkunastu lat

• Zmiany w liczbie chromosomow u człowieka maja bardzo powazne konsekwencje

• U ssaków nie spotyka się poliploidyzacji ale spotyka się mutacje dotyczące pojedynczych chromosomów: dodatkowy chromosom( trisomia), brak chromosomu (monosomia). Takie mutacje u roślin SA tez często spotykane, u zwierząt rzadkie. U ludzi sporo takich przypadków.

• Mongolizm, zespól Downa- dodatkowy chromosom w 21 parze

• Zespół Tunera- u kobiet, dodatkowy X

• Jest względnie dużo mężczyzn którzy maja dodatkowy Y (XYY). Kiedyś była hipoteza ze dodatkowy Y sprawia ze mężczyzna staje się super agresywny, nawet kogo dzieki temu uniewinniono, ale to nie prawda- popełniono blad metodologiczny -> u Irlandczyków dodatkowy Y częstszy niż u Anglików.

Wiemy na czym na poziomie molekularnym polega crossing-over. Znamy wszystkie enzymy które są potrzebne do przecięcia nici DNA i połączenia. DNA w jednym chromosomie może liczyć 100 milionów nukleotydów. Nici musza się ułożyć koło siebie w profanie I podziału mejotycznego, przecięcie i połączenie powrotne musi być bardzo precyzyjne. Nici musza pęknąć dokladnie w tym samym miejscu, musi tam nastąpić odtworzenie wiązania fosfodwuestrowego. Znane są tez mechanizmy molekularne mutacji.

Na DNA oddziałują i wywołują zmianę z protoonkogenu na onkogen:

1. Palenie

2. Solarium

Genetyka z inżynierią genetyczną D/Wykład 3

Rekombinacja

• Wymiana genów które znajdują się w różnych miejscach na chromosomie, miedzy chromosomami

• Podstawa zmienności genetycznej

Proces ten odkrył Morgan

Opis:

Mamy 2 chromosomy z dwiema chromatydami i w trakcie mejozy dochodzi do rekombinacji: pęknięcia i wymiany na krzyż chromatyd. Jest to podstawa zmienności wewnątrz gatunku- tasowanie genów i łączenie w różnych kombinacjach.

Jeden robak (Ascaris) ma jeden chromosom- pozostałe organizmy maja więcej chromosomów. Wtedy dodatkowa zmienność odbywa się przez tasowanie genów znajdujących się na różnych chromosomach. Segregacja w mejozie. To, który chromosom trafi do którego bieguna jest kwestia przypadku. Rekombinacje wykorzystano do mapowania genów, tworzenia map genetycznych. Założono, ze częstość rekombinacji jest funkcja odległości, jakie loci genów na chromosomach zajmują. Na tej podstawie stworzono mapy genetyczne wszystkich możliwych organizmów.

Mapy genetyczne robi się za pomocą krzyżówek trzypunktowych. Badamy jednocześnie segregacje trzech genów, w przypadku organizmów diploidalnych takie segregacje badamy w krzyżówkach testowych: potrójna heterozygota i homozygota recesywna. Osobnik produkujący tylko gamety recesywne nie zmieni fenotypu potomstwa. Fenotypy potomstwa będzie taki jak fenotyp gamet. Potrójna heterozygota wytwarza 8 rożnych gamet 2³. Inne gamety mogą powstać w wyniku crossing-over w jednym z 3 rejonów albo w kilku jednocześnie.

Jeśli krzyżujemy potrójna heterozygote z organizmem potrójnie recesywnym, to zazwyczaj nie wiemy jaki jest układ tych genów. Dowiemy się dopiero na podstawie krzyżówki jaki gen jest w środku. Osobnik o fenotypie AbC lub osobnik o fenotypie aBc to osobniki najczęstsze w potomstwie, bo jeśli odległości miedzy genami a i b i c jest 10% prawdopodobieństwo crossing-0over miedzy każda sąsiednia para jest 0,1. jeśli najrzadszą kombinacją byłoby aBC i Abc to wiedzielibyśmy, że gen „A/a” jest w środku, bo w wyniku podwójnego crossig-over tylko środkowy gen zmienia swoja pozycję w stosunku do pozostałych.

Gdyby organizm, którego geny chcemy mapować był haploidalny to sprawa jest prosta.

abc x ABC

Po mejozie dostajemy od razu 8 kombinacji.

Gdyby geny były niesprzężone, leżały w różnych chromosomach to 8 rodzajów osobników powstawałaby z jednakowa częstością i wszystkie klasy potomstwa byłyby rowne. Jeśli geny są sprzeżone to najczęściej powstają organizmy, w których nie dochodzi do rekombinacji a liczebność poszczególnych klas jest zależna od yego, jak daleko od siebie geny leżą na chromosomach.

Chromosomach wyniku krzyżowania organizmów możemy uzyskać mapę genetyczną. Mapa genetyczna nie musi być do końca zgodna z mapa fizyczną. Mapa fizyczna to taka, gdzie możemy określić pozycję genu na chromosomie jakąkolwiek metoda fizyczną, np. przez oglądanie chromosomów olbrzymich u Drosophila, gdzie widać prążki i można połączyć delecję z brakiem konkretnego genu czy mutacją. Może tez być mapa restrykcyjna czyli mapa rozkładu miejsc trawionych przez enzymy restrykcyjne na nici DNA. Ultymatywną mapa genetyczną jest pełna sekwencja chromosomów. Jeżeli znamy pełną sekwencję DNA ( a znamy ja już u kilkudziesięciu organizmów) to możemy określić, gdzie są poszczególne geny, gdzie są otwarte ramki odczytu DNA i wiedzieć jakie jest położenie genów.

Gdy porównamy mapę genetyczna z mapa fizyczną to układ genów na chromosomie jest identyczny, ale odległości nie zawsze muszą być proporcjonalne- preferencja chromosomie pękaniu nici DNA. Mapowanie przez krzyżowanie jest możliwe tam, gdzie jest mejoza i proces płciowy. Cały sens rozmnażania płciowego to możliwość występowania rekombinacji. W rozmnażaniu wegetatywnym nie ma mowy o rekombinacji. Rekombinacja daje gatunkom szansę na zwiększenie różnorodności i powstawania genów, które są bardziej korzystne w danym środowisku. Rekombinacja zachodzi u wszystkich organizmów, nawet tam, gdzie nie ma mejozy, np. bakterie, wirusy. U bakterii późno wykryto procesy płciowe (Francuzi)-koniugację.

U bakterii:

Koniugacja bakterii tez może być wykorzystywana do mapowania genów, ale na innej zasadzie niż tam, gdzie występuje mejoza. U bakterii są 3 procesy pozwalające na mapowanie genów i robienie map genetycznych:

• KONIUGACJA- bakterie przekazują swój chromosom do drugiej bakterii i dochodzi do rekombinacji

• TRANSDUKCJA- materiał genetyczny jednej bakterii może być przeniesiony do drugiej za pomocą bakteriofagów

• TRANSFORMACJA- materiał genetyczny z jednej bakterii przechodzi do drugiej bez żadnego wektora, bez żadnego pośrednika- tylko gołe DNA, DNA jest pobierane przez inne bakterie, np. bakterie z rodzaju Hemophilus bardzo łatwo pobierają DNA ze środowiska. U innych bakterii, jak E. coli ten proces trzeba wymusić- pomoczyć bakterię w roztworze soli. Proces transformacji też może być wykorzystany do badania rekombinacji.

Gdy DNA przejdzie do drugiej bakterii to dochodzi do rekombinacji. Wprowadzony fragment DNA musi odnaleźć u bakterii swój odpowiednik→ homologiczny DNA w tej drugiej nici. Zachodzi wtedy crossing-over. Fragment z jednej bakterii jest włączany do materiału genetycznego drugiej bakterii. Mechanizm tego crossing-over jest taki sam jak u wszystkich innych organizmów. Są takie bakterie, które są biorcami biorcami takie, które są dawcami DNA. Dawcy maja plazmid (episom)- mała cząsteczka DNA, również kolista, w której znajduje się niewielka ilość genów.

Jednym z episomów jest czynnik F (plazmid, cząsteczka replikująca się niezależnie od chromosomu). W tej cząsteczce znajdują się geny potrzebne do tego, aby zaszedł proces koniugacji. Na plazmidzie plazmidzie jest kilkanaście genów, w tym geny odpowiedzialne za transfer chromosomów z jednej bakterii do drugiej i transfer samego plazmidu. Gdy dochodzi do koniugacji bakterii to muszą powstać kanaliki między dwoma bakteriami (pili- kanaliki)przez które przechodzi DNA.

Dawcami DNA są bakterie F⁺ , które mają plazmid. Gdy dojdzie do wytworzenia kanalików to tym, co się przemieszcza jest właśnie czynnik F⁺ . w wyniku koniugacji bakterie biorcy stają się komórkami F⁺.

W niektórych przypadkach-szczepy Hfr- plazmid F jest wmontowany w chromosom. Przekazują one DNA dużo większą częstotliwością niż te bez plazmidu F. Chromosom pęka obok miejsca integracji plazmidu i przekazywany jest chromosom bakteryjny. Następuje rozplecienie podwójnej spirali i przekazanie do drugiej bakterii fragmentu DNA, po czym integracja tego fragmentu do chromosomu bakterii biorcy.

Proces przekazywania chromosomu dawcy do chromosomu biorcy w szczepach Hfr jest procesem takim, że pęknięcie jest tuż obok miejsca integracji plazmidu i później przekazywany jest chromosom, tak , że czynnik F jest na samym końcu. Wobec tego bardzo rzadko bakterie biorcy stają się F⁺, dlatego, że po to, aby był przekazany cały chromosom dawcy do baterii biorcy potrzeba 90 minut, a dość trudno jest utrzymać bakterie koniugujące w kontakcie przez tyle czasu. Dlatego zwykle przechodzi tylko fragment chromosomu.

Jeśli bakterie koniugujące różnią się jakimiś genami, np. dawca jest mutantem i wymaga do wzrostu tryptofanu to można zrobić doświadczenie nad koniugacja przerywaną: zmieszać Hfr z F^- i doprowadzić do tego, żeby zaszła koniugacja, przerwać ja po 5/10/15 min. i zobaczyć, które geny w tym okresie trwania koniugacji mogły być przekazane. To przerywanie koniugacji odbywa się przez wstrząśnięcie naczyniem, w którym mamy hodowle bakterii. Badając czas przekazywania genów możemy określić, który gen jest bliżej a który dalej początku chromosomu. Na tej zasadzie możemy sporządzać mapy genetyczne (zwłaszcza E. coli i innych Enterobacteriacae). Na takich mapach odległości między genami to minuty→ fizyczny czas przejścia genu z jednej bakterii do drugiej (różnica w czasie przekazywania genów).

Analizując ułożenie genów nie wiemy często mimo wszystko jakie to białko pełni funkcję w organizmie. Gdy wyizolujemy mutanty możemy genom przypisać ich funkcję. Trasdukcja i transformacja to dwa główne sposoby mapowania genów u bakterii.

Transdukcja nieograniczona- fag namnaża się w komórkach bakterii i w trakcie namnażania powiela się materiał genetyczny, DNA tego wirusa, tworzony jest kapsyd→ wszystkie te etapy można przeprowadzać in-vitro osobno. Gdy fag namnaża się w bakterii, prowadzi to do zniszczenia jej, m.in. do degradacji DNA bakteryjnego. Fragmenty tego DNZ mogą być otaczane płaszczem białkowym wirusa i zamiast DNA wirusa przechodzić do następnych komórek. Gdy takie DNA wniknie do komórki, to komórka nie ulegnie zniszczeniu (lizie), bo nie ma genów wirusowych, ale zostaje wprowadzony nowy fragment DNA, który może ulec (jeżeli zajdzie rekombinacja) włączeniu do materiału genetycznego bakterii (przenoszenie różnych cech np. zdolność do syntezy laktozy).

Trasdukcja ograniczona- np. w przypadku bakteriofaga λ, który jest dosyć dobrze znanym modelem do badań genetycznych. Fagi takie jak λ maja zdolność do integracji z chromosomem gospodarza. Gdy infekuje komórki bakterii to ma przed soba 2 możliwe drogi życiowe:

• Namnożyc się i zniszczyć komórkę, wyprodukować cząstki potomne, zakazić następną komórkę → cykl lityczny (lizuje bakterie)

• DNA faga jest integrowane zDNA bakterii, fag staje się profagiem i od tego czasu jego geny są zablokowane, materiał genetyczny faga jest powielany razem z materiałem genetycznym baterii i taka koegzystencja może trwać przez wiele podziałów bakteryjnych.

Bakteria: ok. 10 000 genów fag: ok. 50 genów. Jeśli fag zostanie włączony, to jego wycięcie może być nie całkiem dokładne- może wyciąć się tak, redo genomu faga zostanie dołączony jakiś gen bakterii. Po zainfekowaniu kolejnej bakterii ten dodatkowy gen (razem z gnomem faga) może być włączony do chromosomu.

Fagi mają preferencje jeśli chodzi o wlączanie się do genomu bakterii. Dlatego zwykle przenoszą 1, najwyżej 2 geny.

Transdukcję można też wykorzystać do mapowania genów- miarą odległości pomiędzy genami jest częstość, z jaką dwa geny są jednocześnie przekazywane z jednej komórki do drugiej. Założenie: geny blisko siebie to większa szansa, że znajda się na tym samym fragmencie DNA, który będzie włączony w genom faga i później przeniesiony i włączony w genom bakterii.

Transformacja- DNA przechodzi bez udziału faga. Gdy jest wykorzystywana do mapowania to miarą odległości jest częstość z jaką dwa geny są przenoszone z jednej bakterii do drugiej. Zwykle przy transformacji do bakterii wnikaja niewielkie fragmenty DNA, zwykle dwa sąsiednie geny.

Proces koniugacji słuzy mapowaniu genów zgubnie. Aby mapować geny małego odcinka używamy transdukcji lub transformacji.

Gen nie jest jednostką rekombinacji, bo zachodzi ona między cząsteczkami DNA i pękniecie nie musi zachodzić dokładnie między genami pojedynczymi.

Możemy mapować miejsca mutacji w obrębie genu.

Mapa genetyczna faga T4- bardzo popularny rysunek.

Jedna z mutacji polega na tym, że fag nie jest zdolny rosnąc na szczepie E. coli β a rośnie na szczepie κ . Doświadczenie to wykonał Benzen- zrobił liczne mutacje, krzyżował ze sobą formy χ faga i tam gdzie zaszła mutacja - powstawała forma dzika i fag rósł na E. coli β.

Stosując mutacje, rekombinacje można badać odległość między genami i miejscami mutacji.

Żeby badać tak rzadkie rekombinacje trzeba badać organizmy, gdzie jest ogromna ilość potomstwa (a nie myszy czy ludzi), bo te mutacje i tak zdarzają się rzadko- raz na 1000, na 10 000. Poza tym stosujemy jakiś system selekcji: np. krzyżujemy dwa osobniki arg^- na pożywkę bez argininy. Wyrosną tylko te, gdzie nastąpiła rekombinacja pomiędzy dwoma mutacjami genie warunkującym zdolność do wzrostu bez argininy.

Hot-spots- miejsca, które wyjątkowo często mutują

Testy:

Test na rekombinację nie mówi o tym, czy zmutował 1 czy 3 geny. Mówi o tym test komplementarny (a nie komplementacji????), na uzupełnienie się mutacji.

Można zarazić 2 fagami 1 komórkę bakterii. Kombinacja dwóch wirusów może być zdolna do wzrostu, albo mogą powstać funkcjonalne cząstki fagowe w komórce bakterii→ wtedy, gdy fagi wzajemnie się uzupełniają i potomek ma komplet tego, co może być mu potrzebne.

Test uzupełnienia- kompletację możemy zrobić na dowolnym układzie. Trzeba skrzyżować podwójną heterozygotę (w przypadku organizmów diploidalnych) diploidalnych zobaczyć czy mutacje się uzupełniają czy nie.

W przypadku haploidalnych organizmów- trzeba zrobić coś, jak heterokarion, aby w jednej komórce znalazły się dwa allele zmutowane i sprawdzić czy się uzupełniają czy nie.

W przypadku bakterii jeden gen mamy na chromosomie, a drugi wprowadzony na plazmidzie.

To też jest metoda analiz genetycznych. Test na komplementację pozwala ocenić czy mutacje zaszły w tym samym czy w dwóch różnych genach.

Test na rekombinację nie odpowie na pytanie czy mutacja zaszła w tym samym czy w dwóch różnych genach. Jeśli mutacje zaszły na skrajach sąsiednich genów to nie będzie sposobu, aby to odróżnić. Ale jeśli w wyniku mutacji 2 organizmów powstały 2 nowe fenotypy to prawie na pewno mutacje dotyczą różnych genów. Jeśli jest mała częstość rekombinacji to też mamy do czynienia z różnymi genami.

Analiza genetyczna doprowadziła do tego, że nie tylko możemy mapować geny, badać zależności miedzy nimi (czy jeden gen znosi efekty działania drugiego- supresja), ale zrozumieć jak działa gen.

Dużo informacji o działaniu genu dostarcza nam obserwacja czy mutacja jest dominująca czy recesywna.

Genetyka coraz bardziej opiera się na analizie na poziomie DNA.

Genetyka molekularna

Od roku 1940 wiemy, ż materiałem genetycznym jest DNA. Jest też materiałem dziedzicznym.

Griffith zrobił doświadczenie:

- z zabitych bakterii „ coś” przechodziło do żywych i zmieniało ich cechy.

Kolejni badacze stwierdzili, tym „czymś” jest nie białko lecz DNA.

Później były doświadczenia z fagami: fag infekuje bakterię, białko zostaje na zewnątrz, do środka wnika kw. nukleinowy i bakteria się zmienia, może nabyć jakieś cechy w wyniku transdukcji. Nabycie nowej cechy wiąże się z przeniesieniem DNA do organizmu.

Możemy zsyntetyzować DNA o konkretnych konkretnych właściwościach. Prawdopodobnie niedługo będzie można zsyntetyzować pełny genom wirusa.

Prawdopodobnie niedługo zsyntetyzowany będzie genom Micrococcus influenze - najmniejszy genom ze wszystkich bakterii → synteza chemiczna.

Chcą zobaczyć jakie jest minimum potrzebne aby taka bakteria istniała, które geny są niezbędne. Co bakteria musi syntetyzować a co może pobrać.

Genomy żywych organizmów - wynikają z ich wielkości możliwości organizmu (adaptacyjne, funkcjonowania w środowisku). Zależność nie jest prostoliniowa, jest dużo wyjątków.

1) Wirioidy 2x10 - kształt porozgałęziany, bogata struktura II- rzędowa (!!!!!)

• Genom RNA kolisty

• Nie ma żadnej informacji genetycznej, otwartej ramki odczytu, która umożliwiałaby syntetyzowanie peptydu

• Gdy taka cząsteczka dostanie się do plantacji palmy kokosowej to czyni ogromne spustoszenie → wirioid „chory chory” (Cadank Cadank)

• W naszej strefie klimatycznej jest wirioid powodujący wrzecionowatość bulwy ziemniaka → 20 - 40% strat w hodowli

• Cząstka, która potrafi wykorzystać aparat enzymatyczny komórki gospodarza i namnożyć się tak, że przestawia metabolizm na produkcję cząsteczek potomnych

• Być może jest to pozostałość świata DNA gdy jeszcze nie było RNA 3 mld lat temu - pierwsze w „zupie” były cząsteczki RNA, które miały zdolność przetrwania

2) Wirus T4 1,6 x 10 (!!!!)

• Wirus ( ?????), bakteriofagi

• Są wśród bakteriofagów genomy dnowe i rnowe , mieszane - jak u retrowirusów: cząstka wirusowa zawiera materiał RNA ale w cyklu życiowym RNA jest przepisywana na DNA i syntetyzowany z gnomem gospodarza - wtedy zachodzi transkrypcja, produkowanie RNA, które trafia do białek i tworzy się nowa cząstka wirusowa

• Retrowirusy: większość onkogenicznych, HIV, zazwyczaj trzygenowe

• Witusy RNowe też są malutkie, po 3-4 geny

• Wirusy DNowe (SV40, wirus żółtaczki) - nieduże wirusy

• Są też wirusy o bardzo dużych genomach, np. wirus krowianki, wirus ospy, które mają genomy po ponad 1000genów

3) E. coli 4,2 x 10 (!!!!!!!!!!)

• Genom przeciętnej wielkości w świecie bakterii

4) Drożdże 2 x 10 (!!!!!!!!!!)

• Eukarionty

• Między prostymi eukariontami a bakteriami nie ma przepaści

5) C. elegans (t) ;) 8 x 10 (!!!!!!!!!!!!)

• Nicień ( a to nowość…. Ech! Panie (z)Węgleński…)

6) Drosophila 1,4 x 10 (!!!!!!!!!!)

7) Mysz 3 x 10 ((!!!!!!!!!!!)

8) Człowiek 3,3 x 10 (!!!!!!!!!!!!)

Genomy muszy, człowieka, szympansa są to jedne z większych genomów.

Rośliny liliowate mają genom znacznie większy, ale poliploidalny, płazy też mają b. duże genomy - mają w genomach dużo fragmentów nie kodujących niczego, dużo sekwencji powtarzających się

• Junk DNA - DNA śmieciowy

• Są różne teorie do czego służą sekwencje nie powtarzające się, niczego nie kodujące

• Nie mają nawet sensu regulacyjnego - nie wiążą się tam czynniki traskrypcyjne

• Być może do tego aby chromosomy właściwie fałdowały w mejozie

• Może z tego DNA następuje ewolucja, powstawanie nowych genów

Człowiek i mysz - gdyby wszystko kodowało białka to mielibyśmy ogromnie długie peptydy.

Człowiek ma tylko ok. 30000 genów, więc DNA ma duży nadmiar. Są w tym sekwencje regulacyjne. Duża część naszego DNA - taki jak innych organizmów jest nadmierna i nie koduje niczego.

Wyjątki:

Są wyjątki np. DNA mitochondrialne

• Niesłychanie oszczędnie wykorzystywane

• Kodon stop poprzedniego białka rozpoczyna już białko następne

U niektórych wirusów kod genetyczny jest tak upakowany, że dany odcinek DNA jest 3 genami naraz: w 3 różnych fazach odczytu są produkowane 3 różne białka.

U jednych organizmów jest oszczędność DNA, u innych jego nadmiar.

Model budowy DNA zaproponowali Watson i Crick. Replikacja DNA w postaci dwuniciowej cząsteczki.

Łańcuchy DNA są połączone wiązaniami wodorowymi w parach A-T i G-C (litośi….:/ )

Tyle samo A i T oraz G i C - ustalono na podstawie badań, pomiarów Shorgafa (???) ( Nie pytajcie o nic… Też byście tego nie przeczytali…:/ )

Watson i Crick korzystali z wyników wielu różnorodnych badań przy wyciąganiu swoich wniosków. Jako trzeci Nobla z nimi dostał Wilkins - robił rentgenografię cząsteczek DNA i z obrazu rentgenowskiego wynikała spiralna struktura cząsteczki DNA.

Esencja życia:

Cząsteczka DNA jest matrycą dla cząsteczki ńą następnej, powiela się tak samo (leży to w modelu Watsona i Cricka, pary AT i GC)

Watson i Crick, mimo iż nie za bardzo mieli ku temu podstawy twierdzili, że replikacja DNA jest semikonserwatywna - nici się rozplatają i każda z nich dobudowuje swoją kopię komplementarną ale to już wiecie dzieciaczki…;)

Druga możliwość była taka, że replikacja jest konserwatywna: mamy dwie nici DNA i na nich powstają dwie nowe nici. Czyli po replikacji mamy jedną podwójną nić starą i jedną podwójną nić nową.

Semikonserwatywność doświadczalnie wykazali ?????????/? i Stall w doświadczeniu:

• Wyznakowali cząsteczki DNA ciężkim azotem, usunęli nadmiar ze środowiska, replikowali takie cząsteczki i je ważyli poprzez wirowanie w gradiencie chlorku cezu

• Wykazali, że po 1 replikacji cząsteczki są lżejsze niż przed replikacją, później powstają cząstki całkowicie lekkie → jest generacja cząstek z 1 łańcuchem ciężkim i 1 lekkim

DNA jest w chromosomach (u organizmów wyższych) opakowany białkami. Podczas replikacji musi być związany z przebudową, rekonstrukcją chromatyny, syntezy białek histonowych i dołączania się nowych cząsteczek. Zwykle replikacja wiąże się z podziałem komórkowym (u organizmów wyższych tak samo jak u bakterii). Jedynie u wirusów proces replikacji jest właściwie czystą syntezą.

Genetyka z inżynierią genetyczną D/Wykład 4

Nokaut

Nokauty genetyczne - unieczynnienie pewnych genów w organizmie.

Transformuje się komórki określonym genem. Jeśli chcemy zmutować, uszkodzić jakiś gen to klonujemy na wektorze ten sam gen, jego fragment, ale tak, aby w środku niego było coś innego - jakiś fragment wstawionego obcego DNA. Najczęściej jest to fragment zawierający marker. Dzięki temu można wykryć transformowane komórki. Po hybrydyzacji będzie pętelka z tego wprowadzonego fragmentu. Jeśli zajdzie tu crosing over to ten gen zostanie zamieniony przez zmutowany gen. W ten sposób można doprowadzić do mutacji genów. Można to robić na komórkach, organizmach, na kom. jajowych myszy - gdy chcemy mieć cały organizm zmutowany. Takie myszy transgeniczne są modelami dla ludzkich chorób, służą do prób terapii.

Ukierunkowaną mutagenezą nie tylko uszkadzamy jakiś gen, ale wprowadzamy w nim bardzo konkretna zmianę, np. gdy chcemy mieć w białku w konkretnej pozycji inny aminokwas. Gen musimy sklonować na wektorze (wygodne SA te występujące w postaci jedno- lub dwuniciowej). Jeśli mamy gen sklonowany na wirusie (otrzymujemy formę jednoniciową), to możemy zsyntetyzować bardzo krótki fragment DNA, który hybrydyzuje, ale w jednym miejscu różni się od wyjściowej sekwencji (mish - mash)→niepasująca zasada. Używamy tego fragmentu jako primer do syntezy drugiej nici. Powstaje nam plazmid który ma w jednym miejscu niedopasowana zasadę . W replikacji powstaną cząsteczki DNA ze zmienioną parą zasad. Gdy już mamy sklonowany taki gen to zastępujemy nim ten, który wcześniej występował.

Badamy w ten sposób znaczenie poszczególnych sekwencji DNA. Dzięki takim technikom można prowadzić inżynierię białek: poszukiwanie białek o trochę innym składzie aminokwasowym, a przez to innych właściwościach. Łatwiej zamienić zasady w DNA niż aminokwasy w białku.

Dzięki klonowaniu genu otrzymuje się wiele kopii odcinka DNA i można go zsekwencjonować, a ustalenie sekwencji to podstawa do wszystkich dalszych badań.

Sekwencjonowanie genów

Zaczęto od metody Maxama Gilberta. Prowadzono 4 reakcje traktując Dna związkami chemicznymi które przecinały nic DNA zawsze :

1. Za G

2. Za G i A

3. Za T i C

4. Za T.

Po trawieniu losowym, zdegradowany DNA puszczano na żelu i otrzymywano fragmenty w poszczególnych kolumnach i wiadomo było, że w danej kolumnie są np. fragmenty przecięte za G. wszystkie cząsteczki DNA były wyznakowane radioaktywnie na końcu 5' - po trawieniu i puszczaniu na żel można było wykryć znakowane fragmenty - wiadomo było gdzie jest koniec. Z takiego żelu można było odczytać sekwencję (można się było tak przyjrzeć tym fragmentom, wiedząc co maja na końcach, że wiadomo było co jest po czym). Używa się do tego dużych szklanych płyt z żelem w środku.

Po tej metodzie bardzo szybko opracowano kolejną. Nie degradowano DNA chemicznie, ale użyto dideoksynukleotydów, które jeśli zostaną włączone do DNA to następuje terminacja syntezy - nie posuwa się ona dalej. W 4 probówkach były matryce, starter pasujący do 5' końca (wyznakowany radioaktywnie). Rozpoczynano syntezę. Do każdej probówki dodawano w pewnej proporcji dideoksy A, G, T, i C. wiadomo na jakiej literce w danej probówce ustawała synteza. W każdej probówce była przewaga normalnych nukleotydów. Po puszczeniu na żel wiemy które fragmenty kończą się na jakiej literce i dodatkowo który jest dłuższy. W każdej probówce wiele klonów, więc mamy wiele fragmentów, które skończyły się na danej literce, ale w różnych miejscach.

Teraz w pracowniach jest mechaniczne sekwencjonowanie w automatach: przepuszcza się produkty takich reakcji jak wcześniej przez kapilary, z których kapią fragmenty, a każdy jest dłuższy o 1 nukleotyd.

Każdy z dideoksynukleotydów jest wyznakowały innym barwnikiem fluorescencyjnym. Detektor wykrywa różnice pomiędzy fragmentami zakończonymi na poszczególne nukleotydy. Koszt w Warszawie - 4€ za sekwencję.

Sekwencjonowanie stało się proste i tanie, wiec idzie się metodą Shotgun - fragmentuje się cały genom, sekwencjonuje wszystkie kawałki, klonuje je losowo na jakimś wektorze i otrzymuje bibliotekę genową. Sekwencjonowanie rozpoczyna się od końca, losowo na wielu plazmidach poznajemy sekwencję małych kawałków (np. 200 nukleotydów). Potem uzyskane dane wrzucamy do komputera, który szuka overlapów (regionów zachodzących). Mamy wiele razy zsekwencjonowany ten sam fragment DNA, ale specjalne programy potrafią wybrać te które są overlaping - nakładające i żeby z tych setek fragmentów ułożyć ciągłe nici, które dochodzą do siebie i żeby odtworzyć pełna sekwencję.

Chemiczna synteza DNA

Zaczyna się od jakiegoś nukleotydu, po czym dołącza się określony drugi. Jest kolejno blokowanie i odblokowywanie, żeby był przyłączany tylko taki nukleotyd jaki dodajemy, który ma odpowiednie grupy czynne potrzebne do tworzenia wiązania fosforowego.

Wpierw zsyntetyzowano kawałek operonu laktozowego, później krótkie hormony.

Obecnie chemiczna syntezę wykorzystuje się do robienia:

• Starterów

• DNA „chip”

.„chip” DNA

• Pozwala ustalać różnice miedzy „zdrowym” a „chorym” DNA (u ludzi zdrowych i chorych)

• Na szkiełku syntetyzuje się krótki fragment DNA (na calu kwadratowym można doprowadzić do syntezy 60 tys. takich nitek)Kierujemy syntezą określonych nukleotydów na siatce. Dołączane jest regulowane światłem - nukleotydy są dołączane tylko tam gdzie nitka jest naświetlana laserem.

• Gdy chcemy sprawdzić które geny działają u człowieka zdrowego a jakie u chorego to pobieramy RNA z krwi (albo tkanki) i hybrydyzujemy go z takim chipem (zgodnie z komplementarnością zasad). Jeśli jest jakiś messenger który pasuje do tego to się przyczepi. Jest on dodatkowo wyznakowany luminescencyjnie - świeca miejsca do których przyłączy się pasujący messenger. Czytnik laserowy pokazuje które miejsca świecą. My wiemy gdzie syntetyzowaliśmy oligonukleotyd, który jest fragmentem genu na insulinę, gdzie na hormon wzrostu itd.

Cały genom drożdży mieści się na jednej płytce. Dla człowieka potrzeba kilkadziesiąt płytek i po kilka powtórzeń genu dla pewności.

Ustalanie miejsc w DNA z którymi wiążą się białka ze specjalnymi domenami (motywami) wiążącymi

Geny uruchamiane lub hamowane są przez wiązanie z białkami.

A skąd wiadomo, że się wiążą?

→ test spowolnienia migracji w żelu

fragment DNA puszczamy w żelu i patrzymy gdzie się lokuje; w jednej ścieżce puszczamy gołe DNA , a w drugiej białko, które testujemy. Gdy nastąpi spowolnienie migracji to znaczy że się wiąże

→ test pokazujący z którą sekwencją wiąże się białko

sekwencjonujemy fragment DNA: trawimy go jakąś DNazą, endonukleazą w obecności i nieobecności białka. Jeżeli po sekwencjonowaniu na żelu zobaczymy, że czegoś brakuje w obecności białka, a bez białka mamy ciągła linię, to wiemy że tam gdzie biała plama to przyczepiło się białko, więc DNA nie mogło tam być przecięte i dlatego brakuje nam prążków na żelu

U Drosophila są mutanty cech psychicznych: mutanty, które wykazują agresję, mutanty homoseksualne, bardzo nerwowe. Dzięki poznaniu sekwencji i działania genów u Drosophilamożemy łatwiej badać system nerwowy. Wiele mutacji jest związane z oddziaływaniem/nieoddziaływaniem białek z określonymi sekwencjami DNA.

PCR

Technika najczęściej stosowana w biologii (reakcja łańcuchowa polimerazy DNA). Umożliwia powielanie DNA. Bierze się matrycę DNA , trzeba wziąć kawałki komplementarne do sekwencji na końcach danego fragmentu (startery z obu końców) → oligonukleotydy. Przeprowadza się syntezę DNA na tych matrycach w obie strony. Powtarza się to, po pierwszym cyklu mamy 2 cząsteczki z 2, po drugim 4, po trzecim 8 itd. Dzięki temu w krótkim czasie możemy mieć dużą liczbę cząsteczek DNA. Wystarczy tylko mieć matrycę i znać sekwencję krótkich kawałków pomiędzy, którymi będzie zachodzić synteza. Ponad to potrzebna jest jeszcze termowrażliwa polimeraza DNA (Taq z T. aquaticus).

Aby zaszła synteza trzeba podgrzać nici w 90° (i więcej), żeby zaszła denaturacja, dodajemy primerów, schładzamy, przeprowadzamy syntezę, schładzamy potem zmieniamy temperaturę, żeby zaszła synteza, potem podgrzewamy żeby nici zdenaturowały od nowa. Zawsze odbywa się to przy ogromnym nadmiarze starterów.

Termocykl - łaźnia widna , w której można dokładnie określać temperaturę i prędkość jej zmiany.

Siła wiązań miedzy starterami a nicią DNA zależy od składu nukleotydowego. Im więcej C tym wiązania silniejsze i trzeba zwiększyć temperaturę (3 wiązania wodorowe, a między A i T tylko 2).

Po zakończeniu tej reakcji otrzymujemy bardzo dużo cząsteczek o określonej długości. Dalsze namarzanie można prowadzić na wektorach.

Fragmenty uzyskiwane metodą PCR, to główny sposób do wszystkich badań ewolucyjnych. Gdy porównujemy gatunki ze sobą, to namnażamy fragmenty DNA. Metoda ta działa gdy inne już nie działają, gdy mamy za mało DNA.

Z kości Neandertalczyka namnożono mitochondrialne DNA (tej matrycy jest w komórce relatywnie dużo w porównaniu do innych cząsteczek DNA). Ustalono sekwencję i wykazano, że nie jesteśmy potomkami Neandertalczyka, ale ludzi kromaniończyków.

Dzięki tej metodzie można się cofnąć 20 - 30 tys. lat, ale tylko teoretycznie, bo po takim czasie DNA ulega takim modyfikacjom, że nie może służyć jako matryca. Np. bursztyn przepuszcza tlen i to bardzo modyfikuje DNA, więc nie nadaje się już ono do niczego. Podobnie zwierzęta zatopione w bagnach się nie nadają.

PCR służy amplifikacji krótkich fragmentów DNA - dzięki temu można na podstawie włosów, spermy itp. ustalić czyje to DNA. Jest to rutynowa technika w kryminologii.

Badanie pochodzenia różnych grup etnicznych, identyfikacja szczątków wielu ważnych postaci, dzięki znajomości miejsca pochówku ich najbliższych (Kopernik, Traugutt).

Technika PCR jest coraz częstsza przy mutagenezie. Wystarczy wziąć starter i zacząć amplifikować coś z niego. W tym kawałku DNA, tworzonym na bazie startera będzie mutacja, którą chcemy wprowadzić. Namnażając fragment możemy starter tak zaprojektować, aby były tam miejsca dla jakiegoś enzymu.

Działanie genów

Działanie genów to transkrypcja i translacja. Mamy nić DNA sensowną i antysensowną. Na antysensownej powstaje messenger.

Są 64 triplety, z których wszystkie maja sens z wyjątkiem trzech, stanowiących sygnał STOP na końcu sekwencji kodujących białka. Kod jedynkowy, ani dwójkowy nie były wystarczające, aby zakodować 20 aminokwasów, zaś trójkowy aż z nadmiarem.

Niektóre aminokwasy (met i trp) są kodowane jedynie przez jedna trójkę, inne przez dwie, a są takie jak leu i ser, gdzie 6 różnych trójek koduje ten sam aminokwas.

Właściwości kodu:

• Niezachodzący (nienakładający się)

• Jednoznaczny i uniwersalny - u wszystkich organizmów te same trójki oznaczają ten sam aminokwas

→ ale są wyjątki: np. w mitochondriach i innych

• Bezprzecinkowy

• Niejednoznaczny - jeden aminokwas może mieć wiele trójek kodujących

Wprowadzano mutacje dodając lub zamieniając nukleotydy. Gdy wprowadzono 1,2 nukleotydy następowała mutacja, przy wprowadzeniu 3 niekoniecznie, bo taka zmiana jednego aminokwasu nie koniecznie zmienia właściwości całego białka.

Rozszyfrowanie kodu genetycznego

→ pierwsze doświadczenia: syntetyzowano chemicznie matrycę, np. poli U - po przeprowadzeniu in vitro biosyntezy otrzymywano łańcuch z samych fenyloalanin

→ można też było syntetyzować dając 3:1 U:A; można było wyliczyć przy losowej syntezie jaka jest częstość jakich trójek i sprawdzić jak rozkłada się układ częstości aminokwasów

→ ostateczne rozszyfrowanie kodu:

rybosomy są w stanie przyłączyć matrycę o długości trzech nukleotydów i do tej matrycy podłącza się starter RNA z odpowiednim aminokwasem. Można było wszystkie 64 trójki syntetyzować i w kombinacji z rybosomami sprawdzić co kodują

• I Kongres Genetyczny w Moskwie 1975r.: ktoś przedstawił wyniki takich badań, a Meyerson wsiadł w pierwszy samolot do Kalifornii, zorganizował ludzi do pracy i dostał Nobla za rozszyfrowanie kodu

Supresja mutacji typu nonsens

Może mieć miejsce, gdy mutacja jest wynikiem mutacji nonsens.

W genie trójka sensowna zmienia się w nonsensowną. Jeśli tak mutacja zajdzie w środku genu to powstanie sygnał STOP i zakończy się tu translacja, bo nie ma tRNA, które podstawiło by tu aminokwas. Można uzyskać wiele takich mutacji (zwykle prowadzą one do braku aktywności enzymu). Jednak mogą powstać supresory mutacji nonsens - czyli inne mutacje, które zaszły w genach kodujących tRNA - zmienia się antykodon w tRNA. Normalnie nie ma tRNA z antykodonami pasującymi do trójki nonsensownej, ale jeśli zajdzie mutacja w tRNA, taka że będzie on rozpoznawał taka trójkę i w jej miejscu przyłączy aminokwas to nastąpi kontynuacja translacji i zniesienie mutacji nonsensownej. Ramię DHU (w tRNA) - struktura spinki z dihydroksyuracylem (nukleotyd nietypowy dla RNA), zawiera informację jaki rodzaj aminokwasu może być przyłączony do danego tRNA.

Mutacje supresorowe:

• Znoszą wszystkie mutacje typu nonsens

• Zwykle nie przywracają zwykłego tempa wzrostu czy syntezy jakiegoś związku chemicznego komórce

• W miejscu gdzie jest mutacja typu nonsens zostanie przyłączony aminokwas, który nie koniecznie jest tym pierwotnie tam występującym, co może prowadzić do zmiany właściwości białka

• Trójki STOP powinny być na końcu białka (2 pod rząd) a supresor sprawia, że białka nie są terminowane dokładnie tam, gdzie powinny

• Supresory nie są miejscowo specyficzne, ale mutacjospecyficzne - znoszą określoną mutację, ale w dowolnym genie.

Właściwością kodu genetycznego jest, że w trójce liczą się pierwsze dwie zasady - one nadają specyficzność rozpoznania. Trzeci nukleotyd może być dość dowolny.

Żeby zapis genetyczny był odczytany musi dojść do transkrypcji: przepisania informacji na RNA.

Transkrypcja

→ synteza messengera na matrycy DNA

→ w DNA musza być promotor, bo transkrypcja musi się gdzieś zacząć; do nich się przyłącza polimeraza RNA, która przepisuje fragmenty DNA na RNA

→ u prokariontów mamy pewna sekwencję w odległości -10 i w odległości -35, które są charakterystyczne dla ogromnej większości promotorów promotorów bakterii

→ polimeraza przyłącza się do matrycy; czynnikiem, który u bakterii odpowiada za przyłączenie w obszarze -35 jest czynniki δ (sigma) i to jest jedna ze składowych części polimerazy

• Multimessenger zbudowany z kilku podjednostek działa jako polimeraza

• Poszczególne jednostki maja swoje funkcje: łączeni, wiązanie nukleotydów, wiązanie do matrycy, wiązanie do promotora

• Czynnik δ zapewnia rozpoznanie matrycy przez polimerazę, a później jest odczepiany, bo nie jest potrzebny przy transkrypcji

→ u bakterii istnieje pewna możliwość ekspresji genów przez to, że istnieją różne czynniki δ ( np. inne są u Bacillus gdy wytwarzają sporu, a inne, gdy komórki macierzyste), łączące polimerazy do innych genów

→ kolejne geny są włączane przez to, że polimeraza łączy się z kolejnymi czynnikami δ zdolnymi do rozpoznania promotory kolejnych genów

→ to czy polimeraza zacznie transkrybować zależy od szeregu genów produkujących inne białka regulacyjne, które albo przeszkadzają albo wspomagają proces transkrypcji - to jest proces regulacji genów

Genetyka z inżynierią genetyczną D/Wykład 5

ciąg dalszy...

Bank genów: DNA połączone z wektorem.

Gdy później z wektorów wydzielmy wprowadzony kawałek DNA to można badać jego funkcje, budowę, jakie ma sekwencje replikacyjne itd.

Cięcie DNA:

• Można to robić na wiele różnych sposobów: np. mechanicznie przez strzykawkę z cienką igłą albo przez urządzenie jak polimeryzator (takie coś z pompką do rozpylania wody kolońskiej) - rurka z cieczą nad którą bardzo szybko przesuwa się powietrze i porywa z powierzchni cieczy kropelki. Jeżeli tą cieczą jest niepofragmentowane DNA to powietrze porywa kropelki z DNA. Ustawiając odpowiednie ciśnienie i szybkość przepływu powietrza można ustalić wielkość fragmentów DNA (otrzymuje się duże fragmenty).

• Najpopularniejszymi nożykami do cięcia DNA są enzymy restrykcyjne, endonukleazy restrykcyjne - enzymy, które trawią DNA rozpoznając określone sekwencje DNA i przecinając w obrębie określonego miejsca i przy danej sekwencji.

• Enzymów restrykcyjnych jest wiele typów, można je kupić

• Niektóre przecinają dokładnie naprzeciwko siebie np. Eco R V

• Inne przecinają, jak Eco R I, niedokładnie _CTTAGG^GAATCC po takim przecięciu powstają fragmenty posiadające lepkie końce, które ułatwiają ligację fragmentów przeciętych tym samym enzymem

• Nazwy enzymów to nazwa rodzajowa i gatunkowa bakterii + numer enzymu

• Im enzym rozpoznaje dłuższą sekwencję tym potnie enzym na dłuższe kawałki, bo krótka sekwencja zdarza się w DNA statystycznie dużo częściej niż długa

• Enzymy restrykcyjne naturalnie występują w komórkach bakterii i sinic służą do obrony bakterii przed obcym DNA

• Chronią one własny DNA i razem z enzymem restrykcyjnym współdziała enzym modyfikujący, np. acetylaza, metylaza, która rozpoznaje te same co enzym restrykcyjny i modyfikuje je (np. acetyluje) przez co stają się niewrażliwe na trawienie przez enzym restrykcyjny

W katalogu przy każdym enzymie jest podany wynik trawienia faga λ - używany jako standard wielkości fragmentów DNA. Po rozcięciu enzymami fragmenty DNA rozdziela się w żelu, polu elektrycznym - elektroforeza fragmentów DNA w żelu, mniejsze fragmenty wędrują szybciej.

Jeżeli trawimy nieznany DNA to później puszczamy go na żelu obok faga λ i porównujemy wyniki, żeby wiedzieć na jak wielkie kawałki trawiony jest dany fragment DNA.

Na żelu po puszczeniu DNA strawionego enzymem restrykcyjnym otrzymamy rozmaz - smugę od góry do dołu żelu. Dzieje się tak dlatego, ponieważ każdy organizm trawi takie DNA jak człowieka na tak ogromną ilość kawałków, że w każdej pozycji znajdą się jakieś fragmenty o zbliżonej wielkości. Przez to nie da się z żelu (w przypadku tak dużych gnomów) wyizolować pojedynczego fragmentu. Można wyciąć kawałek żelu i puścić ponownie, tak aby nawet fragmenty w zbliżonej długości się rozeszły i puścić tak kilka razy - ale to żmudna robota i raczej się tego nie stosuje.

Planując doświadczenie nad rekombinowaniem DNA należy wybrać enzym restrykcyjny którym fragmenty DNA i tym samym enzymem trawimy DNA wektora, wtedy mamy na obu cząsteczkach takie same lepkie końce i obie łatwo połączyć. Ligaza łączy fragmenty DNA

Fragmenty DNA podłączamy do wektorów, którymi są małe cząsteczki DNA jak plazmidy bakteryjne, bakteriofagi, plazmidy drożdżowe, wirusy wyższych organizmów. Gdybyśmy do komórki wstawili cały fragment DNA to byłby on od razu zdegradowany. Włączany do kolistej cząsteczki DAN nie tylko nie jest zdegradowany ale nawet może być replikowany.

Wektory

Wektor powinien mieć:

• Miejsce startu replikacji (ori)

• Jakiś marker, który pozwoli wyróżnić czy do bakterii dostał się wektor, często takim markerem jest gen warunkujący oporność na jakiś antybiotyk - używamy wtedy bakterii wrażliwych na dany antybiotyk

• Można mieć w wektorze 2 plazmidy

• Po transformacji wysiewamy bakterie na pożywkę z danym antybiotykiem

• Gdy mamy 2 wektory to gen wprowadzamy w środek drugiego markera i wtedy wektor traci tą drugą cechę np.

1. marker: oporność na ampicylinę

2. marker: oporność na tetracyklinę - tu wprowadzamy gen, komórka po transformacji będzie oporna na ampicylinę ale nie na tetracyklinę

Z wektorów powszechnie stosowanych wyrzucono dużo niepotrzebnych fragmentów DNA. Zostawiono tam tylko to, co potrzebne czyli ori, gen odporności.

Trzeba jeszcze wstawić polilinker - fragment DNA zsyntetyzowany chemicznie, który ma jeden obok drugiego różne miejsca restrykcyjne. Ten wektor jest bardzo uniwersalny, bo można do niego wprowadzać fragmenty trawione jednym z kilkunastu enzymów. Miejsca trawienia przez niektóre enzymy są tylko na polilinkerze - są unikalne, nie ma ich nigdzie na plazmidzie.

Używa się enzymów, które trawią tylko w jednym miejscu. Gdyby użyć takich, które trawią w wielu, to plazmid by się rozleciał i nigdy nie połączył w funkcjonalną jednostkę. Można trawić 1 wektor wieloma pojedynczymi enzymami enzymami wstawić w niego wiele fragmentów DNA.

Wektory plazmidowe mamy też u drożdży. Naturalnie występuje tam plazmid 2niciowego DNA, replikuje się w cytoplazmie, posiada swoje ori. Klonując fragmenty DNA na drożdżach używamy tego plazmidu, ale w formie zmienionej, z markerami.

Można robić wektory bifunkcjonalne, które nadają się do namnażania i w bakteriach i w drożdżach. Muszą mieć one dwa ori (dla drożdży i bakterii). Można takie wektory przerzucać z bakterii do drożdży. Powinien mieć przynajmniej 2 markery.

Ligaza DNA, po przecinaniu, odtwarza wiązania dwuestrowe. Przeprowadzamy reakcję ligacji a później transformujemy komórki bakterii.

). Trzeba było mu dodać lepkie końce i dosyntetyzować metioninę od której wszystko się zaczyna. Na UW zsyntetyzowano chemicznie gen na insulinę.*Można tak klonować np. chemicznie syntetyzowane DNA. Pierwszym sklonowanym hormonem była somatostatyna - jeden z hormonów odpowiedzialnych za wzrost organizmów. Liczy 14 aminokwasów aminokwasów i łatwo było go zsyntetyzować (gen, nie hormon

Bardzo często hoduje się cDNA, coś co jest kopią DNA zsyntetyzowaną enzymatycznie. Tu wykorzystuje się enzym odwrotną transkryptazę: RNAzależną polimerazę DNA. Na matrycy RNA syntetyzowane jest DNA.

Jeśli zależy nam na tym aby uzyskać ekspresję z konkretnego genu bakterii to stosuje się tą technikę. Normalne DNA koduje jeszcze introny, a tak to mamy od razu same kawałki kodujące egzony sklejone razem. Bakterie nie mają aparatu do usuwania intronów.

Dlatego robi się banki genów wykorzystując cDNA. DNA izoluje się z organizmu i przepisuje na cDNA kolejne nici, klonuje się to w wektorach. Można tak tworzyć biblioteki genów całego organizmu lub bardzo wyspecjalizowane.

Tworząc tak gen na insulinę:


Szukamy RNA dla insuliny w kom. wysp trzustki.

Gdybyśmy chcieli sklonować gen na hormon wzrostu to izolowalibyśmy RNA z przysadek mózgowych, przepisywali na DNA, izolowali to DNA uzyskane w wyniku odwrotnej transkrypcji z RNA tkanki, gdzie ten gen jest funkcjonalny.

Gdy udało się wyizolować cDNA na hormon wzrostu z komórki to brakowało mu nukleotydów od 2 do 24, które dosyntetyzowano. Dołączone to cDNA było do wektora pod sekwencją promotorową gdzie zaczyna się transkrypcja i translacja i jest to wprowadzone do bakterii. Hormon wzrostu - jedna z pierwszych substancji, która była produkowana dzięki metodom inżynierii genetycznej. Używany był jako lek przeciw dziedzicznej karłowatości, która polega na mutacjach genu kodującego ten hormon. W lekach potrzebny jest hormon wzrostu człowieka, z innych zwierząt jest nieskuteczny. Wyizolowano odpowiedni gen pobierając go ze zwłok z przysadki. Ale procedura ta nie była wydajna i nie udało się nigdy uzyskać tego hormonu odpowiednia dużo, tak też działano w Polsce. Hormon wzrostu jest używany również przy gojeniu ran, przydatny do budowania masy mięśniowej.

Produkcja przy pomocy inżynierii genetycznej jest wydajna i tania → przykład klonowania hormonu wzrostu.


Drugim dogodnym obiektem do klonowania genów są drożdże, łatwe w hodowli.

Plazmidy do aplikacji w drożdżach muszą zawierać sekwencje, które zawierają ori - ta sekwencj u drożdży nazywa się ARS. Jeżeli chcemy mieć wielokopiowy plazmid to bierzemy ori z plazmidu 2μ DNA. Jeżeli chcemy mieć 1 kopię to użyjemy ori z chromosomu. W chromosomie drożdży ori są rozmieszczone nieregularnie, co jakiś odcinek DNA. Jeżeli wektor wstawimy w „tones”(???) któregoś z chromosomu drożdży, to ten plazmid będzie się zachowywał w czasie mejozy jak dodatkowy chromosom i będzie segregował do kom. potomnych jak chromosom.

YAC - sztuczny chromosom drożdży: kawałek DNA, który zawiera marker: gen leucynowy (koduje jeden z enzymów biosyntezy leucyny) i wtedy do transformowania będziemy używali komórki leucyna ^-

Mamy sekwencję ARS odpowiedzialną za replikację, mamy tones i dołączamy do tego praktycznie dowolny fragment DNA. Może być bardzo długi i będzie się zachowywał tak, jak chromosom, nie będzie cyrkularyzował, na końcach ma sekwencje telomerów - zapinki, które są na końcach chromosomów i które zabezpieczają chromosom przed zdegradowaniem. Tworzymy tak sztuczny chromosom.

Popularne są wektory wirusowe, tworzone na bazie bakteriofagów. Klasyczny przykład to fag λ. Jest bardzo dużo wektorów, które pochodzą z faga λ. Najprostszy wektor to taki:

w środku sekwencje odpowiedzialne za regulację funkcjonowania genów, na zewnątrz geny białek. Aby użyć go jako wektor należy wyrzucić środkowy fragment i użyć tylko jego dwóch ramion i zmieszać go z fragmentami obcego DNA.

Płaszcz białkowy ma pewien limit wielkości cząsteczek które może do siebie wpakować.

Gdy połączą się tylko 2 ramiona to nie zostanie to zapakowane: za mało genów, za małe.

Będzie zapakowane gdy w środek wskoczy fragment obcego DNA ok. 10tyś par zasad.

Sekwencje cos są odpowiedzialne za łączenie białek DNA faga. DNA, które ma takie sekwencje będzie zapakowane w płaszcz białkowy faga. Wykorzystywano tą sekwencje zrobienia wektorów. Wsadzono takie sekwencje cos na plazmid bakteryjny. Jeżeli przeprowadzić ligację DNA w której powstaną bardzo długie łańcuchy, do DNA dodamy płaszcz białkowy → białko pakuje do siebie wszystko co mieści się między dwoma sekwencjami cos i ma odpowiednią długość.


Komórki roślinne

• strzelba genowa: opłaszcza się cząst. DNA złotem tak, że mają one zdecydowany ładunek, masę i w polu elektrycznym rozpędza się i wstrzeliwuje w komórkę, którą one niszczą, ale gdy są już w środku mogą integrować się z chromosomami, replikować się.

• Najczęściej do operacji genetycznych u roślin służy plazmid, który wywodzi się z bakterii, plazmid ten nazywa się T I. występuje u bakterii żyjących w brodawkach korzeniowych. W plazmidzie tym jest obszar DNA odpowiedzialny za przenoszenie bakteryjnego chromosomu do kom. roślinnych. Roślinnych ten sposób obcy DNA może się przenosić na plazmidzie do kom. roślinnej.

• Wprowadzamy to co chcemy do E. coli najpierw koniugujemy ją z bakterią Agrobacterią z plazmidem Ti. Ale koniugujemy tylko wyselekcjonowane komórki E. coli. Tylko Agrobacteria ma możliwość infekcji komórek roślinych. Z zainfekowanych komórek roślinnych możemy zregenerować całą roślinę transgeniczną.

Na plazmidzie można wprowadzić DNA, które koduje antysensowny RNA - łączy się sensownym RNA i go blokuje. W ten sposób można wyłączyć działanie genu w kom. roślinnej. Tego typu doświadczenia prowadzi się aby uzyskać GMO.

Komórki zwierzęce

Wirusy zwierzęce: SV40, adenowirus - używany najczęściej a obecnie nawet wyłącznie on w terapii genowej, gdy chcemy wprowadzić do organizmu prawidłową formę genu, gdy chcemy stworzyć szczepionkę antynowotworową. Ale nie używa się pełnego adenowirusa. Ma on geny wczesne i późne. Białka nie są potrzebne do replikacji wirusa, więc są usuwane. Potrzebne są LTR (???) - powtarzające się, terminalne zakończenia, aby wirus integrował się z chromosomami. Są dwie strategie:

• Albo chcemy żeby wirus namazał się w komórkach transformowanych, ale wtedy ten wirus nie potrafi się zbyt długo utrzymać w komórkach transformowanych, wywołuje reakcje obronne organizmu

• Doprowadzić do tego aby wirus zintegrował się z chromosomami - układ jest bardzo stabilny, ale wtedy w komórce jest tylko 1 kopia transformowanego genu.

Gdy używano wirusów z nieusuniętymi genami ???? to powodowało to reakcje niekorzystne.

Jedno dziecko nawet przez to poważnie zachorowało.

Teraz są wektory trzeciej generacji - usunięto z nich praktycznie wszystko co jest niepotrzebne do wniknięcia, integracji z chromosomami. Wektor sam w sobie jest dzięki temu bezpieczny.

Pierwszy lek w komercyjnej terapii genowej, lek przeciwnowotworowy: ??????

Jeden z supresorów nowotworowych jest podłączony do adenowirusa.

W terapii genowej są również wektory na bazie retrowirusów (RNA→DNA). W p.łaszczu razem z DNA wnika do komórki kilka cząsteczek odwrotnej transkryptazy, która jest odpowiedzialna za przepisywanie RNA na DNA i DNA integruje z chromosomem. Retrowirusy to HIV i większość wirusów onkogenicznych. Wszystkie mają dośc specyficzną budowę: na końcach odwrócone sekwencje a w środku 3 geny: gag, env i pol. Pol- gen na odwrotną transkryptazę. Gag i env- na zewnętrzną i wewnętrzna otoczkę. Zewnętrzna otoczka jest częściowo złożona z błony komórki. Białko gag dociera do błony i inkrustuje ją. Wirus wydostaje się razem z tą błoną.

Retrowirus, który ma być wektorem nie ma swoich genów, a szczególnie tych odpowiedzialnych za transformację nowotworową. Takim wirusem infekuje się razem z wirusem wspomagającym, który produkuje potrzebne białka, ale nie jest zdolny do replikacji. DNA włącza się do chromosomu dzięki sekwencjom terminalnym powtórzonym na końcu. Ta metoda tez jest skutecznie stosowana w terapii genowej chorób dziedzicznych, ale częściej stosowny jest adenowirus.

Jak wyróżnić klon, w którym jest poszukiwany przez nas gen???

• gdy gen nadaje komórce jakąś właściwość- jest najprościej, np. biosynteza Lucyny- używamy wtedy bakterii leu^- →wyróżnianie klonów przez komplementację- uzupełnienie cechy, która występuje u stransformowanego szczepu.

• gen na lucyferazę- powoduje luminescencję; często używany jako marker(od razu widać kto ma taki gen); chciano takimi świecącymi drzewami oświetlić ulice, ale podlewanie lucyferyną byłoby bardo drogie

• w ogromnej większości przypadków takie geny jak: kodujący hormon wzrostu, insulinę, nie nadają baterii żadnej cechy: możemy wtedy zastosować metodę hybrydyzacji:

• łańcuch kwasów nukleinowych potrafią łączyć się wiązaniami wodorowymi w obrębie struktur komplementarnych

• sonda- kawałek (min. 20 nukleotydów) DNA, komplementarny do fragmentu genu szukanego: ten fragment musimy wyznakować- najczęściej znakowanie radioaktywne za pomocą α- lub γ- ATP. Kineza podłącza fosfor do końca cząsteczki ATP i tak ja znakuje. Można tez naciąć podwójna nic endonukleazą, żeby powstały przerwy w obu łańcuchach i dosyntetyzować z użyciem radioaktywnych nukleotydów. Takie nukleotydy wstawiane w różne miejsca sprawiają, że cząsteczka jest wyznakowała na całej długości

• można znakować stosując luminescencje lub dołączać coś co jest odczytywane jako antygen przez konkretne przeciwciało (blokujemy DNA i stosujemy przeciwciało, skierowane na biotynę połączone z jakimś barwnikiem)

• sondą przeszukujemy bank genów: wysiewamy bakterie, na płytkach kładziemy bibułki (filtr nitrocelulozowy), kolonie przerastają przez bibułę; zwykle tworzone są kopie przez ?????; zdejmowanie filtra: zapiekanie, moczenie w NaOH aby zdenaturować DNA, rozpuścić komórki bakteryjne, trzeba doprowadzić do rozplecenia DNA, żeby ułatwić hybrydyzację; zapiekamy w suszarce i wrzucamy do roztworu z wyznakowała sondą: jeśli sonda była radioaktywna to filtr trzymamy jakiś czas w tym roztworze, suszymy i przykładamy klisze rentgenowską- zaczernienia odpowiadają kolonii, gdzie gen z przyczepioną, wyznakowaną sondą → cofamy się do płytki z repliką koloni, patrzymy, która kolonia jest w danym miejscu i potem namnażamy tylko tę kolonię

• jeżeli jako wektor używany był fagλ to infekujemy bakterie i to co mamy na szalce to łysinki fagowe; dalsze postępowanie jest takie samo: operujemy filtrem i po przyłożeniu kliszy znajdujemy łysinkę, gdzie nastąpiła hybrydyzacja

• metody hybrydyzacji są często wykorzystywane do identyfikacji klonów, które zawierają poszukiwany przez nas gen.

Jest specjalna klasa wektorów: wektory ekspresyjne:

• dają zawsze wyrażenie ekspresji sklonowanego genu

• przykładem jest wektor puc, w którym znajduje się fragment genu kodującego β- galaktozydazę ( gen lac2 E. coli), obok tego genu jest polilinker. Obce fragmenty DNA wstawiamy tuz za początkiem genu lac2 i ten początek zawiera wszystkie sygnały potrzebne do transkrypcji i translacji. Wprowadzając tu nasz gen powodujemy, ze polega on i transkrypcji i translacji, jakby ciąg dalszy β-galaktozydazy. Tworzy się takie długie białko. Używane są sygnały do transkrypcji i translacji jakiegoś genu bakteryjnego lub drożdżowego.

Jeżeli mamy sklonowany na wektorze ekspresyjnym taki gen to możemy szukać w bankach produktu tego genu- białka, stosując metody immunologiczne, gdy mamy przeciwciała do białka, którego poszukujemy. Możemy wtedy moczyć kolonie/ łysinki w roztworze zawierającym przeciwciało wcześniej wyznakowane. Zatapia się ono tylko do koloni/ łysinek, gdzie był nasz gen, działał i zostało wyprodukowane odpowiednie białko.

Techniki hybrydyzacji

• zaczęto się nimi posługiwać do wyszukiwania fragmentów coś kodujących po rozdziale na żelach agarozowych

• powstaje smuga, obok porusza się marker wielkości* rozdział na żelu *trawienie enzymem restrykcyjnym

• przenoszenie DNA z żelu na filtr nitrocelulozowy, całość umieszcza się w buforze.

• na tym filtrze umieszcza się ileś warstw bibuły, tak aby nastąpiło przesiąkanie (przyciska się dodatkowo ciężarkiem). Cały roztwór z żelu przechodzi do bibuły, DNA jest zatrzymywane na filtrze, a wszystko inne idzie do góry. Więc na filtrze mamy dodatkowe odwzorowanie tego co na żelu.

• W żelu może tez być rozdzielane RNA i przenoszone na filtr

• Rozdzielanie i przenoszenie na filtr:

• RNA - technika Northern

• DNA - technika Southern (od nazwiska)

• Białka - technika Western Blot

• Przesączamy elektroforetycznie białka na filtr i barwimy je roztworem z przeciwciałem po to żeby wykryć gdzie jest określone białko

• Mając przeniesione na filtr DNA/RNA zanurzamy ten filtr w roztworze z radioaktywna sondą i identyfikujemy miejsca w żelu gdzie sonda się przyczepi i wiemy, że w tym miejscu jest komplementarna do tej struktury DNA/RNA

Gdy chcemy wiedzieć gdzie jest wytwarzany hormon wzrostu:

Bierzemy z myszy różne tkanki, ekstrahujemy RNA z tych tkanek, rozdzielamy je w żelu i bierzemy sondę, którą jest fragment genu na hormon wzrostu i patrzymy czy ta sonda złapie się w którymś miejscu do RNA mózgu, wątroby itd. Identyfikujemy tkankę, w której jest dany RNA produkowany.


Tak samo jeśli klonujemy cDNA:

Najpierw rozdzielamy fragmenty RNA lub cDNA z różnych tkanek. Można to robić tak, że izolujemy RNA i puszczamy na żel. Otrzymujemy rozmaz, robimy hybrydyzacje i znajdujemy na kliszy zaczernienia. Odpowiedni fragment wycinamy z żelu (z jego kopii) i ekstrahujemy z tego RNA, przepisujemy na cDNA i klonujemy cDNA.

Genetyka z inżynierią genetyczną D/Wykład 6

Regulacja

U organizmów wyższych regulacja genów, to ich włączanie i wyłączanie na stałe w różnych tkankach.

Zaś mikroorganizmy dostosowywały się do warunków środowiska. Ich geny reaguja bardzo szybko na zmieniające się warunki środowiska. Wyższych organizmów tej reakcji nie ma, bądź jest znacznie słabsza w związku z homeostazą (nie ma gwałtownych wahań ekspresji genów, regulacja dotyczy rozwoju).

A→B→C→D do takiej reakcji potrzebne SA trzy enzymy kodowane przez trzy geny. Ale jeśli w podłożu jest zw. D to po co syntetyzować wszystkie enzymy po drodze.

Mechanizm represji

- obecność zw. D powoduje zahamowanie syntezy tych wszystkich enzymów. Zw. D jest korepresorem

Zjawiskoinhibicji zwrotnej (hamowania zwrotnego) - związek końcowy dezaktywuje pierwszy, bądź drugi enzym danego szlaku (blokowanie aktywności, a nie syntezy)

Połowiczny czas życia białek to kilka - kilkanaście godzin, więc nawet przy represji szlak by jeszcze jakiś czas funkcjonował, gdyby nie było inhibicji zwrotnej. Tak wygląda regulacjadrogi biosyntetycznej.

Droga kataboliczna

Nie powinna funkcjonować, gdy nie ma pierwszego substratu. Gdy on się pojawia, to następuje indukcja syntezy wszystkich enzymów. Zatem pierwszy związek jest induktorem.

Zjawisko regulacji genetycznej może mieć miejsce na wszystkich poziomach (transkrypcja, translacja, aktywność białek), jednak głównym procesem jest regulacja na etapie transkrypcji (zwłaszcza u organizmów wielokomórkowych).

U mikroorganizmów regulacja na poziomie transkrypcji jest bardzo ważna (mRNA krótko żyje i bardzo szybko następuje adaptacja do warunków środowiska).

W organizmów wyższych geny nieciągłe, proces obróbki mRNA - tu też może dochodzić do regulacji.

Interferencja RNA

Cząsteczki RNA odziaływują z genami lub innymi cząsteczkami RNA

Model operonu laktozowego

Jacob, Monod u E. coli

Obok siebie na chromosomie chromosomie E. coli są trzy geny kodujące:

• Lac Z - β-galaktozydazę

• Y - permeazę (enzym odpowiedzialny za pobieranie laktozy)

• A - acetylazę (enzym potrzebny do acetylacji)

Ten zespół genów jest regulowany wspólnie - geny te w konkretnych warunkach zaczynają razem działać i w konkretnych warunkach ustaje również transkrypcja.

Badając ten operon dokonano kilku najważniejszych odkryć dotyczących funkcjonowania materiału genetycznego.

β-galaktozydaza jest enzymem indukcyjnym - nie jest syntetyzowana jeśli w pożywce nie ma laktozy. Poziom enzymu wzrasta 1500 razy po dodaniu laktozy. Łatwo oznaczyć ten enzym.

Za czasów Jacoba i Monod nie było metod do badania RNA. Był im potrzebny etap między enzymem a białkiem, wiedzieli, że cos tam powinno być.

Zespół trzech genów jest przepisywany na jedna nic mRNA. Są na nim 3 miejsca wiązania rybosomów i białka powstają naraz. U prokariontów rybosom przyłącza się do określonej sekwencji mRNA - tzw. sekwencji Shine - Dalgarno (na jednym mRNA może ich być więcej niż jedna). U eukariontów mRNA może być czytanie jedynie od końca 5', gdzie jest czapeczka. U wyższych organizmów brak peronów.

Obok trzech genów tego peronu jest jeszcze gen regulacyjny i, który produkuje białko wiążące się z operatorem - brak wtedy transkrypcji. To czy represor zwiąże się z operatorem czy nie zależy od induktora - laktozy, bo jeśli laktoza zwiąże się z represorem, to go zdezaktywuje. Dodanie laktozy powoduje syntezę enzymu - system indukcyjny.

Zatem składowymi operonu są:

• Geny struktury, kodujące białka enzymatyczne

• Operator

• Gen kodujący represor

• Promotor - od niego rozpoczyna się transkrypcja genów

Represor dezaktywuje polimerazę: gdy polimeraza nie przyłącza się, a obok jest już przyłączony represor to jest ona dezaktywowana. Nie jest to zapora fizyczna, bo wszystko jedno czy represor jest od końca 5' czy 3' promotora.

Oddziaływanie białka regulacyjnego z polimerazą jest jeszcze lepiej widoczne w przypadku kontroli pozytywnej.

Produktem genu regulacyjnego jest aktywator, który wiąże się z promotorem lub jakimś elementem obok i powoduje uruchomienie transkrypcji (aktywacja polimerazy - pomoc jej w transkrypcji).

Z operonem lakotozowym wiąże się też koncepcja białek allosterycznych, które zmieniają swoja konformację w zależności od obecności/nieobecności niskocząsteczkowego związku jakim tutaj jest laktoza.

Jeżeli dodamy pulsowo induktor:

• Puls krótki - elementarna fala indukcji - po dodaniu laktozy przez pewien czas nic się nie dzieje, później poziom enzymów rośnie, osiąga plateau i ustaje

• Ten pierwszy okres to czas potrzebny na transkrypcję i translację genu ( u E. coli ~ 1.5 min)

• Z krzywej indukcji można wyliczyć połowiczny czas życia mRNA:

Pozwalamy na syntezę mRNA, później stosujemy inhibitor i pozwalamy na translację i patrzymy jak wygaszana jest krzywa translacji ( u E. coli ~ 1 min.)

Mutanty Iֿ

Β-galaktozydaza stale produkowana niezależnie od obecności laktozy.

Mutacja recesywna.

U mikroorganizmów można otrzymać merodiploidy: jeden gen na chromosomie, a drugi na plazmidzie (pozwala to badać który jest dominujący, a który recesywny).

Gdy gen I funkcjonuje, to zablokowany jest operator. Mutanty Iֿ produkują represor nieaktywny. W merodiploidzie hetero wystarczy jeden gen I, aby blokować oba operatory - działanie w układzie trans.

Mutanty IS

Mutacja dominująca. Gen lac Z nie był indukowany przez laktozę (a zatem nie powstawał enzym).

Mutanty IS - represor nie jest w stanie związać się z laktozą, więc taki represor jest nie do usunięcia, gdy przyłączy się do operatora (superrepresor powstaje).

Represor to białko tetrameryczne (4 podjednostki) - pierwsze oczyszczone białko regulatorowe.

Odcinek operatorowy tego operonu, to pierwszy odcinek, którego funkcje biologiczna wykryto, który zsyntetyzowano chemicznie. Operator jest chroniony przed strawieniem endonukleazami, gdy przyłączony jest represor.

Gdy do komórki E. coli wprowadzono wielokopiowy plazmid (~80 na komórkę) z operatorem, to mimo braku laktozy rozpoczęła się synteza β-galaktozydazy. Było za mało cząsteczek represora, którego jest 8-10 na komórkę, a gen I tylko jeden. A więc zabrakło represora do zablokowania odpowiedniego operatora na operonie.

Mutanty OC (operator constitutive)

Stale syntetyzowana β-galaktozydaza. Do operatora nie może się przyłączyć represor. Mutacja cis - dominująca. Efekt dotyczy wyłącznie tego samego chromosomu na którym był i operator i geny struktury.

Gdy zbadano wiele genów odkryto powtarzającą się sekwencję (promotor): TATAAT

Genetyka z inżynierią genetyczną D/Wykład 8

FAG λ

Regulacja genów u faga λ - dobry przykład regulacji genów prokariotycznych

- fag E. Coli, w pełni zsekwencjonowany

- genom kolisty

- niewielki genom: 50 genów ( nie jest najmniejszy) - struktury, rekombinacji i regulacyjne

Może po zakażeniu komórki:

1. Przechodzić cykl lityczny - replikacja DNA, synteza białek, tworzenie nowych cząstek wirusowych, rozpuścić błonę kom. bakterii, zakazić następne komórki

2. Przechodzić cykl lizogeniczny

• Integracja DNA faga z chromosomem, nie produkuje fag swoich białek

• Koegzystencja faga (nazywanego wtedy profagiem) z bakterią może trwać wiele pokoleń, ale w którymś momencie fag może z powrotem zacząć produkować swoje białka, tworzyć cząstki i wejść w cykl lityczny

• Gdy bakterie są w kiepskim stanie to fagi wchodzą w ten cykl, żeby przeczekać

Fag produkuje trzy rodzaje RNA (w cykl litycznym):

• Wczesny

• Wczesny opóźniony

• Późny RNA - tylko gdy jest w cyklu litycznym, gdy potrzebne są białka główki i ogonka

W fagu jest kilka zespołów genów, które są transkrybowane w różnych okresach cyklu życiowego.

Fag ma obszar regulacyjny, geny cro, CII, N operator - od tego obszaru regulacyjnego zależy strategia życiowa wirusa.

Geny odpowiedzialne za replikację kontrolują włączanie i wyłączanie faga z chromosomu bakterii.

Gen regulacyjny Q włącza późne geny. Geny S i R - powstanie lizozymu (w lizie).

Główny gen regulacyjny: CI

• Produkuje represor, który jest niezbędny gdy fag wchodzi w cykl lizogeniczny

• Represor ten jest białkiem, które blokuje operatory przyłączając się do DNA

• Ten represor składa Się z dwóch domen

Łączy się do DNA jako dimer

Blokuje tak operatory wczesnych genów

Jeżeli możemy zaindukować cykl lityczny np. naświetlając komórki z profagiem ultrafioletem - indukujemy w kom. bakterii proteazy, które przecinają represor w konkretnym miejscu i represor odłącza się od DNA.

W obszarze regulacyjnym skupione są też inne geny odpowiedzialne za regulację i promotory (lewy i prawy) głównych genów i obok operatory dla transkrypcji w lewą i prawą stronę

Są też terminatory, które też uczestniczą w regulacji ekspresji genów - kontrolowana terminacja transkrypcji. Transkrypcja może być zatrzymana lub nie w miejscach terminacji, zależy to od białka które jest kodowane przez gen N. To białko jest antyterminatorem. Jeżeli jest ono wytworzone to przyłącza się do polimerazy DNA, która osiąga miejsce nut i to kompleks polimeraza - białko N może przejść przez terminator i nie nastąpi terminacja. W miejscu nut dochodzi do modyfikacji polimerazy przez …(tu ksero się nie skserowało na tyle, żeby coś odczytać)

Są dwa ważne białka regulacyjne:

• CI

• Białko cro - antyrepresor

jeśli białko CI zablokuje operatory(lewy i prawy) to nie ma transkrypcji genów, jeżeli cro jest to nie dochodzi do zablokowania operatorów przez CI i odbywa się transkrypcja wczesnych genów

Promotory:

1. Lewy i prawy - główne promotory od których czytane są wczesne geny fagowe

2. Są też promotory RM i RE:

• RM - podtrzymywanie represji - jeżeli fag jest w stanie lizogenicznym to wtedy jest mu potrzebne tylko funkcjonowanie genu CI, żeby był produkowany represor, żeby nie powstawały białka fagowe

• RE - ustalenie represji - jest to bardzo silny promotor, ma trochę inną sekwencję niż pozostałe i jeżeli transkrypcja odbywa się z tego promotora, to powstaje bardzo dużo cząsteczek represora mRNA

• Żeby odbywała się transkrypcja z promotora RE potrzebne jest białko kodowane przez gen cII * umożliwia transkrypcję CI z promotora RE

CII:

• Służy do wyczuwania stanu metabolicznego komórki

• Bardzo labilne, krótki okes trwania, stabilizowane przez białko CIII

• Reaguje na poziom cAMP w komórce, cAMP pokazuje jaki jest stan wykorzystania, dostępności źródeł węgla w komórce - dobre źródło węgla = mało cAMP

• Dzięki temu fag może „wiedzieć” czy wchodzić w cykl lityczny, w zależności od tego czy komórka jest w dobrym, czy w złym stanie metabolicznym

Tajemnica regulacji genów u faga λ leży w strukturze operatorów

• Każdy operator ma 3 prawie identyczne powtórzenia sekwencji O_R1, O_R2, O_R3, są to te sekwencje do których ma powinowactwo białko CI - główny represor i białko antyrepresorowe cro

• Niewielkie różnice w sekwencjach trzech części promotora zmieniają powinowactwo i siłę wiązania białka do promotora

• CI najsilniej się wiąże z O_R1 słabiej z O_R2 a najsłabiej z O_R3

• Cro najsilniej się wiąże z O_R3 słabiej z O_R2 a najsłabiej z O_R1

• Na obszarze operatora są wiązane białka CI i cro

• Jeżeli mamy lizogenię to białko represorowe wiąże się z O_R1 i O_R2 i jest syntetyzowane RNA tylko z promotora P_AM i funkcjonuje tylko ten gen;

• Jeżeli zwiększy się koncentracja represora tak, że wysyci O_R3 to polimeraza w ogóle się nie wiąże, zablokowane są wszystkie geny

• Jeżeli mamy cykl lityczny to z O_R3 wiąże się cro, które wklucza wiązanie promotora i umożliwia syntezę mRNA, ale jeżeli cro wysyci wszystkie trzy części to zablokowana jest w ogóle synteza wczesnych genów; produkowane są wtedy późne geny - białka otoczki, zamyka się cykl lityczny

Tu rozwiązanie systemu regulacji to konkurencja o miejsca wiązania między CI i cro.

W zależności od tego, którego białka jest więcej, takie białka będą powstawać.

Na to nakłada się drugi mechanizm: z antyterminacją i białkiem N

Jest to dodatkowe zabezpieczenie.

Jeżeli fag jest w stanie lizogenii i nie funkcjonują jego geny odpowiedzialne za białka struktury płaszcza, gen odpowiedzialny za lizę to fag powinien siedzieć cicho zintegrowany z chromosomem i powinno pozostawać tylko białko CI .

Jeżeli mamy oddziaływanie białko-DNA to zawsze jest to oddziaływanie dynamiczne, gdyby akurat odłączyło się CI i przyłączyła polimeraza i zaczęła transkrypcja to nie dobre -> przejście w cykl lityczny.

W najwcześniejszym okresie jest produkowane tylko białko CI i białko N. Białko N nie powstaje gdy działa represor. Nawet gdy transkrypcja wystartuje to się szybko zatrzyma. Jeżeli będzie uruchomiona synteza wszystkich genów bo zadziała białko cro to powstanie również białko N, które będzie powodowało antyterminację i umożliwienie syntezy dalszego RNA.

Są dwa mechanizmy regulacyjne:

• Represja/antyrepresja

• Terminacja/antytermintor

W rozwoju człowieka(np.) z początkowo jednej komórki powstają zupełnie inne tkanki. Tu też są podejmowane decyzje, które geny włączyć.

U faga geny blokowane są czasowo, a u wyższych organizmów geny wyłączane są na zawsze.

Gdy zsekwencjonowano genom człowieka to było ogromne zaskoczenie, że jest tak mało genów. Wiele genów może kodować różne cząsteczki RNA, więc liczba powstających białek jest znacznie większa niż 30 000 genów.

Wśród genów jest bardzo wiele regulacyjnych:

• Niewielkie różnice między nami a szympansem dotyczą przede wszystkim genów regulatorowych układu nerwowego

• Szympans nie ma genu kodującego jedną z kaspaz, więc szympansy nigdy nie chorują na Alzheimera

Przykład regulacji ogólnej u prokariotów

• Regulacja wszystkich genów wykorzystywanych przy wiązaniu odpowiednich źródeł azotu.

• Azot jest asymilowany, wykorzystywany do tworzenia aminokwasów, puryn, pirymidyn, jest u wszytkich organizmów na dwa sposoby -> a na pewno u organizmów, gdzie jest to najlepiej zbadane:

• Albo przez dehydrogenaze glutaminianu

• Powstaje glutaminian -> a z niego aminokwasy

• Gdy jest duzo azotu

• Gdy jest mało azotu (organizmy, które same syntetyzują aminokwasy,a nie my)

• Dwie reakcje: syntetaza glutaminy i syntetaza glutaminianu

Wszystkie geny kodujące związki biorące udział w przyswajaniu azotu mają szczególnie zbudowane promotory:

- gen nifA koduje nitrogenazę występującą u bakterii zdolnych do wiązania azotu atmosferycznego (Rhizobia)

• mutaren(??) nif: 17 genów odpowiedzialnych za produkcje genów odpowiedzialnych za wiązanie azotu atmosferycznego

• chciano mutaran(??) przenieść do roślin, żeby nie musieć nawozić azotem, żeby nie zanieczyszczać środowiska - nie udało się, bo rośliny musza mieć specjalne kompartmenty oddzielone od dostępu tlenu

• Prowadzone są prace, żeby bakterie współżyjące z roślinami niemotylkowymi wyposażyć w gen nif

Wszystkie geny azotowe (w tym geny operonu nif) są regulowane przez jeden system regulacyjny. System był badany na operonie glutaminowym u E.coli, gdzie jest operon, a w nim 3 geny: syntetaza glutaminy, kinaza fosforylująca ta syntetazę

Chemorecepcja u bakterii

U E.coli są dwie witki, wyczuwają koncentracje substancji atrakcyjnych lub nie i bakteria przesuwa się do lub od. Witki kręcą się w jedna stronę i bakteria posuwa się do przodu w określonym kierunku. A jeśli każda kręci się w inna stronę to bakteria nie przesuwa się w określonym kierunku. W błonie są chemoreceptory - fosforylacja po związaniu z atraktantem - kaskada fosforylacji i defosforylacji dochodzi do białek w ukł. motorycznym witek.

Stwierdzono, że regulacja jest pozytywna - geny są włączane gdy do ich promotorów przyłączy się konkretne białko regulacyjne, które musi być ufosforylowane. Jest to pierwszy przypadek gdy aktywatorem transkrypcji genów musi być ufosforylowane białko -> pierwszy raz odkryto ważność fosforylacji.

Stwierdzono też, że przed promotorami są elementy genetyczne: enhancery, do których wiąże się białko regulacyjne wspomagające transkrypcje.

Białko regulacyjne wiąże się z elementami genetycznymi w pobliżu promotora lub nie. Dodatkowo białko może sterczeć na zewnątrz pod odpowiednim kątem.

DNA się zgina i polimeraza i białko aktywujące mogą się dotknąć. Przesuwano sekwencje promotora i białka regulatorowego (jego wiązania) względem siebie. Okazało się, że jeżeli odsuniemy miejsce wiązania o 100 nukleotydów lub dalej to system będzie zawsze działał.

Przestaje działać po odsunięciu ponad 2000n. Na odcinku 1-100 n. ważna jest konkretna odległość położenia. Podwójna spirala DNA ma pewną sztywność, więc na tych małych odcinkach nie jest w stanie się złamać jak szpilka do włosów i tworzy strukturę zaokrągloną.

Przy niektórych odległościach przyłączone białko sterczy do środka, a przy innych na zewnątrz. W zależności od położenia miejsca wiązania enhancera z przyłączonym białkiem może lub nie może aktywować polimerazy.

Ogólna regulacja azotowa

• Wiele genów podlega tej samej regulacji - maja promotory z pewną określona sekwencją, do których wiąże się polimeraza RNA, mają obok promotorów enhencery, do których wiąże się białko regulacyjne, którego przyłączenie powoduje, że polimeraza aktywnie transkrybuje dany gen

• Jeżeli: glutamina, jony amonowe (dobre źródło azotu)

histydyna (kiepskie źródło azotu)

Żeby E. coli mogły wykorzystywać histydynę, potrzebne są dwa systemy: regulacji katabolizmem histydyny i system wspomagający, czyli ogólny system regulacji, który aktywuje wszystkie geny odpowiedzialne za wiązanie azotu.

• W systemie są enhancery, które jak się okazało nie są specjalnością eukariotów, bo mają je również bakterie. (odkryto przy N)

• Odkryto tu system fosforylacji/defosforylacji białek -> teraz odkryto to dla wielu genów.

U eukariota reguła jest to, że ehnancerów jest bardzo dużo. Modulowanie tempa ekspresji genów, inicjacji transkrypcji jest bardzo delikatne i czułe. U wyższych organizmów modulowanie nie jest takie, tu nagle poziom białka wzrasta 100 razy. Raczej mamy do czynienia z homeostazą, wszystko się dzieje delikatnie. Różnica 2-3 krotna. Jest za to zjawisko włączania różnych genów na stałe w trakcie rozwoju.

U organizmów eukariotycznych mamy coś, czego nie ma u bakterii - geny nieciągłe. Przemieszane części kodujące i niekodujące. Musi więc istnieć system usuwania części niekodujących z RNA.

Na końcu 5' mRNA u eukariotów jest czapeczka, a na końcu 3' kilkanaście lub kilkadziesiąt adenin.

U eukariotów mamy 3 rodzaje polimerazy DNA - transkrypcja 3 grup genów.

I - rRNA

II - transkrybuje genu kodujące białka

III - małe RNA - snRNA, część rRNA

Polimerazy są bardziej złożonymi cząsteczkami u eukariotów niż u prokariotów. Niektóre podjednostki są wspólne dla wszystkich trzech polimeraz ,a niektóre są charakterystyczne tylko dla jednego rodzaju.

-amanityna (w muchomorach) hamuje polimeraze II.*

Promotory dla tych trzech polimeraz maja trochę inna budowę.

Ważne dla transkrypcji sekwencje DNA są rozlokowane w pozycji -30 (sekwencja TATA - miejsce ścisłego wiązania polimerazy RNA w DNA) i -60 (pierwsze rozpoznanie promotora przez polimerazę: miejsce UE) od miejsca startu transkrypcji.

U eukariotów nie wystarcza sama polimeraza do tego, aby zachodziła transkrypcja, musi być cały szereg białek wspomagających - tworzą one kompleks podstawowy.

Część białek jest konieczna do tego oby polimeraza w ogóle się przyłączyła do promotora. Transkrypt to sam zespół białek potrzebnych do tego, aby transkrypcja zachodziła.

TBP - jedno z białek kompleksu, wiąże się z sekwencja TATA. Tu zachodzi gromadzenie i wiązanie się pozostałych białek.

Mutageneza saturacyjna wysycająca - mutuje się kolejno wszystkie miejsca przed promotorem i patrzy się jaki jest efekt mutacji punktowych w genie, czy białka będą się łączyć. Dzięki temu wiadomo, które sekwencje warunkują wiązanie białek.

Gdy zmutujemy enhancer to transkrypcja będzie zmniejszona, a gdy silencer - transkrypcja wzrośnie.

Sekwencje upstream - w górę od promotora - wiążą się tam różne białka.

Heat shock - genu szoku cieplnego -> ich transkrypcja jest uruchamiana gdy komórki ulegną szokowi termicznemu, czy innemu szokowi.

Pojawiają się wtedy w komórce białka - chaperony, które pomagają innym białkom utrzymać właściwą strukturę trzeciorzędową, przez to te białka nie ulegają denaturacji.

Wszystkie te geny mają przed promotorami 27-nukleotydowy odcinek HSE (heat shock element) do którego wiąże się czynnik HSTF.

Mamy pewne duże grupy genów, które są współregulowane. W pobliżu ich promotorów znajdują się sekwencje enhancerowe, do których wiążą się czynniki transkrypcyjne rozpoznające te sekwencje. Związanie czynnika transkrypcyjnego pomaga w tym, że cały kompleks transkrypcyjny zaczyna transkrybować geny.

W każdej tkance są te same geny, ale nie te same czynniki transkrypyjne. Warunkuje to taką różnorodność tkanek.

Są takie rodziny czynników transkrypcyjnyh, mających podobna organizacje. Wszystkie czynniki transkrypcyjne musza mieć przynajmniej dwie domeny:

• Rozpoznanie sekwencji DNA tak, żeby się do niej przyłączyć.

• Domena aktywująca, która fizycznie dotknie polimerazy RNA, czy któregoś z białek kompleksu podstawowego polimerazy i spowoduje aktywacje tego kompleksu, tak że zacznie się on przesuwać się wzdłuż nici DNA.

Inżynieria genetyczne umożliwiła stworzenie hybrydowych białek przez konstruowanie genów kodujących hybrydowe białka - manipulacja na samych białkach była niemożliwa.

Np.: jeżeli wstawimy element regulacyjny dla enzymów galaktozowych przed geny kodujące enzymy katabolizmu argininy, to te enzymy zaczną reagować na galaktozę, a nie na argininę, bo mają element regulujący.

Metoda double hybrid i wiele innych metod fizycznego łapania jednego białka przez drugie i oczyszczania wspólnych kompleksów białkowych, badanie które aminokwasy są potrzebne do kontaktu jednego białka z drugim.

Jeśli jest już uruchomiona transkrypcja to powstaje mRNA, zaczynający się od końca 5' zmodyfikowanego w postaci czapeczki, kończy się na 3'- adenylowanym.

Ale ten mRNA nie jest ciągły. Odkryto to gdzieś w latach '80.

Genetyka z inżynierią genetyczną D/Wykład 9

Białka w regulacji

Białka warunkują specyficzność transkrypcji określonych genów. Miejsca wiązania tych białek zwykle leżą w górę od miejsca początku transkrypcji. Gen potrzebuje enhancerów do transkrypcji.

Białko TPB występuje we wszystkich komórkach i wiążąc się z sekwencją TATA jest niezbędne do funkcjonowania każdego genu.

Oktamer tylko w komórkach limfoidalnych.

Są białka specyficznego dla jednego (bądź grupy genów), albo takie, które występują we wszystkich genach. Geny kodujące białka HSP są uruchamiane gdy komórki są w stresie (zaczynają one w tedy produkować białko regulatorowe, które przyłącza się do promotorów wszystkich genów HSP.

Białka wiążące DNA:

• Jest ich dużo

• Zawierają domenę , specyficznie rozpoznającą daną sekwencję DNA

• Ale są też wiążące się niespecyficznie (np. białka pistonowe, które łączą strukturę nukleosomową chromatyny, wiążąc się niespecyficznie do dużego lub małego rowka DNA)

Wiązanie białka do DNA może być np. przez suwak leucynowy.

Białka są bardzo dobrze scharakteryzowane:

robiono hybrydy - domena wiążąca z jednego białka a domena aktywująca DNA z innego białka, czynnika transkrypcyjnego =>białko uruchamiało geny leżące w pobliżu domeny rozpoznającej konkretna sekwencję.

Są całe rodziny białek wiążących się z DNA pod wpływem hormonów. Maja one różne domeny:

• Wiążącą - by przyłączyć hormon

• Rozpoznającą sekwencję DNA - by przyczepić się do różnych promotorów

Aby geny były włączane i wyłączane:

• Mechanizm włączający nie działa na czystym DNA, ale na chromosomie, zatem białko musi przebrnąć przez białka chromatyny, żeby dostać się do DNA

• Czasem czyste DNA nie jest rozpoznawane przez dane białko, ale obecność histonów i zwinięcie DNA pozwalają na przyłączenie się takich białek.

Działanie genów eukariotycznych:

1. Skomplikowany i złożony system inicjacji transkrypcji

2. Żeby mogła zachodzić wydajna transkrypcja, żeby geny mogły być włączane muszą się przyłączyć białka regulacyjne, czynniki transkrypcyjne rozpoznające określona sekwencję

3. Występują house keeping genes - stale obecne w komórce; stała transkrypcja na określonym poziomie

4. W systemie włączenia i wyłączania mamy czynniki rozpoznające enhancery, czasem silencery

5. System jest stonowany, poziom białek jest kontrolowany.

Geny eukariotyczne różnią się od prokariotycznych tym, że są prawie zawsze nieciągłe ( mają egzony i introny). W jądrze eukariontów występują modyfikacje charakterystyczne dla messengerów ( metyzacja - powstanie czapeczki na końcu 5' i poliadenylacja na 3'). Następnie nastepuje splicing, czyli wycięcie intronów i złożenie egzonów, po czym taka matryca do translacji jest transportowana do cytoplazmy.

Doświadczenie z adenowirusem i cDNA

Mapa restrykcyjna adenowirusa i jego cDNA się różniły - cDNA było krótsze, brakowało fragmentów obecnych w normalnym DNA. A zatem mRNA nie jest kopią DNA i jest to reguła u organizmów eukariotycznych. Za opracowanie mechanizmów splicingu Sharp dostał Nobla.

Za pomocą sondy można wykryć produkty pośrednie między pierwotnym transkryptem a ostateczną matrycą mRNA -> kawałki mRNA są coraz krótsze. Ogromna większość naszego DNA stanowią introny.

Zanim odkryto splicing była znana klasa hnRNA (heterogenne, jądrowe RNA). Jest to duże RNA znajdowane w jądrach komórkowych, krótkotrwałe, bardzo zmienne, heterogenne. Stanowi ono prekursor dojrzałych mRNA znajdowanych w cytoplazmie.

Mechanizm wycinania intronów

• Po sekwencji DNA można odczytać gdzie jest intron a gdzie egzon

faza odczytu, czyli sensowne trójki kodujące aminokwasy, są tylko w egzonach; w intronach są często trójki nonsensowne

• Są wysoce konserwowane sekwencje styku egzon - intron, intron - egzon

jest żelazna zasadą, że koniec 5' intronu to GU, a koniec 3' to AG; nie ma żadnych wyjątków od tej reguły; jednak sekwencje dłuższe (ok. 10 nukleotydów) są konserwowane, ale już nie tak bardzo oraz jedna sekwencja w intronie(w jej obrębie najważniejsza jest adenina).

• Intron zapętla się tworząc wiązanie 5' - 3' (powstaje tzw. struktura lassa); następnie DNA też się zapętla i wiążę do tego kanonicznego, po czym następuje wycięcie struktury lassa i połączenie dwóch egzonów ze sobą

• W procesie biorą też udział: cała grupa białek i snRNA (małe jądrowe RNA), tworzące razem spliceosom

Cząsteczka snRNA ma takie pojedyncze zakończenie, które może parować z sekwencją intronu bądź egzonu. Służy jako cos w rodzaju podpórki. Występują jedynie w kompleksach białkowych. Są komplementarne do styku intron - egzon, a białka pomagają lub przeprowadzają reakcję.

Po co splicing?

Wydawało się, że egzony kodują domeny białek, które mają jakąś funkcję. W procesie ewolucji, gdy powstawały jakieś części białek, to to było utrwalane i nowe geny powstawały przez tasowanie się istniejących genów. Np. jeśli jakieś białko miało uzyskać zdolność do łączenia się np. z żelazem, to przez tasowanie fragmentów genomu, ta domena mogła od razu przeskoczyć w pobliże innych domen i utworzyć nową właściwość białka. Jest to szansa na szybsze selekcjonowanie nowych genów.

Alternatywny splicing

Gen wyjściowy ma określona ilość egzonów i intronów, ale proces splicingu nie przebiega identycznie we wszystkich komórkach organizmu, nie wszystkie miejsca splicingu są wykorzystywane, bo np. SA wycinane niektóre introny wraz z egzonami pomiędzy nimi. Dzięki temu z jednego genu różne produkty można otrzymać. Wprawdzie proces nie jest poznany do końca, ale na pewno zależy od białek tworzących kompleks transkryptosomu.

Człowiek ma tylko 30 000 genów (więcej DNA nie oznacza wcale więcej genów).myślano, że tych genów jest dużo więcej. Szacowano to na podstawie liczby różnych cząsteczek RNA odkrywanych w różnych tkankach, ale alternatywny splicing pokazuje, że to szacowanie nie jest prawidłowe.

Splicing dotyczy nie tylko genów kodujących białka, ale również genów kodujących rRNA, tRNA. Z wycinaniem intronów z rRNA wiąże się jedna z metod Nobla (zachodzi ono bez udziału jakichkolwiek białek i enzymów).

Introny dzielą się zwykle na kilka klas. Cząsteczki RNA podlegające splicingowi zwykle maja określone struktury II i III-rzędowe.

Wycinanie bez enzymów: synteza chemiczna odpowiedniego RNA, metodami fizycznymi nadanie odpowiedniej struktury i wtedy RNA sam z siebie wytnie intron (noblista włożył RNA doE. coli i okazało się, że tRNA sam sobie wyciął intron, a zatem może mieć właściwości katalityczne).

Rybozymy: składają się z części białka i RNA. Fragment łańcucha RN-owego jest niezbędny, aby enzym pełnił funkcje katalityczne.

Self-splicing i rybozymy to prawdopodobnie pozostałość świata gdzie były wyłącznie cząsteczki RNA, mające zdolność replikowania się bez udziału białek i mające zdolność do przekształcania się. Self-splicing jest powszechne.

Mniej powszechne jest edytowanie RNA (wykryte u Troponosoma). RNA pewnych genów zawiera w swoim składzie zasady nieobecne w DNA. Dodawane są jedne zasady a usuwane inne - modyfikacje posttranskrypcyjne.

A skąd wiadomo gdzie co dodać albo usunąć?

Okazało się, że są pary genów. Jeden koduje jakieś białko, drugi koduje przewodnikowy RNA, komplementarny do RNA pierwszego genu i zawiera właściwe sekwencje oraz fragmenty do dodania. Wstawianie odbywa się przy pomocy odpowiedniego enzymu. Niestety nie ma rozsądnego wyjaśnienia po co jest ten mechanizm. Prawdopodobnie ma znaczenie w w ewolucji organizmów i procesach regulacji ekspresji genów. Znany jest przypadek u kręgowca, gdzie następuje na mała skale edytowanie RNA, które jest wkomponowane w regulację ekspresji genów.

Zamiana w RNA jednego nukleotydu na inny powoduje, że może powstać białko dużo krótsze (gdy powstaje kodon STOP). Przez to powstają różne białka w różnych tkankach z tego samego genu. Usunięcie jakiegoś fragmentu z białka powoduje, że może ono się lokować w innym miejscu w komórce i inaczej funkcjonować.

Wyłączanie genów

• Jedna z metod wyłączania genów jest metoda knock - outów genowych

[[Image:]]Jeśli nastąpi crossing over w obu wskazanych miejscach na obrazku, to gen będzie miał w środku obcy kawałek DNA (zazwyczaj wkłada się tam marker) i tak rozbity gen jest na stałe dezaktywowany.

• Inną metodą jest zrobienie antysensownego RNA

Wprowadza się sekwencję homologiczną do właściwego RNA, albo homologiczną do obszaru paromotorowego genu. Wtedy, gdy jest produkowany mRNA, to hybrydyzuje on z antysensownym RNA i nie może podlegać translacji. Ewentualnie blokujemy promotor (lub miejsce między nim a AUG) translacji. Wadą tej metody jest to, że potrzebujemy co najmniej tyle antysensownego RNA co sensownego.

Interferencja RNA

U roślin i u C. elegans są odkryte małe dwuniciowe RNA, które wyłączają geny, jednak jest to zjawisko innego rodzaju niż w/w. Występuje ono normalnie w komórkach, dzięki genom kodującym małe cząsteczki RNA, które tworząc struktury dwuniciowe mogą się przyłączać do właściwego RNA, co staje się sygnałem dla enzymów nukleolitycznych, które trawią ten RNA.

Regulacja ekspresji genów odbywa się na poziomie syntezy RNA, ale również na poziomie jego degradacji - bo mniej RNA zmniejsza liczbę białek powstających na jego matrycy.

RNA interference dotyczy degradacji zbędnego RNA i zachodzi w przypadkach genów odpowiedzialnych za podziały komórkowe, za wchodzenie w proces kontrolowanej śmierci komórek i za inne ważne procesy życia komórki.

U Drosophila i C. elegant jest ok. 100 genów kodujących małe RNA; u kręgowców 250.

Małe RNA powstają z większych prekursorów prekursorów są cięte przez enzym knicer (?), działający bardzo precyzyjnie. Po złączeniu się tego małego RNA z mRNA taka cząsteczka jest degradowana (albo blokuje translację). Pewna klasa małych RNA rearanżuje chromatynę w chromosomach (hetero i euchromatyna), co też jest mechanizmem wyciszania genów pewnych obszarów chromosomów.

95% prac to wyłączanie genów, aby wyleczyć jakąś chorobę, np. Parkinsona. Dzięki małym RNA można by wyciszyć ekspresję genów chorobowych.

U Drosophila podaje się małe RNA z pokarmem, u C. elegans wstrzykuje się.

Genetyka z inżynierią genetyczną D/Wykład 10

Leczenie nowotworów

Rons 1912r. - wykrył RSV (wirus RNowy), który wywołał raka u kur.

Poszukiwano wirusów wywołujących rak u ludzi ale ich nie odnaleziono. Wiedziano, że liczne związki mutagenne (promieniowanie X itd.) wywołują raka bez udziału wirusów, wiec szukano powodów raka. Porównywanie różnic na poziomie metabolitów metabolitów enzymów pomiędzy kom. zdrowymi i rakowymi nie dawało sensownych wyjaśnień.


Lata 80 - wyizolowano pierwsze onkogeny (geny, których mutacje wywołują nowotwory). Od tego momentu racjonalne badania nad rakiem.


Normalne komórki dzielą się pewną, zaprogramowaną liczbę razy, zaś nowotworowe dzielą się w nieskończoność.

Właściwości komórek rakowych

1. Utrata właściwości inhibicji (nabłonkowej) kontaktowej

• Zwykle kom. nabłonkowa wytwarza jedna warstwę komórek

• Kom. nowotworowe tworzą wielowarstwowe skupiska

• Dzielą się również w płynie (normalne potrzebują podłoża)

• gdy się rozwijają w organizmie, mogą się przemieszczać i dzielić w nowych tkankach (organach); normalne tego nie potrafią.

Przy chorobach nowotworowych guz jest dobrze odżywiany, musi być dobrze ukrwiony (inaczej by zginął) → angiogeneza - stymulacja rozwoju naczyń krwionośnych.

Normalne komórki tworzą na podłożu stałym jedną warstwę. Jeśli nastąpi transformacja nowotworowa to tworzy się ognisko, focus kom. nowotworowych, łatwe do wyróżnienia w hodowlach.

Badania przeniesiono na poziom hodowli tkankowych, komórkowych. Jednak SA różnice miedzy rakiem na poziomie organizmu, a na poziomie tkanki (nie ma np. angiogenezy).Właściwości pojedynczych komórek się nie zmieniają: niekontrolowany wzrost, okrągły kształt, brak hamowania kontaktowego).


Linie komórkowe, które od lat są w użyciu

Np. komórki Heha (?) - linie komórkowe już transformowanych. Wyselekcjonowano te komórki, które dzielą się w nieskończoność. Mają one zmiany na poziomie chromosomowym i wiele innych. Teraz wiemy że są to kom. typu nowotworowego.


Gołe myszy ( mute mice)

• myszy pozbawione odporności, nie produkują przeciwciał, można u nich łatwiej wykryć nowotwory

• kom. nowotworowe są rozpoznawane jako obce - mają inne antygeny powierzchniowe → gdyby nie układ odpornościowy. To wieku kilku lat mielibyśmy jakieś odmiany raka; rak normalnie jest choroba ludzi starszych, którzy maja słabszy ukł. odpornościowy.

• Mają liczne defekty, m. in. nie maja normalnego futerka

• Można na nich łatwo badać efekty różnych związków kancerogenicznych, można wstrzyknąć wirusa i patrzeć czy rozwija się choroba nowotworowa, można tez wstrzyknąć same komórki rakowe.

Były dwie gałęzie, jeśli chodzi o naturę raka: wirusowa i komórkowa.

Wirusy i rak

Poznano wirusy RNowe i DNowe, które potrafią wywołać raka.

SA trzy typy wirusów DNowych:

1. SV - 40

2. Adenowirusy

3. Papilloma- i herpeswirusy

SV - 40

• Mały wirus

• Żyje normalnie w komórkach nerki małpiej, niszcząc tam komórki ale nie powodując nowotworów (kom. są dla wirusa permisywne)

• Ale jeśli zarazimy nim inny organizm (np. człowieka), to nie następuje replikacja DNA i odtworzenie wirusa, ale integracja jego DNA do chromosomu i kom. gospodarza staja się zmutowane i pojawiają się białka, które powodują występowanie zmian nowotworowych

• białka T i t (antygeny powierzchniowe) - wczesne białka, lokują się na powierzchni kom. nowotworowych

• Hamują one supresory (białka w komórce) nowotworów.

Adenowirusy

• Wirusy integrujące się z chromosomem gospodarza

• 2 Geny są szczególnie ważne (E1A i E1B), produkujące białka, które konkurują z supresorami nowotworowymi

• Żeby komórka zamieniła się w rakową wystarczy funkcjonowanie jedynie 8% genomu adenowirusa.

Przykłady wirusów przenoszących geny odpowiedzialne za powstawanie nowotworów:

1. Papova - powodują tez powstawanie kurzajek

2. Adeno - geny E1A/B

3. Epstein - Barr

Jednak większe znaczenie maja wirusy RNowe -

Retrowirusy

Należą do nich RSV

• Są jednorodne, jeśli chodzi o budowę

• Pomiędzy długimi powtarzalnymi sekwencjami (LTR) SA trzy geny: gag i env (odpowiedzialne za zewnętrzną i wewnętrzną otoczkę białkową wirusa) oraz gen pol (koduje RNA zależna polimerazę DNA, czyli odwrotna transkryptazę).

Gdy wirus zakazi komórkę, to w wyniku odwrotnej transkrypcji pojawia się liniowa cząsteczka DNA (dwuniciowa), cyrkularyzuje i integruje się z genomem gospodarza. Zintegrowany wirus ulega transkrypcji. Powstają jednoniciowe RNA, które są pakowane w płaszcze białkowe i powstają nowe wirusy.

Wirus ma podwójna otoczkę. Jego białko inkrustuje błonę kom. gospodarza i wirus opuszczając gospodarza ma otoczkę z tym swoim białkiem. Cykl życiowy wirusa jest w rzeczywistości bardzo złożony.

Wirusy łagodne - wstrzyknięte do gospodarza nic na początku nie robią, dopiero po dłuższym czasie przekształca się w wirusa ostrego.

Wirusy ostre - w miejscu wstrzyknięcia bardzo szybko pojawiają się zmiany nowotworowe.

Po infekcji następuje włączenie w genom wirusa jednego z genów gospodarza (jest to onkogen), w miejsce jednego ze jego trzech genów.

sarc - jest dodanym genem, nie jest przez wirusa tracony żaden z jego pierwotnych trzech.

Sklonowanie onkogenu

Pierwszy był gen raka pęcherza moczowego

• Wzięto DNA z kom. rakowych i transformowano nimi komórki myszy szczepu 3T3 (te komórki maja już pewne cechy nowotworowe)

• Kom. 3T3 zmieniły się w nowotworowe; normalne DNA pęcherza moczowego tego nie robi

• Odkryto więc, że zmiana DNA, a nie co innego jest odpowiedzialne za zmiany nowotworowe

Ale jeśli DNA to która jego część?

1. H - ras (określony gen ras)

2. sekwencje Alu (powtarzają się w genomie człowieka i innych ssaków)

Genetyka z inżynierią genetyczną D/Wykład 11

PROCESY NOWOTWORZENIA

• supresory nowotworowe supresory onkogenów,geny, których produkty białkowe mogą hamować powstawanie nowotworów; recesywne mutacje a. wiążą się z pojawieniem się fenotypu nowotworowego; opisano 17 a., których produkty białkowe m.in. biorą udział w naprawie uszkodzeń DNA, budują cytoszkielet oraz są czynnikami transkrypcyjnymi; najbardziej znane a. człowieka to gen Rb, którego mutacje odpowiadają za nowotwór siatkówki oka (siatkówczak) oraz gen p53, którego zmiany zwiększają predyspozycje do zapadania na nowotwory sutka, jelita grubego i białaczkę.

-gen retinoblastomy, gen p53

-kontroluje wazne etapy cyklu komórkowego np transport przez błony

-geny o charakterze recesywnym-ich brak uniemożliwia zablokowanie cyklu komorkowego na jakiejś fazie-komórki dzielą się niepotrzebnie

• onkogeny geny kodujące białka powodujące transformację

nowotworową zdrowych komórek; transformowane komórki wykazują wzrost i podziały nieograniczone — analogiczne do podziałów komórek rakowatych; wykryte pierwotnie w retrowirusach wywołujących transformacje nowotworowe w hodowlach komórek in vitro; onkogeny pochodzą od występujących w genomach różnych eukariontów genów zw. protoonkogenami, o istotnej roli w procesach wzrostu i różnicowania się komórek.

-nabywaja swoich funkcji

-ich mutacje mają charakter dominujący- zmiany bialka włączają inne geny ,stale,niezaleznie od obecnosci danego allelu.


SUPRESJA [łac.], genet. procesy zachodzące w komórkach, prowadzące do zniesienia lub osłabienia skutków mutacji (supresji mutacji, supresory) albo do zniesienia lub osłabienia zdolności komórek do produkcji przeciwciał pod wpływem ciała obcego antygenu (immunosupresja); są też znane białka supresorowe, np. p53, które w nie do końca wyjaśniony sposób powodują supresję fenotypu nowotworowego w komórkach; mutacja w genie białka supresorowego może prowadzić do powstawania nowotworów.

ARTYKUŁY

1.Geny supresorowe w raku piersi-funkcje:

• odźwiernego- decyduje czy komórka wchodzi i w jakie stadium cyklu komorkowego-decyduje czy komorka dzieli się czy nie.

• Grabarza-geny kierujace komórke na droge apoptozy

-gen p53

• reguluje ekspresje genów związanych z cyklem komórkowym-produkty genu to czynniki transkrypcyjne

• bierze udzial w reperacji uszkodzen DNA

• aktywność genu p53 i synteza bialka jest pobudzana gdy w komórce pojawieją się elementy degradacji DNA np.. jednoniciowe fragmenty, wolne końce itp.

Rak piersi- obecność komórek nowotworowych objawie się obniżonym poziomem pruduktu aktywności genu p53-jest to sygnał alarmowy ze w organizmie cos się dzieje.


2.Uwolnienie potęgi p53-„spuszczenie ze smyczy”


Praca ustosunkowuje się do koncepcji ze skoro produkt genu p53 jest taki ważny,że np. obniżenie jego poziomu jest krytyczne np. dla raka piersi, to powinnismy go podwyższyć poprzez podanie i wtedy czlowiek nie będzie musial się obawiac ze zapadnie na chorobę nowotworową.


Badania nad rakiem prostaty:

Wprowadzono p53(na adenowirusie ) bezpośrednio do gruczołu krokowego i to spowodowało bardzo dobre wyniki terapeutyczne -oczywiście gdy choroba była spowodowana defektem p53.


ADENOWIRUSY

, Adenoviridae, rodzina wirusów chorobotwórczych dla człowieka, niektórych ssaków oraz ptaków; zawierają dwuniciowy DNA jako materiał genet.; jest znanych już kilkadziesiąt serotypów adenowirusów; wywołują zakażenia i choroby układu oddechowego.


W ostatnich latach posuwają się do przodu prace nad regulacją p53 w komórce. Wiele genów reguluje ekspresje tego genu a z kolei produkt -czyli białkop53 reguluje ekspresje wielu innych genów.


Mdm2-streptobiałko opowiadające za ubikwitynylację,- czyli wyznaczanie białka do `odstrzału' - białek -w tym p53


dużo p53 (u myszy u których nokaoutuje się mdm2 Smierc nastepuje na poziomie embrionalnym)*Brak mdm2


Brak p53-bardzo szybkie wchodzenie komórek w stan nowotworowy


Podwyższenie w połowie(jeśli chodzi o stan normalny fizjologicznie) zawartości białka p53 daje bardzo wydajną supresję nowotworu.


W dalszych badaniach stworzono poprzez mutacje nadaktywne biełko p53 w nadziei ze będzie ono lepszym supresorem. U myszy znokautowano prawidłowy gen p53 superaktywnym. Niestety skutki były takie ze, mysz wcale nie była wolna od nowotworów co wiecej ulegała szybkiemu starzeniu i chorobom z nim związanych np.osteoporozie.


Gwałtowne zmiany p53 wywołują nieporządane efekty uboczne.

Niewielkie podwyższanie p53 zapobiega procesom nowotworowym.

Podejście do terapii chorób nowotworowych:

• Tworzenie szczepionek przeciwnowotworowych (tabelka przedstawiająca dane które firmy pracują nad którą szczepionką i na jakim są etapie badań)

firmy: Geneembrione (szczerze nie wiem co tak dokładnie powiedział)-

Dendreon- Waszyngton- użyto tam po raz pierwszy komórek dendrytowych do produkcji szczepionek przeciwnowotworowych

Komórki dendrytyczne-kom. Układu obronnego z licznymi wypustkami, występujące na skórze, w śluzach. Wychwytują patogeny, tną je na kawałki zwane antygenami i przekazują komórkom odpornościowym. Limfocyty uczą się w ten sposób rozpoznawać antygeny.

W tej firmie naukowcy pobrali komórki dendrytyczne i wprowadzili do nich geny charakterystyczne dla raka piersi, prostaty i jelita grubego. Komórki nowotworowe na swojej powierzchni maja charakterystyczne bialka, dzieki którym organizm może je odróżnić od zdrowych. W normalnych warunkach układ immunologiczny powinienje niszczyc lecz czasem tego nie robi. Powodem może być np. wiek organizmu. Dlatego uczeni próbuja uaktywnic komórki układu odpornościowego by mógł sam zwalczać nowotwory.

Wyniki testów klinicznych są bardzo obiecujące : 100% wyleczenie w przypadku raka prostaty i jelita grubego; niestety jak do tej pory nieskuteczne w przypadku raka piersi-przypuszcze się ze jak dotad nie trafiono w odpowiedni gen.

Ąby lek w końcu trafił do produkcji od momentu jego stworzenie musi minąć bardzo długi okres testów klinicznych (ponad 10 lat). Do testowania leków przeciwnowotworowych bardzo latwo o ochotników. Są to ludzie chorzy, zdesperowani aby w jak najkrótszym czasie rozpoczać leczenie. Tacy ludzie niemoą czekac na wprowadzenie leku na rynek, dlatego zglaszają siedo osrodkow badawczych, podpisują zgode i zrzekaja się prawa do dochodzenia jakiagokolwiek odszkodowania (ich rodziny również nie mogą tego dochodzić ).

We wrześniu 2005 roku w Chinach wprowadzono po raz pierwszy do organizmu człowieka gen p53 (przy pomocy adenowirusa). Używa się go tam obecnie w celu likwidacji płaskonabłonkowego raka głowy i szyi(w tym nosa, krtani, podniebienia itp.)

W Europie i USA nie dopuszczono jeszcze tej metody do uzytku.

Obecnie firmy pracjuja nad tym aby zrobić szczepionki pobudzające przeciwciała skierowane przeciw komórkom nowotworowym bez udziału komórek dendrytycznych.

Rak prostaty

sam z siebie nie jest groźny bo prostatę można usunąć bez wiekszch szkód dla organizmu ale groźne w tym raku jest przerzutowanie m.in. do płuc mózgu, śledziony które występuje bardzo często przy poznej diagnozie. Przy wczesnym wykryciu zmiany nowotworowej, uszkodzona tkanke wycina się i najczęściej nie skutkuje to żadnymi konsekwencjami.

KROKOWY GRUCZOŁ, stercz, prostata, u samców ssaków gruczoł otaczający odcinek cewki moczowej w pobliżu pęcherza moczowego; przewody krokowego gruczołu uchodzą do cewki moczowej; wytwarza wydzielinę wchodzącą w skład nasienia.

rak krokowego gruczołu, gruczolakorak krokowego gruczołu, nowotwór złośliwy występujący po 50 roku życia, wywołany zachwianiem równowagi hormonalnej organizmu; rozwija się, początkowo bezobjawowo, w części obwodowej stercza i szerzy się przez rozrost i naciekanie; daje przerzuty do węzłów limfatycznych, kości miednicy, kręgosłupa, także do wątroby i płuc; leczenie operacyjne i hormonalne.

W wielu krajach wysoko rozwiniętych(czyli tam gdzie są możliwości finansowe) prowadzone są bezpłatne badania gruczołu krokowego i mamografia .

Choroby nowotworowe powstają również w przypadku:

bardzo często jest tak ze mutacje genow nowotworowych powstają gdy wirus włączy się tuż obok onkogenów i w MPR-ach występują silne promotory. Następuja nadmierna ekspresja genu. Np. gen leukemii mysiej włącza się przy genie na raka krwi

BIAŁACZKA

leukemia, choroba rozrostowa układu krwiotwórczego, której istotą jest niekontrolowana, nieprawidłowa i samoistnie nieodwracalna ekspansja prekursorów krwinek białych (leukocytów) z ich następowymi ilościowymi i jakościowymi zmianami w szpiku kostnym, krwi obwodowej, śledzionie i węzłach chłonnych; powstaje w wyniku działania co najmniej kilku czynników, m.in. natury wirusowej (prawdopodobnie RNA-retrowirusy), predyspozycji genet. oraz czynników zewn., którymi są najczęściej związki chem., promieniowanie jonizujące, zaburzenia składu środowiska, a tym samym organizmu człowieka, zakażenia. Ze względu na rodzaj komórek i przebieg kliniczny wyróżnia się białaczki szpikowe (ostre lub przewlekłe) i białaczki limfatyczne (ostre, zw. białaczkami limfoblastycznymi, lub przewlekłe). Przebieg białaczki ostrej jest gwałtowny, z gorączką, bólami stawów, wrzodziejącym zapaleniem jamy ustnej i zmianami we krwi; rokowanie bardzo poważne; w białaczce przewlekłej, oprócz zmian we krwi, występuje powiększenie węzłów chłonnych (gł. w białaczce limfatycznej), śledziony, wyniszczenie i niedokrwistość; rokowanie nieco pomyślniejsze; choroba trwa latami; leczenie (obecnie w wielu przypadkach skuteczne) zależne od rodzaju białaczki. W niektórych chorobach zakaźnych obserwuje się odczyn białaczkowy w obrazie krwi, zw. niekiedy białaczkę rzekomą.

Aberracje chromosomowe

Mutacje chromosomów

genet. zmiany w strukturze chromosomów pociągające za sobą zmiany dziedziczne cech organizmu; występują spontanicznie w naturze, można je też wywołać sztucznie, działaniem czynników mutagenicznych, np. promieni jonizujących; gł. typy aberracji chromosomów: delecja — utrata odcinka chromosomu (utrata końcowego odcinka — deficjencja), w staniehomozygoty najczęściej letalna; duplikacja — podwojenie odcinka chromosomu (2 identyczne odcinki leżą zwykle obok siebie); inwersja — odwrócenie odcinka chromosomu o 180°;

Translokacja

przeniesienie jednostronne lub wzajemne odcinków między 2 niehomologicznymi chromosomami.

Na skutek translokacji gen krytyczny jest podłączony pod inny gen i nastepuje jego nadmierna ekspresja.

Wirus LV włącza się w locus onkogenu komórkowego,powstaje bardzo duzo produktu, którego nadmiar jest związany z nowotworzeniem

Bardzo często na skutek translokacji onkogen jest lokowany do genu kodującego immunoglobuliny. Charakteryzuja sie one wysokim poziomem ekspresji, prowadzi to do podwyzszonej ilości onkogenu w komórce.

Przykłady translokacji:

Geny BCL-związany z rakiem piersi i ABL-zwiazany z komórkami krwi -leukocytami.

Tabelka. Sporzadzona przez lekarza onkologa.

Przykłady chorób dziedzicznych. Supresorowe zmiany nowotworowe

Podstawy genetyczne procesów nowotworowych:

Kręgowce mają specyficzny układ obrony przed obcymi białkami (wirusami, bakteriami , pasożytami)

Jak to jest ze jesteśmy odporni na działanie tylu anygenow? Nawet takich z którymi nigdy nie mielismy styczności.

Choroby autoimmunologiczne;

GOŚCIEC, ogólna nazwa grupy chorób o różnej, często niejasnej etiologii, objawiających się bólami w stawach i mięśniach;

gościec-atakowanie przez układ odpornościowy własnych białek

TOCZEŃ RUMIENIOWATY, liszaj rumieniowaty, choroba autoimmunologiczna zaliczana do kolagenoz, występuje w 2 podstawowych odmianach: skórnej i narządowej; polega na powstawaniu przeciwciał skierowanych przeciwko składowym jądra własnych komórek, tworzeniu kompleksów immunologicznych, które odkładając się w ścianach naczyń i tkankach, powodują zmiany narządowe. W postaci skórnej (ogniskowej) zmiany — czerwonobrun. nacieki nasilające się pod wpływem światła słonecznego, dotyczą skóry twarzy, rzadziej skóry owłosionej, warg; przebieg choroby przewlekły; leczenie: leki przeciwmalaryczne (arechin), wit. PP, zewn. środki ochronne przed światłem słonecznym. W postaci narządowej (układowej) choroba może prócz skóry (w większości przypadków) zajmować narządy wewn.: nerki, serce, płuca, centr. układ nerwowy; często współistnieją bóle stawów, mięśni, gorączka; przebieg ciężki, leczenie szpitalne — podawanie leków immunosupresyjnych, kortykosteroidów i środków przeciwmalarycznych.

BIELACTWO NABYTE, występowanie najczęściej na skórze twarzy, rąk, w okolicy narządów płciowych odbarwionych plam różnego kształtu, nie wykazujących objawów zapalnych ani zanikowych; choroba dotyczy dzieci i dorosłych, niekiedy występuje rodzinnie; możliwe tło autoimmunologiczne, może występować po stresach nerwowych; leczenia przyczynowego brak — próby stosowania środków fotouczulających, leków uspokajających, także stosowanie kremów maskujących.

PĘCHERZYCA, choroba objawiająca się występowaniem na skórze i błonach śluzowych pęcherzy różnej wielkości; występuje w kilku postaciach (pęcherzyca zwykła, rumieniowata, liściasta); etiologia pęcherzycy nie jest znana, choroba ma podłoże autoimmunologiczne (występują przeciwciała klasy IgG skierowane przeciw antygenom powierzchniowym komórek kolczystych); przebieg choroby przewlekły, leczenie kortykosteroidami i lekami immunosupresyjnymi

SKAZA KRWOTOCZNA, zaburzenie w układzie krzepnięcia krwi, patologiczna skłonność do krwawień; rozróżnia się: skazy krwotoczne naczyniowe, płytkowe i osoczowe; skazy krwotoczne naczyniowe są wynikiem zwiększonej przepuszczalności i łamliwości naczyń krwionośnych; mogą być nabyte (np. wywołane zakażeniami, chorobami naczyń, zatruciem, napromieniowaniem) lub wrodzone; skazy krwotoczne płytkowe są wywołane niedoborem płytek krwi (małopłytkowość) w wyniku niedostatecznego ich wytwarzania w szpiku kostnym bądź zwiększonego niszczenia we krwi obwodowej lub śledzionie, jak również niepełną ich wartością (niesprawność płytkowa); najczęściej występuje jako małopłytkowość polekowa lub samoistna autoimmunologiczna; niesprawności płytkowe najczęściej są dziedziczne; skazy krwotoczne osoczowe powstają na skutek niedoborów osoczowych czynników krzepnięcia; do najbardziej znanych skaz krwotocznych osoczowych wrodzonych należą: hemofilia A (niedobór czynnika VIII) i B (niedobór czynnika IX) oraz choroba Willebranda, tzw. pseudohemofilia (brak czynnika biorącego udział w powstawaniu czynnika VIII); nabyte skazy krwotoczne osoczowe są związane z niedoborem wit. K i upośledzeniem syntezy protrombiny; najczęstsze to czarna choroba noworodków i skaza krwotoczna w przebiegu chorób wątroby i zakażeń. Leczenie skazy krwotocznej zależy od rodzaju choroby, najczęściej polega na uzupełnianiu niedoborów czynników powodujących chorobę, przetaczaniu masy płytkowej czy usunięciu przyczyny choroby (np. w skazie krwotocznej polekowej).

KOLAGENOZY

[gr.], choroby kolagenowe, grupa chorób, różnorodnych pod względem obrazu klinicznego, oraz rozmaitego typu zaburzeń autoimmunologicznych, dla których jest charakterystyczne występowanie włókniakowatego zwyrodnienia tkanki łącznej; zmiany występują w obrębie skóry, mięśni i narządów wewn.; do kolagenoz zalicza się toczeń rumieniowaty, zapalenie guzkowe okołotętnicze, twardzinę, zapalenie skórno-mięśniowe; rozpoznanie trudne (badanie immunologiczne i histologiczne); leczenie zależne od rodzaju choroby, najczęściej kortykosteroidami, lekami immunosupresyjnymi i przeciwmalarycznymi. ==

Pamięć immunologiczna:

1. XVIII wiek-Anglia, w czasie epidemii czarnej ospy zauważono ze kobiety pracujące przy dojeniu krów nie chorują. Zaczęto więc w ramach leczenia rozdrapywać plecy i nacierając je wyciągiem z wymienia krowy. Przyczyną odporności na czarną ospę u tych pań jest fakt ze zarażone były wcześniej wirusem krowianki, który je wyposażył w pamięć immunologiczną.

• OSPA, ospa prawdziwa, ostra, b. zaraźliwa choroba zakaźna, wywoływana przez wirus z rodzaju Orthopoxvirus; charakteryzuje się wysypką pęcherzykowo-ropną i wysoką śmiertelnością; od najdawniejszych czasów powodowała epidemie i pandemie. Po wynalezieniu 1796 przez E. Jennera szczepionki, ospa stopniowo wygasała w wielu krajach, jednak dopiero w ostatnim okresie, dzięki systematycznym, wprowadzonym przez Świat. Organizację Zdrowia (WHO) szczepieniom profilaktycznym, ospa została wypleniona całkowicie; ostatnie zachorowanie zarejestrowano 1977 w Somalii; w Polsce ostatnie przypadki ospy zanotowano 1953, 1962 i 1963; 8 V 1980 WHO ogłosiło świat wolnym od ospy prawdziwej.

• CZARNA OSPA, ciężka, krwotoczna postać ospy, w której występowały liczne drobne wylewy krwi do pęcherzyków ospowych.

• KROWIANKA, odmiana ospy, wirusowa choroba zaraźliwa wywołana przez Orthopoxvirus vacciniae (O. officinale); występuje u bydła, rzadziej u innych zwierząt i człowieka; przebiega zazwyczaj łagodnie; objawy: podwyższenie temperatury ciała, wysypka na skórze wymienia, niekiedy innych części ciała, później pęcherze wypełnione wydzieliną; także szczepionka przeciw ospie stosowana u ludzi, zawierająca wirusy krowianki pobrane z wydzielin skórnych zakażonych cieląt.

1. Epidemia w Marsylii w 1720

• Yersinia pestis została wyPCRowana, wyamplifikowana z masowych grobów

• Zauważono ze zarówno konie jak i stajenni nie chorują na dżumę. Niestety dopiero po epidemii odkryto że pchły które przenoszą chorobe nie znoszą zapachu koni.

• DŻUMA

morowa zaraza, mór, b. zaraźliwa, gwałtowna, groźna dla życia endemiczno-epidemiczna choroba wywołana przez pałeczkę dżumy (Yersinia pestis); u zwierząt przebiega jak posocznica, u ludzi, przenoszona ze zwierząt (gł. szczurów) przez pchły lub przez kontakt z chorym (zakażenie kropelkowe lub przez wydaliny), przebiega w postaci dymieniczej lub płucnej; przechodzi w stan posocznicowy. Dżuma dymienicza, wywołana zakażeniem przez pchłę, rozwija się po 2-5 dniach wylęgania, z obrzękiem węzłów chłonnych i gorączką; powstają przetoki ropne węzłów chłonnych, po czym łatwo dochodzi do uogólnienia choroby, z wystąpieniem skazy krwotocznej, krwawieniami z przewodu pokarmowego i dróg moczowych. Dżuma płucna rozwija się przez zakażenie kropelkowe jako ciężkie, rozlane zapalenie płuc, niekiedy kończące się śmiercią. Posocznica jest powikłaniem obu postaci i, nie leczona, kończy się śmiercią. Ogniska endemiczne dżumy istnieją w niektórych rejonach Azji, Ameryki Pn. i Południowej. Leczenie (w izolatoriach) antybiotykami i sulfonamidami; zapobieganie polega na kwarantannie oraz tępieniu szczurów, w razie zagrożenia — także na szczepieniach ochronnych.

Mechanizm odporności

• Komórkowa-limfocytyT

• Humoralna -limfocytyB

• LIMFOCYTY

[łac.-gr.], komórki układu odpornościowego obdarzone zdolnością rozpoznawania antygenów i reagowania wobec nich różnymi formami odpowiedzi immunologicznej (tolerancja immunologiczna, reakcja cytostatyczna, produkcja przeciwciał i limfokin); wszystkie limfocyty wywodzą się z macierzystych komórek szpiku kostnego. Szczególną grupę stanowiąlimfocyty T, uzależnione w procesie dojrzewania od selekcjonującego i hormonalnego wpływu grasicy ; ich receptor antygenowy pozwala na rozpoznanie własnych antygenów zgodności tkankowej ( HLA układ antygenów) i wykształcenie wobec nich tolerancji immunologicznej; zmiana struktury antygenów zgodności tkankowej przez antygeny konwencjonalne prowadzi do reakcji eliminującej tkanki zmienione czynnikami infekcyjnymi — udział w tej reakcji biorą cytotoksyczne limfocyty T; limfocyty T, tzw. wspomagające, przez produkcję limfokin pobudzają wytwarzanie przeciwciał przez limfocyty B — wytwarzane m.in. w węzłach chłonnych, migdałkach, śledzionie i szpiku kostnym, niezależne w swym rozwoju od bezpośrednich wpływów grasicy. Limfocyty T supresyjne hamują zarówno komórkową (efekt cytotoksyczny), jak i humoralną (produkcja przeciwciał) odpowiedź immunologiczną, zapobiegając jej nadmiernemu rozwojowi i przeciwdziałając zjawiskom autoagresji. Od sprawności wielofunkcyjnej populacji limfocytów T zależy sprawność działania całego układu odpornościowego; wpływom immunoregulacyjnym limfocytów T podlegają także limfocyty K (ang. killer cells) oraz limfocyty NK (ang. natural killer cells). Obie podklasy limfocytów charakteryzują się zdolnością cytotoksycznego niszczenia komórek docelowych, w tym nowotworowych. W procesie rozpoznania komórek docelowych limfocyty K posługują się przeciwciałami wytworzonymi przez limfocyty B; mechanizm rozpoznania komórek docelowych przez limfocyty NK nie jest dokładnie wyjaśniony; w kontakcie komórki docelowej z lomfocytami NK istotną rolę odgrywa struktura powierzchniowa limfocytów, określana jako LFA-l (ang. lymphocyte function associated antigen).

• GŁÓWNY KOMPLEKS ZGODNOŚCI TKANKOWEJ (MHC), ang. major histocompatibility complex, zespół genów zlokalizowanych u człowieka w 6. chromosomie, programujących osobniczo-swoiste sekwencje aminokwasowe polipeptydów, które tworzą na powierzchni komórek system sygnalizacji pozwalający na rozróżnienie przez rozpoznające komórki układu odpornościowego (gł. limfocyty T) pomiędzy antygenami własnymi i obcymi; u człowieka produktem genów MHC są antygeny układu HLA, początkowo zidentyfikowane na powierzchni leukocytów, a następnie także na powierzchni innych komórek organizmu

Budowa przeciwciała

PRZECIWCIAŁA, białka o właściwościach immunoglobulin, mające zdolność swoistego rozpoznania antygenu i wiązania się z nim; przeciwciała są wytwarzane przez komórki plazmatyczne w odpowiedzi immunologicznej typu humoralnego, pod wpływem stymulacji antygenowej.

Jak powstają przeciwciała i receptory limfocytów T

• Pierwszy raz oczyszczono przeciwciała z jakiegoś rodzaju białaczki-były wydalane z moczem

• produkowała tylko jeden rodzaj białka tzn. ze budowa jest zawsze jednakowa*Stworzono hybrydy: limfocyt +komórki nowotworowe

• Porównano mapy restrykcyjne niedojrzałego i dojrzałego limfocytu T i okazało się zę:

- za różnorodność przeciwciał odpowiadają części zmienne występujące w zarówno w łańcuchach ciężkich jak i lekkich

-dojrzałe nie zawierają pewnych genów

• istnieje grupa rodzin genowych odpowiedzialnych za powstawanie przeciwciał:

i *-geny odp.za łańcuch lekkie to

-300, -300, łańcuch ciężki-300 (genów)*-część zmienna u człowieka:

-1, -6, łańcuch ciężki-9*-część stała u człowieka:

-w obszarach części zmiennych występują sekwencje superzmienne- jest to od 6 do 10 aminokwasów

Genetyka z inżynierią genetyczną D/Wykład 12

Naprawa i rekombinacja

Rodzaje mutacji:

• Nonsens -w wyniku mutacji powstaje trójka nonsensowna

• Missens -w wyniku mutacji kodon kodujący jeden aminokwas zmienia się w kodon kodujący inny aminokwas

• Zmiana fazy odczytu -wtedy kiedy w wyniku dodania lub odjęcia jednego nukleotydu (lub dwóch) zmienia się faza odczytu (ramka) odczytu, od momentu powstania tej mutacji translacja jest zaburzona

Mutacje można też dzielić na gatunkowe czy spontaniczne lub indukowane .

Mutacje spontaniczne, są też takie, które zachodzą w wyniku błędu replikacji. Podział mutacji na spontaniczne i indukowane nie jest zbyt ostry, ponieważ często trudno jest stwierdzić czy mutacja zaszła w wyniku działania mutagenów czy też

zaszła całkowicie bez udziału czynników zewnętrznych.[palacze będą mutować się w sposób indukowany ze względu na obecność środków mutagenicznych w dymie i smole; jedząc warzywa i owoce pryskane środkami owadobójczymi i grzybobójczymy , często narażamy się na zmiany genetyczne] Mutacje spontaniczne zachodzą w czasie replikacji DNA. Jest ileś mechanizmów, które dbają o to by zapewnić wierność replikacji. Głównym mechanizmem jest fakt, że polimerazy DNA oprócz aktywności polimeryzującej, mają aktywność endonukleaz, tzn jeżeli zostanie podstawiony niewłaściwy nukleotyd, cofa się, wycina kawałek nowo zsyntetyzowanej nici i syntetyzuje ją ponownie. Błędność procesu jest niewielka, dokładność nie jest 100%, bez niej nie byłoby ewolucji, nie następowały by zmiany , które prowadzą do powstania nowych gatunków i ewentualnie korzystnych dla organizmów cech.

Zmiany mogą występować w wyniku zjawiska zwanego tautomeryzacją. Zasady zmieniają się w inne formy: ketotymina w enoltyminę, aminoadenina w tyminoadeninę, enolguanina w ketoadeninę itp. Zmiana tautomeryczna takiej zasady powoduję, że A tworzy parę z C zamiast z T, G zamiast A) to może prowadzić do podstawienia nie prawidłowej zasady, i zmian później po replikacji-nowa cząsteczka DNA.

Ślizg polimerazy polimeraza DNA potrafi się ślizgać. Skutkiem tzw. poślizgu jest postanie małych duplikacji, dwunukleotydowych, trójnukleotydowych. Polimeraza, trafiając zwłaszcza na trakt powtórzeń (wiele z rzędu powtórzeń np.:CA) - to replikując potrafi dodać taką parę czy trójkę.W latach 90-tych stwierdzono, że szereg dość poważnych chorób dziedzicznych u człowieka wynika z mechanizmu, u podłoża którego leży prawdopodobnie poślizg polimerazy. Molekularny mechanizm tego zjawiska nie jest znany, ale znane są efekty tego zjawiska .

( tabelka,Genomy, str. 345)

W tych genach występują powtórzenia w obrębie sekwencji kodujących- powtórzenie trójek CAG lub GCC i normalnie jest 10 do 35 w genie Hdh wtedy kiedy tych powtórzeń jest więcej- 36 do 121 mamy do czynienia z chorobą Huntingtona(Genomy, str. 345)-niekontrolowane ruch, ciężka choroba neurodegeneracyjna. Inne choroby(tabelka).

Czynniki mutageniczne, których mechanizm działania jest dobrze znany :

• Promieniowanie ultrafioletowe -powoduje powstawanie dimerów tyminowych- następuje wytworzenie mostka pomiędzy dwoma występującymi obok siebie w łańcuchu tyminami. Taka mutacja może być usuwana na różne sposoby. Jednym z nich jest fotoreaktywacja, ponieważ u bakterii i innych organizmów występuje enzym fotoliza, która pod wpływem światła (a nie UV) powoduje rozcięcie tego wiązania. Najprostsze doświadczenie: naświetlamy UV bakterie, dzielimy na dwie grupy-jedną umieszczamy w świetle, drugą w ciemności =>na świetle przeżyje dużo większa część, niż tych umieszczonych w ciemności (ponieważ nie działa fotoliza).

• Promieniowanie X- świadomość tego ze wywołuje mutacje rozwinęła się bardzo późno. 1928 roku Miller stwierdził, że promieniowanie X wywołuje mutacje u Drosophila

Do świadomości społecznej doszło bardzo późno. W pewnym sklepie: mały aparacik rentgenowski do sprawdzania czy buciki pasują na dzieci( czy paluszki nie dotykają czubka buta)-, sama Maria Curie jeździła z aparatem rentgenowskim na frontach I-wszej Wojny Światowej

Cały szereg chemicznych związków mutagenicznych

wiemy od czasów Charlotte Auerbach(?) która w czasie II-ugiej WŚ zajmując się działaniem gazów bojowych (iperyt, luizyt, fosgen) stwierdziła, że wywołują bardzo silne mutacje, oprócz innych efektów toksycznych.[wykład ze stanów: pan Ames użył łatwo mutujących bakterii, mógł wykryć nawet związki słabo mutagenne. Jednemu ze studentów kazał zbadać związki domowego użytku-okazało się ze większość z nich była silnymi mutagenami, a najsilniejszymi są damskie farby do włosów Clairol- do których dodawano związków akrydynowych(męskie nie- dlaczego? ponieważ kobiety siusiając nie widzą swojego moczu a mężczyźni tak i producenci farb musieli unikać substancji, przenikających przez skórę i wydzielanych z moczem(czarnym, czerwonym). Ames pokazał też torebkę chipsów-17 pozycji -przynajmniej kilka związków silnie mutagenicznych, część podejrzana . W latach 70-tych obudziła się świadomość(mutacje nowotwór, przyszłe pokolenia, jesteśmy dużo bardziej uczuleni na testowanie żywności, leków kosmetyków, dziś już są wszędzie wykonywanych, dodatkowym impulsem do wprowadzania testów była afera z talidomidem- środkiem przeciwbólowym. Matki , które w czasie ciąży zażywały- rodziły dzieci z poważnymi wadami( brak rąk, nóg)szczególnie w Holandii, a był zalecany dla kobiet w ciąży właśnie jako mało szkodliwy…)od tego czasu dopuszczenie leków wymaga wielu (wieloletnich) testów ( Amesa, na zwierzętach)] Związek chemiczny wywołujące mutacje

-bromek etydyny (używany do barwienia DNA), związki akrydynowe, interkalują pomiędzy dwie nicie DNA i powodują odkształcenia tej struktury DNA

Następuje wtedy odkształcenie struktury w wyniku pojawienia się dimeru tyminowego, w przypadku interkalacji cząsteczki jakiegoś związku chemicznego, uszkodzenie takie jest rozpoznawane przez aparat enzymatyczny komórki i usuwane. Wszystkie procesy naprawy DNA są mniej wierne niż proces podstawowy replikacji DNA- usuwane jest uszkodzenie, ale w wielu wypadkach przy naprawie powstają błędy. By zobaczyć mechanizm naprawy uszkodzeń DNA ( i nie tylko), otrzymuje się mutanty i bada się to, co zaszło wśród zmutowanych szczepów, dlaczego inaczej reagują- są dużo bardzie lub mniej wrażliwe na np.: ultrafiotel czy na inne mutageny.

Tabelka z „myszek” ,249

Sporo takich mutantów znaleziono np.: u E.coli . Np.: mutanty oznaczane symbolem uvA(BCD)są bardziej wrażliwe na ultrafiolet. Mutacje w genach kodujących różne enzymy: rozmaite endonukleazy, helikazy itp. U jednych mutantów zwiększona częstość mutacji. Zwiększona częstość mutacji i przeżywalność to nie jest to samo. Przeżywalność po UV jest jakaś tam- w wyniku mutacji w jakimś tam genie może być zwiększona. Wśród komórek E.coli, które przeżyją naświetlanie dawką UV mogą powstawać mutanty z określoną częstością - mniejszą lub w tym przypadku większą. W przypadku mutantów uvb -zwiększona wrażliwość, ale jest mniejsza liczba mutantów wśród tych które przeżyją. Grupa mutantów recA(BCD)-głównym jest gen recA (nazwa genów od rekombinacji). Mutacja w tych genach powoduje zmniejszoną częstość rekombinacji. Procesy mutacji i rekombinacji są ze sobą ściśle związane.

Mechanizmy naprawy uszkodzeń DNA

Fotoreaktywacja w przypadku UV- powstaje dimer tyminowy i cytozynowy, zostaje przecięty- nie ma dimeru, ale jeśli takich dimerów powstanie bardzo dużo, fotoliaza( enzym odpowiedzialny za usuwanie dimerów) nie zadziała i nie usunie wszystkich, bądź tez jeśli powstaną jakiekolwiek inne zmiany w DNA powodujące odkształcenie regularnej struktury podwójnej helisy to mamy 2 możliwości naprawy DNA

(1)wycinanie i naprawa

(2)naprawa rekombinacyjna

Ad1. Jeśli nastąpi jakaś zmiana, nacinana jest nić DNA po obu stronach zmienionego miejsca, egzonukleaza ucina ten fragment i polimeraza I( myślano, że to enzym odpowiedzialny za replikację DNA, ponieważ jest go bardzo wiele w komórkach E.coli, okazało się że jest to enzym biorący udział tylko w naprawie pomutacyjnej w DNA), wreszcie ligaza która łączy szkielet DNA w odpowiednim miejscu. Kiedy Konrad(??) odkrył gen pol A , myślano, że to był główny enzym, potem okazało się, że mutacje z tym genie nie są letalne- można żyć bez polimerazy, ale szczep dużo częściej mutuje (mutant nie potrafi naprawiać uszkodzeń DNA). (schemacik-pokazuje jak działają enzymy-kiedy jest jakakolwiek deformacja w DNA, przyłącza się produkt genu odpowiedniego i rozpoznaje zmienione miejsce, przyłącza się następny B, A się odłącza, do B jest przyłączany C, nacinanie rozplecenie i cały proces naprawy uszkodzenia).( jeszcze jeden schemacik -uszkodzenie struktury -przyłączają się białka, i następuje naprawa)

Prosty mechanizm-rozpoznanie zniekształcenia, nacięcie po obu stronach, poszerzeniu, wytworzeniu luki, dosyntetyzowaniu brakującego kawałka.

Ad 2.Proces rekombinacji-jeżeli powstanie jakieś odkształcenie( dimer tyminowy, czy jakaścząsteczka interkalowana- bromek etydyny czy barwnik akrydynowy) to w czasie replikacji (jeśli zmiana nie zostanie usunięta przez proces wycinania i reperacji) przed replikacją DNA-( czyli zmiana dotrwa do replikacji), nie zostanie zsyntetyzowany fragment łańcucha-powstanie luka w jednym z nowo syntetyzowanych łańcuchów. Wtedy zaczyna brać udział proces rekombinacji. (schemat)Istniejąca prawidłowa nić przeskakuje tu i tu dosyntetyzowywana jest z tej strony, i następuje przesunięcie =>druga wymiana- za pomocą matrycy dorobiona jest brakująca nić w drugiej cząsteczce . Do tego procesu potrzebny jest produkt genu RecA , którego jedną z głównych funkcji jest zapewnienie przemieszczania się pojedynczej nici DNA -wpenetrowania do duplexu DNA w innym miejscu -(rolą tego genu jest sterowanie jedną nicią =>umożliwienie pojedynczej nici przeskoczenia do drugiej cząsteczki). Ważne jest to zarówno w procesie naprawy uszkodzeń DNA (w naprawie po uszkodzeniu DNA) jak i w czasie normalnego procesu rekombinacji . Tutaj są inne białka SSB( single stand binding protein- opłaszczają pojedyncze nici by nie zostały zdegradowane)-te same które biorą udział w procesie replikacji DNA.

Gen recA -inna ważna funkcja- produkt tego genu ma właściwości proteolityczne -właściwości specyficznej proteazy, która przecina i dezaktywuje białko LexA( LexA jest , białkiem regulacyjnym - represorem, które blokuje aktywność 17 genów, również genu recA -(wszystkich genów związanych z naprawą uszkodzeń DNA=> geny są normalnie wyłączone-dopiero pojawienie się uszkodzeń w DNA powoduje indukcję syntezy genu recA i jego produkt przecina białko LexA, następuje odblokowanie transkrypcji wszystkich genów z tabelki(chyba ze str. 249)jest to tzw. reakcja SOS- aktywacja genów związanych z naprawą uszkodzeń w DNA, w promotorach tych wszystkich genów są sekwencje identyczne rozpoznawane przez produkt genu lexA i geny te są na stałe blokowane przez LexA , pojawiają się uszkodzenia DNA=> stymulacja syntezy RecA=> likwidacja LexA=> zaczyna bardzo szybko funkcjonować system naprawy uszkodzeń DNA.

W czasie naprawy DNA preferencyjnie jest naprawiana nić z nieprawidłowo wstawioną zasadą, a nie ta która ma prawidłowa sekwencję. Na skutek błędu w czasie ( w czasie replikacji powstaje nie pasująca para zasad ( np.: AG) mismatch . Uszkodzenie to może zostać naprawione w obu kierunkach- tzn. wyjściowa do nowej lub nowa ( przywrócenie stanu sprzed mutacji).Naprawa we właściwym kierunku zachodzi częściej . Jest to wynikiem metylacji (w czteronukleotydowych sekwencjach GATC( CTAG w drugiej nici) Dammetylazę, metyzacja starej nici zachodzi jakiś czas po replikacji, więc stara nić jest zmetylowana, nowa jeszcze nie (będzie z jakiś czas). Jeżeli powstanie w jakimś miejscu DNA para nie pasująca A(stara)C(nowa) to naprzeciwko A pojawi się T - system naprawy enzymatycznej będzie naprawiał nową nić, a nie nić zmetylowaną. Niektóre z enzymów „naprawczych” przyłączają się do nici niezmetylowanej i na tym opiera się rozróżnienie między nową a stara nicią. Jest to zabezpieczenie przed złą reperacją.

schemat - system naprawy pęknięć dwuniciowych w DNA. Np.; promieniowanie X powoduje przecięcia obu nici DNA naprzeciwko siebie- takie uszkodzenia mogą być naprawiane przez specjalne białko, którego funkcja polega na tym żeby: włączyć, przytrzymać nici obok siebie (wolne końce które zostały zerwane), i wtedy następuje łączenie się kolejnych białek, w tym specjalnej ligazy 4 i naprawiana jest uszkodzona cząsteczka DNA.

System naprawy uszkodzeń jest znany zarówno u bakterii(najlepiej), u drożdzy. Od bakterii po kręgowce wygląda dość podobnie. Mutacja w genie kodującym ludzką fotoliazę ( enzym rozcinający dimery tynimowe i cytydynowe) powoduje chorobę zwaną Xeroderma pigmentosum - objawia się pojawianiem ciemnych plam na skórze (szybko w tych obszarach skóry może dojść do zmian nowotworowych ). Chorzy nie powinni się opalać i wystawiać na promieniowanie UV, powinny używać kremów z blokerami.


kiedyś myślano że na zewnątrz nie ważne( kolor oczu Drosophili) geny a w środku ważne, a dziś wiemy ze nie ma innych mniej ważnych pod względem budowy. W profazie podziału mejotycznego, od dawna obserwowano chiazmy i tu podane są wypadki, które maja miejsce w czasie mejozy- koniec replikacji , pojawiają się pęknięcia, łączą się, rekombinacja cząsteczki. To wszystko dzieje się w profazie od leptotenu po diploten.

Zdjęcie mikroskopu elektronowego -cząsteczek wirusa DNA, przyłapanego w czasie rekombinacji. Połączone dwie nici DNA w trakcie rekombinacji, później zostaną rozcięte , powstaną dwie cząsteczki DNA, które wymieniły się fragmentami swego ”chromosomu”.

Rekombinacje badano bardzo intensywnie już kilkadziesiąt lat temu, metodami genetycznymi, nie molekularnymi. Świetnym modelem do badania rekombinacji są grzyby workowce( grzyby których wszystkie produkty mejozy znajdują się w jednym miejscu nazywanym workiem). Powstają 4 jądra po każdej mejozie, z których każde przechodzi jeszcze podział mitotyczny i powstaje worek, gdzie mamy ułożone podwójnie askospory. (coś o płaszczyznach podziału mejotycznego). Wyobraźmy sobie taką sytuację: mamy dwa chromosomy rekombinujące- mamy jeden chromosom złożony z dwóch chromatyd i drugi- pękają na krzyż i łącza się ze sobą, po pierwszym podziale mejotycznym rozchodzą się centromery, po drugim podziale pękają (centromery)-powstają cztery jądra komórkowe, później każde dzieli się mitotycznie, powstaje worek złożony z 8 spor(jader komórkowych), na których możemy śledzić proces rekombinacji w czasie podziałów mejotycznych. Z badań wynikła obserwacja, że rekombinują pomiędzy sobą chromatydy a nie chromosomy tzn. że nie ma naraz wymiany u obu chromatyd. Możemy skrzyżować np. mutanta o białych sporach ze szczepem dzikim o czarnych sporach, po rekombinacji zawsze otrzymamy 4 spory czarnie i 4 białe, gdyby rekombinowały całe chromosomy a nie chromatydy to układ zawsze byłby zawsze 4 czarne u góry 4 białe u dołu( lub na odwrót ), natomiast można otrzymać worki 2-2-2-2, albo układ 2-4-2(c-b-c,b-c-b) co wskazuje, że rekombinacja zachodzi tak jak na rysunku(?). Stwierdzono, że z pewną częstością powstają worki w których nie jest zachowany układ spor 1:1(4:4), ale np.3b-5c lub 3c-5b, co wskazuje na proces rekombinacji niewzajemnej( później dopiero odkryto jak to się dzieje). Badając na bardzo wielkiej licznie potomnych osobników jakAspergillus, Neurospora itp. gdzie można otrzymywać i analizować miliony osobników potomnych, można było robić krzyżówki wielopunktowe, które na bliskich sobie obszarach jakiegoś chromosomu miały 5 odpowiednio rozlokowanych mutacji. Umożliwiło to badanie zjawisk na dużym dobrze wyznakowanym genetycznie obszarze. Można było stwierdzić zachodzenie zjawiska interferencji tzn jeżeli zajdzie crossing over na jednym obszarze jest mniejsze prawdopodobieństwo zajścia c.o na obszarze sąsiednim. Badanie rekombinacji na odcinkach bardzo małych, w obrębie jednego genu, mamy zjawisko odwrotne: zajście jednego c.o. stymuluje zajście następnego c.o. w odcinku sąsiednim. Mając do czynienia z rekombinacja, nici muszą się skrzyżować i spotkać, dochodzi do obszaru efektywnego kontaktu. Nić ma jednak pewną sztywność, jeśli splecenie zachodzi w jednym miejscu to następne skrzyżowanie nie może być tuż obok. W momencie kontaktu, w danym miejscu może być wiele wymian pomiędzy uczestniczącymi chromatydami, z których wszystkie nieparzyste będziemy obserwowali jako rekombinanty, a parzyste nic nie zmienią, ponieważ powróci układ początkowy ( druga zmiana niweluje efekt mutacji).

Badania czysto genetyczne, oparte na analizie potomstwa krzyżówek, umożliwiły stworzenie pewnych modeli rekombinacji jeszcze przed poznaniem całego aparatu enzymatycznego i genów biorących udział w procesie. Modele zostały potwierdzone przez badania molekularne.

Obrazek- schemat mechanizmu wymiany: mamy 2 podwójne nici DNA, pękają, końce wędrują do przeciwnych cząsteczek dwuniciowych( potrzebne białko RacA albo jego odpowiednik u innych organizmów- umożliwiające przesunięcie pojedynczej nici),następuje ligacja- otrzymujemy połączone pojedyncze nici dwóch łańcuchów DNA ze sobą i skrzyżowane. Miejsce skrzyżowania może się przesuwać w lewo i prawo( ang range? migration).Jest to istotne, ponieważ efektem przesunięcia jest powstanie heteroduplexu (cząsteczka DNA gdzie jedna nić pochodzi z jednej cząsteczki, a druga z drugiej).Jeśli np.: w danym miejscu była mutacja zamieniająca parę AT w GC to w pewnym miejscu znajdą się nie pasujące do siebie pary zasad(AG, CT), struktura regularnej helisy będzie zniekształcona=> zostaną włączone procesy reparacji DNA. Naprawa może być zrobiona według jednej bądź drugiej nic=> dlatego możemy zaobserwować u grzybów worki zawierające układ spor 5-3 i 3-5 , a nie tylko 4-4. Allel dziki może zostać naprawiony w kierunku zmutowanego-bądź na odwrót.( rekombinacja niewzajemna)

Rekombinacja homologiczna uprawniona

(rekombinacja-zdolność do wymiany odcinków między homologicznymi cząsteczkami DNA)

proces wymiany odcinków chromosomów czy chromatyd, czy nici w cząsteczce DNA; homologiczna-ponieważ cały proces opiera się na tworzeniu łańcuchów komplementarnych w DNA, nici te łączą się ze sobą, wymieniane są fragmenty nici pomiędzy homologicznymi odcinkami DNA. Fakt, chromosomy homologiczne spotykają się w profazie mejozy, nie może wynikać z zasady łączenia par AT i CG. Do tej pory mechanizm łączenia w kompleks synaptonemalny nie jest znany ( być może wchodzą w grę powtarzające się sekwencje i związane z nimi białka-one odpowiadają za sparowanie chromosomów homologicznych), ale sama wymiana, proces c.o oparty o zasadę homologii dwóch nici(AT,GC) i wymiana między tymi odcinkami tak.

Model rekombinacji Hollidaya

skrzyżowanie=> połączenie =>ligacja =>”krzyż św. Andrzeja”=> następuje pęknięcie wzdłuż jednej z osi- w zależności od tego może zajść wymiana nici( jedna część z jednej chromatydy, druga z drugiej) bądź odtworzenie stanu prawie wyjściowego. Znana jest enzymatyka tego procesu( RecA, ligaza- łączy, topoizomerazy helikazy- ułatwiają przesuwanie punktu skrzyżowania, nukleazy-przecinają kompleks)na tyle, iż można to wykorzystywać do rozmaitych eksperymentów na DNA: z 2 lub więcej kolistych cząsteczek robić cząsteczki „łańcuszkowe” i izolować produkty.

Widać, że model z wcześniejszych lat (chromatydy pękają i łączą się na krzyż) jest w pewnym sensie słuszny, o ile miejsce połączenia zostanie odpowiednio przecięte. Rekombinacja niewzajemna wynika z przesunięcia nici-tworzy się heteroduplex- jeżeli w jego obszarze są jakieś zmiany to może nastąpić naprawa uszkodzeń i możemy mieć dodatkowe efekty.

Rekombinacja niehomologiczna nieuprawniona

(rola w ewolucji)

Zjawisko skaczących genów wykryte przez Barbarę McClintock w latach 50-tych (nobel w latach 90-tych), badając kukurydzę, robiąc liczne krzyżówki między mutantami różniącymi się barwą ziarna, geny odpowiedzialne za barwy nasion zachowywały się sprzecznie z prawami Mendla. Opublikowała szereg artykułów o ruchomych elementach genetycznych. W tamtych czasach teoria Morgana była świętością- zwłaszcza zasada liniowości ułożenia genów na chromosomie(często tak jest, inaczej nie można byłoby ułożyć mapy genetycznej ). Wykrycie ruchomych elementów genetycznych u bakterii i zbadanie tego zjawiska na poziomie molekularnym sprawiło, że wrócono do jej prac. Okazało się, że ruchome elementy genetyczne i zjawisko rekombinacji niehomologicznej (rekombinacji nieuprawnionej) jest zjawiskiem powszechnie występującym u organizmów eukariotycznych i prokariotycznych.

Odbywa się bez homologii, jest RecA niezależne (inny mechanizm)

Przykład-integracja faga λ do chromosomu E.coli- rekombinują 2 cząsteczki DNA-opiera się na 16-nukleotydowej sekwencji- rozpoznają się 2 cząsteczki, następuje rekombinacja/włączenie.

Ruchome elementy genetyczne u bakterii bardzo dużo -zwanych sekwencjami insercyjnymi( IS ) albo transpozonami -posiadają one zdolność do przenoszenie z jednego miejsca chromosomu w drugie.

IS

• 768 par zasad do ok. 1500

• standardowa budowa: część centralna

• odwrócone powtórzenia końcowe o długości od 9 do 41 par zasad

• do przejścia w inne miejsce potrzebne białka zwane transpozazami, wspomagają proces rekombinacji

• w wielu wypadkach preferencje do miejsca, gdzie dany element może się znaleźć, w wielu wypadkach tzw. hot-spots- sekwencje chętniej się włączają

• w środku brak genów

Transpozony

• większy element

• na końcu powtórzone sekwencje, bardzo często IS ( flankują z obu stron)

• w środku przenoszone geny- często geny kodujące enzymy potrzebne do transpozycji

• - u bakterii często geny warunkujące odporność na antybiotyki,

• Główna przyczyna odporności na antybiotyki: bakterie mogą wymieniać między sobą

materiał genetyczny, w szczególności geny kodujące oporność na antybiotyki są

przenoszone w transpozonach i mogą „przeskakiwać” z jednej bakterii do drugiej.

• Przykłady-( omówienie tabelki, „myszki”271)

Genetyczne markery w trasnpozonie: oporność na kanamycynę, chloramfenikol,

tetracyklinę. Końcowe sekwencje: ISy lub sekwencje nie odwrócone.

Przemieszczenie transpozonów:

(1)wycinanie i przeskakiwanie z pierwszego miejsca w drugie, znikając z tego pierwszego

(2)pozostaje na miejscu, a po replikacji identyczna kopia transpozonu pojawia się w

nowym miejscu

Mechanizm transpozycji

• -transpozycja zachodzi w określonym miejscu, gdzie rozpoznawana jest odpowiednia sekwencja (np.: ATGCA)

• -po transpozycji, jeśli transpozon wchodzi mający zakończenia powtarzające się na końcu i odwrócone to sekwencja docelowa jest zduplikowana i występuje po obu stronach transpozonu - odcinek DNA przeskakuje z jednego miejsca w drugie, i po przeskoczeniu duplikowana jest sekwencja będąca docelową a teraz znajduje się po obu stronach włączonego kawałka DNA

• Skąd się biorą powtórzenia? Mamy krótką sekwencje rozpoznawaną przez transpozon, w pierwszym etapie jest nacięcie sekwencji docelowej nie naprzeciwko siebie -powstają lepkie końce, powstają fragmenty pojedynczych nici i zostaje doreplikowana ta krótka sekwencja, efektem są powtórzenia tej sekwencji po obu stronach.

Rekombinacje bada się często na cząsteczkach kolistych (omówienie rysunku;”myszki” 275),

gdzie możemy badać produkty wzajemnej rekombinacji. Powstanie kointegratu..itp

Mechanizm: nacięcie przez odpowiednie enzymy pewnych sekwencji, wytwarzają się lepkie końce, włącznie transpozonu, doreplikowanie brakujących części , powstaje kointergat, następnie zachodzi rekombinacja pomiędzy transpozonami, rozdzielenie kointergatu. Enzymatyka tego procesu nie jest zbyt dobrze znana, ale mechanizm molekularny tak.

Transpozony występują również u

-drożdzy, Ty

-D.melanogaster, copia

-ssaki ……

Retro (trans)pozony- retro, bo duża analogia do wirusów RNA;

Na końcach transpozonów długie terminalne powtórzenia (LTR), powtórzenia które generuje włączony transpozon (4-6 nukleotydów), w środku zawierają geny potrzebne do transpozycji ( integrazy , transportazy), nie muszą zawierać mRNA .

Mechanizm transpozycji: (jak u wirusów RNA) cząsteczka RNA jest przepisywana na DNA i integrowana do genomu (schemacik retrowirusowy ”myszki”, 277)

LTR-(Geny) 3-gag, pol, env-LTR

Środek w przypadku transpozonów jest, inny ale są pewne homologie do odcinków spotykanych w retrowirusach.

Mutageneza transpozonowa

W roztworze DNA złożonym z cząsteczek transpozonu, zawieszamy komórki bakteryjne czy drożdżowe. DNA wnika do środka, włącza się w jakieś miejsca i obserwujemy efekt fenotypowy (np.: bakteria zaczyna wymagać do wzrostu leucyny). Jeśli mutacja jest wynikiem włączenia transpozonu w środek genu, po mutacji gen jest wyznakowany (ponieważ tkwi tam transpozon). Używamy sondy molekularnej, fragmentu transpozonu , możemy zrobić bank genów ze zmutowanego organizmu, i znaleźć ten gen w którym jest transpozon. Wtedy wiemy, że za daną cechę odpowiada konkretny gen . Izolujemy, sekwencjonujemy, poznajemy produkt. Mutageneza transpozonowa jest bardzo przydatna w badaniu organizmów eukariotycznych ( mniej u bakterii): nie tylko prowadzi do mutacji, ale pozwala wyizolować geny zmutowane(dzięki znacznikowi) .

Genetyka z inżynierią genetyczną D/Wykład 14

Zmienność organizmów, ewolucja

W wyniku mutacji i rekombinacji powstają albo nowe właściwości, lub nowe kombinacje genów. Przeżywają osobniki najlepiej dostosowane w wyniku zmienności. (Genomy! - ewolucja wszechświata).

Ewolucja żywych organizmów - od 140 mln lat.

3,5 mld lat temu - życie było oparte o cząsteczki RNA samoreplikujące się, które łączyły się z pierwszymi białkami. Na matrycy RNA powstawały do nich komplementarne cząsteczki DNA, które przy pomocy białek zaczęły się replikować. Etap ewolucji na poziomie cząsteczek trwał prawdopodobnie bardzo długo.

Wśród teorii biologów molekularnych na temat ewolucji najbardziej znana jest zaproponowana przez Richarda Dawkinsa (to wg internetu, on chyba mówi coś o 2 osobach) o „Samolubnym genie”, w której twierdzi, że wszystko to, co obserwujemy, to nic innego tylko efekt konkurencji między replikatorami. Pierwotne cząsteczki DNA czy RNA nabyły zdolności do samopowielania się i podtrzymały ją.

Pewien altruizm: jeżeli kaczka, która udaje, że ma złamane skrzydło, i zamiast uciekać ryzykuje życie aby odciągnąć niebezpieczeństwo od gniazda, to działa wbrew zasadom Darwinowskim. W jej interesie byłaby ucieczka. Wynika to z faktu troski o los swojego replikatora, będącego też w organizmach jej potomstwa. To jest właśnie ten samolubny gen.

Jak powstają nowe geny?

Powstają zwykle w wyniku duplikacji - podwojenia genu, następnie przebiega niezależna ewolucja obu genów (różnicowanie w wyniku mutacji); *(u Michała:)oraz tasowania eksonów (ja nic takiego nie usłyszałam, poza tym tak to chyba nowe białka powstają…).

Przykład duplikacji: ewolucja genów α i β globiny; u bezkręgowców mamy mioglobinę a u kręgowców pojawiają się α i β globiny. Ostatnia w przypadku β globin duplikacja prawdopodobnie miała miejsce około 40 (?) mln lat temu. U człowieka hemoglobina A2 jest ostatnim nabytkiem ewolucyjnym. Duplikacje obejmowały też cały genom organizmu, np. drożdże - można wykryć, że kiedyś miały dwukrotnie mniejszą liczbę chromosomów, do dziś istnieją duże homologie między jakby dwiema częściami tego genomu.

Porównując chromosomy człowieka i szympansa to widać, że u człowieka jeden z chromosomów jest tym samym co dwa różne i niezależne chromosomy szympansa. W którymś momencie ewolucji musiało nastąpić połączenie tych chromosomów w jeden. Nadal widać homologie.

(?)Przykład tasowania: rodzina proteaz serynowych, egzony kodujące różne domeny przyłączone zostały do egzonów kodujących centrum aktywne

Skąd się wzięły i po co introny i eksony?

Jedna ze spekulacji głosi, że kiedyś było dużo krótkich genów, które kodowały białka, te białka tworzyły kompleksy i funkcjonalne cząsteczki, ale ten sam efekt można było osiągnąć przez system eksonów przedzielonych intronami. Różne teorie odnośnie pochodzenia i funkcji intronów.

W wyniku pojawienia się nowego genu pełniącego funkcje m.in. jakiegoś starszego genu tamten zanika, stąd wyższe organizmy nie różnią się tak drastycznie ilością genów od niższych

Ewolucję możemy badać śledząc zmiany w organizmie w ciągu tysięcy lat. Na podstawie danych w DNA możemy się cofnąć góra 30 tys lat wstecz. Analizą DNA można cofnąć się do Neandertalczyka i udowodnić, że nie był on naszym przodkiem.

Na podstawie analiz DNA ówcześnie żyjących gatunków można wyciągać wnioski co do ewolucji. Mniej więcej znamy tempo mutacji zachodzących w czasie. Możemy ustalić w jaki sposób i kiedy dane zmiany zachodziły. Na tej podstawie tworzone są systematyka czy filogenetyka.

Zaczęło się od analizy białek; porównywanie grup krwi oraz częstości ich występowania z różnicami w pochodzeniu żołnierzy w czasie I wojny światowej.

Na podstawie analiz DNA można wyciągać wnioski co do pokrewieństwa czy odległości pomiędzy poszczególnymi grupami organizmów. Analiza molekularna oparta o badanie sekwencji DNA jest jedną z ważniejszych metod analizy ewolucji, pokrewieństwa pomiędzy organizmami.

Zastosowania genetyki molekularnej w praktyce

• W książce Molecular Cloning opisana jest cała praktyka (skład buforów, temperatura reakcji itp.; także wymienione programy komputerowe z opisem do czego służą)

• Strona bioinformatyczna: programy komputerowe: np. Klonowanie in silico - program dobiera nam odpowiedni enzym restrykcyjny, wektor itp.; programy takie służą także do wyszukiwania, porównywania sekwencji, najrozmaitszych elementów w DNA; BLAST - szukanie podobieństw między białkami na podstawie sekwencji aminokwasów. Są już także programy wyszukujące podobieństwa między białkami na postawie struktury.

• Produkcja substancji w mikroorganizmach (głównie bakteriach i drożdżach), np. insuliny, hormonu wzrostu itd. Produkuje się także białka zmodyfikowane, m.in. enzymy, chociażby te do proszków do prania.

), aby wydzielały na zewnątrz daną substancję, lub aby pełniły jakieś funkcje w środowisku, np. rozkład szkodliwych substancji (biologiczne oczyszczalnie ścieków), ługowanie metali.*Modyfikuje się też mikroorganizmy (udoskonala

• Udoskonalanie roślin: np. zastosowanie systemu transferu genów za pomocą plazmidu Ti u A. tumefaciens (tworzy brodawki na korzeniach roślin motylkowych; chromosomy bakterii mogą przejść do komórek roślinnych):

• Dobry system przenoszenia genów do roślin.Zwykle klonuje się geny do E.coli na jednym plazmidzie, następnie doprowadza do fuzji E. Coli z Agrobacterium (E. coli infekuje komórki roślinne wprowadzając konkretny gen).

• .*Wyłącznie genu u roślin: Agrobacterium z plazmidem Ti, klonuje się na plazmid fragment DNA, który koduje antysensowny RNA łączący się z sensownym RNA. Powoduje to wyciszenie niektórych genów lub blokuje transkrypcję niektórych genów (wyłączenie konkretnych genów w roślinie). Stosuje się to aby przyspieszyć/opóźnić kwitnienie; w przypadku pomidorów wyłączano pewne geny aby spowodować jednoczesne ich dojrzewanie na całej roślinie (to umożliwia ich zbiór za pomocą maszyn). Otrzymano też kwadratowe pomidory, które łatwiej można ułożyć w pudełku, ale przyleganie powodowało częstsze gnicie i się nie przyjęły

• Niemal wszystkie rośliny użytkowe są w odmianach transgenicznych; daje to średnio o około 20% podniesienie wydajności w stosunku do roślin „normalnych”

• Wprowadzenie do roślin genu z Bacillus thuringiensis, kodującego białko zniechęcające owady od kontaktu z rośliną. To wpływa na zwiększenie plonów.

• Manipulacje dotyczące roślin są wykonywane nie tylko w roślinach, np. na powierzchni liści drzew cytrusowych jest bardzo liczna flora bakteryjna. Bakterie bytujące na liściach są ośrodkami krystalizacji lodu. Po przymrozku lód zamarza od miejsc, w których są skupiska bakterii, co prowadzi do uszkodzeń, nekroz i innych chorób roślin, w wyniku czego giną całe plantacje. Zmodyfikowano te bakterie (zmieniono im białko odpowiedzialne za krystalizację) tak, że zaczynają być ośrodkiem krystalizacji lodu, ale przy temperaturach o kilka stopni niższych niż normalne bakterie. Spryskuje się sady tymi zmodyfikowanymi bakteriami i to pozwala sadom wytrzymać temperatury około -7ºC.

• ). Transgeniczne zwierzęta sprawiają dużo problemów (wiele prób, aby otrzymać to, co chcemy, trzeba mieć zastępcze matki), poza tym takie doświadczenia są kosztowne. Zabiegi takie są najbardziej popularne u hodowców koni - robi się koniki szybko biegające czy nie męczące się bardzo… Sporo jest zwierząt transgenicznych mających wartość użytkową, np. produkujących określone białka przez świnie czy krowy. Ma to tę zaletę, że produkowane białka są odpowiednio zmodyfikowane, w taki sposób, jak robią to kręgowce.*Prace nad organizmami transgenicznymi dotyczą także zwierząt: nastrzykuje się na mikromanipulatorze oocyt po pierwszym podziale jądra i wprowadza się DNA z kilkuset tysiącami kopii genu, który chcemy wprowadzić. Pierwsze takie doświadczenia dotyczyły myszy, której wprowadzono hormon wzrostu ze szczura. Tego samego rodzaju zabiegi wykonano na zwierzętach hodowlanych, ale duże odmiany okazały się ekonomicznie nieopłacalne (np. duża świnia ważąca dwa razy więcej niż normalna je trzy razy więcej

Medycyna - terapia genowa

Próbuje się leczyć ludzkie choroby poprzez wprowadzanie odpowiednich genów. Doświadczenia przeprowadza się najpierw na zwierzętach, zwykle na myszach. Dopiero później wprowadza się gen do człowieka.

Przykłady terapii genowych:

• Wprowadzenie genu na apolipoproteinę B, co powoduje obniżenie poziomu cholesterolu i rozpuszczanie złogów cholesterolu w naczyniach krwionośnych u myszy.

• Wprowadzanie genów na czynnik wzrostu komórek nabłonka naczyń krwionośnych (VEGF). Geny te wprowadzane są często przy niedotlenieniu naczyń obwodowych w kończynach, co bardzo często kończy się amputacją. Wprowadzenie genu VEGF usprawnia krążenie, że można amputacji uniknąć. Problemem jest sprawienie, aby ten gen możliwie długo funkcjonował. Używa się wektorów adenowirusowych, gen wprowadza się do mięśnia sercowego. Jednak nie jest to bardzo wydajne, gdyż geny VEGF przestają po pewnym czasie funkcjonować.

• Terapia genowa w chorobie Alzheimera - wprowadzono do mózgu czynnika wzrostowego dla komórek nerwowych - gen na NGF (nerve growth factor); 2001r, zabieg taki przeprowadzono na 8 pacjentach. Z tych 8 jeden pacjent zmarł na serce, 7 żyje i stwierdzono u nich dużo wolniejszy postęp choroby. Zabieg polega na tym, że od pacjenta bierze się komórki fibroblastów, do których wprowadza się gen podczepiony pod wektor ekspresyjny. Komórki fibroblastów wprowadza się do mózgu osób chorych (wymaga to trepanacji czaszki). Cały proces przeprowadzano na osobach we wczesnym stadium choroby, które nie brały żadnych leków. Sprawdzanie skuteczności tej metody odbywało się poprzez serię testów psychologicznych mających ocenić stan umysłowy pacjenta. Ryzyko: wylew krwi do mózgu (komórki w mózgu implantuje się w kilku miejscach, 1-5% ryzyka wylewu krwi do mózgu, co może powodować śmierć lub trwałe uszkodzenie mózgu). Może także powstać guz mózgu (poprzez wprowadzone komórki, które mogą zacząć szybko się dzielić i spowodować nowotwór). Istnieje także ryzyko chronicznego bólu głowy.

Typów terapii genowych jest dziś bardzo dużo (67% to Stany Zjednoczone, w Europie przoduje Anglia). Geny wprowadza się na retrowirusach, adenowirusach, za pomocą liposomów (lipofekcja). Przedmiotem leczenia są choroby jednogenowe, np. anemia sierpowata. Główny wysiłek skierowany jest na leczenie nowotworów, za pomącą wprowadzenia supresorów nowotworowych lub genów pobudzających odporność komórek tak, żeby układ immunologiczny zaczął zwalczać komórki nowotworowe.

W trzeciej fazie badań klinicznych są szczepionki przeciwnowotworowe, więc są już testowane na ludziach.

1938 - rozpoczęcie produkcji penicyliny na skalę przemysłową

1988 - amerykański patent na mysz podatną na nowotwory (nude mice - mysz pozbawiona układu immunologicznego)

1996 - genomika, poznanie genomu drożdży

2002 - genom ludzki

); to nie jest wielki fag, ale pokazano, że można chemicznie stworzyć coś, co potrafi się replikować i kierować swoim rozwojem*2003 - chemiczna synteza pełnego genomu Fag ? 174 (niewyraźnie

koniec lat 80tych - „gorączka złota” w biotechnologii (chyba chodziło mu o to, że można było na biotechnologii dużo zarobić…)

---