Podstawy diagnostyki hematologicznej.

Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej

UM w Łodzi

Etapy hematopoezy.

HSC

CFU-blast kom. ukierunkowana

CFU - GEMM limfoblast

CFU-Mega BFU-E CFU-GM prolimfocyt

megakarioblast CFU-E CFU-G CFU-M limfocyt

promegakariocyt pronormoblast mieloblast monoblast szpik grasica

erytroblast zas. promielocyt promonocyt

erytroblast poli mielocyt

erytroblast kw metamielocyt

megakariocyt . Th

. LB Ts LT

makrofag

retykulocyt gr. o jądrze pałki

T ef

PLT RBC Neu, Eo, Bas Mon Plazmocyt Tc

40-80% komórkowości szpiku - szereg rozwojowy granulocytarny

Proporcje układu białokrwinkowego do czerwonokrwinkowego = 3:1 lub 4:1

10-30% komórkowości szpiku - erytropoeza normoblastyczna

Morfologia krwi obwodowej.

Metody pobierania materiału.

1.     Rodzaj i objętość krwi.

• krew żylna pobrana z żyły odłokciowej, najlepiej bez stazy uciskowej lub przy krótkotrwałym ucisku.

• krew tętnicza lub arterializowana włośniczkowa.

• objętość krwi powinna być taka, aby:

• można było wykonać przynajmniej kilka oznaczeń (od 10 do 250 ml). ale !!!!!!! optymalnie 1,0 ml do badań pediatrycznych i 2,0 ml dla dorosłych

2.    Sposób pobierania krwi.

• systemy bezpiecznego pobierania krwi, tzw. probówko-strzykawki próżniowe zawierające odpowiednią masę lub objętość antykoagulantu

• podobierana krew włośniczkowa, po nakłuciu lancetem, musi swobodnie wypływać do kapilary lub mikroprobówki zawierającej antykoagulant. W żadnym przypadku krew nie może być wyciskana.

3.Antykoagulant.

• K2EDTA lub K3EDTA (ethyleno-dwuamino-czterooctan dwu lub trzy potasowy); wiąże on Ca2+ przeciwdziałając w ten sposób agregacji płytek, a dalej powstawania skrzepu.

Stężenie EDTA = 1,5 mg/ml

• zbyt małe - powoduje powstawanie mikroskrzepów

• zbyt duże - powoduje wzrost ciśnienia osmotycznego we krwi powodując kurczenie się komórek (szczególnie wrażliwe są erytrocyty i trombocyty)

• heparyna i cytrynian sodu ze względu na pseudotrombocytopenię EDTA-zależną o podłożu immunologicznym, a niekiedy nawet nie związaną z obecnością przeciwciał.

Istnieje wiele patologii, które „in vivo” zwiększają reaktywność płytek krwi lub wręcz wywołują agragację płytek, np.: zawał mięśnia sercowego, cukrzyca, choroby nowotworowe.

4.Czas badania.

• analiza próbki powinna nastąpić:

• bezpośrednio po pobraniu w celu wyeliminowania błędów związanych ze spontaniczną agregacja płytek

• lub w czasie 0,5 do 4,0 godzin

• analizę przeprowadza się w temperaturze pokojowej (18-25°C );

• próbka powinna być przechowywana i transportowana w temp. 4 - 8 °C.

po transporcie, czy przechowywaniu w niskiej temperaturze przed wykonaniem badania krew należy ogrzać do temperatury otoczenia.

w niskiej temperaturze wzrasta lepkość krwi,

- elementy krwi zlepiają się,

- zmianie ulegają wskaźniki związane z objętością krwinek czerwonych i płytek krwi,

- zmienia się wzór odsetkowy krwinek białych.

- komórki patologiczne mogą ulegać apoptozie i rozpadowi nawet w czasie do kilu godzin po pobraniu.

Parametry układu czerwonokrwinkowego.

RBC - liczba krwinek czerwonych

HBG - stężenie hemoglobiny we krwi

HCT - wskaźnik hematokrytowy

PCV - łączna objętość elementów morfotycznych krwi

MCV - średnia objętość krwinek czerwonych

MCH - średnia masa hemoglobiny w krwinkach czerwonych

MCHC - średnie stężenie hemoglobiny w krwinkach czerwonych

RDW - wskaźnik zróżnicowania objętości krwinek czerwonych

HDW - wskaźnik zróżnicowania zawartości hemoglobiny

w krwinkach czerwonych

RETC - liczba lub odsetek retykulocytów

IRF - frakcja niedojrzałych retykulocytów

NRBC - bezwzględna liczba erytroblastów

Parametry układu białokrwinkowego.

WBC - liczba krwinek białych # lub %

GRA - liczba bezwzględna lub odsetek granulocytów obojętnochłonnych

EOS - liczba bezwzględna lub odsetek granulocytów kwasochłonnych

BASO - liczba bezwzględna lub odsetek granulocytów zasadochłonnych

MONO- liczba bezwzględna lub odsetek monocytów

LYM - liczba bezwzględna lub odsetek limfocytów

ATY - liczba bezwzględna lub odsetek atypowych limfocytów

LIC - liczba bezwzględna lub odsetek dużych niedojrzałych komórek (Large Immature Cells)

3- diff, 5-diff - metody różnicujące krwinki białe na 3 lub 5 populacji

WBC Volume Histogram - histogram objętości krwinek białych

WBC Cytogram/Scattegram - cytogram lub skategram leukocytów

Parametry układu płytkotwórczego.

PLT - liczba krwinek płytkowych w jednostce objętości

PCT - płytkokryt (stosunek objętości masy płytkowej do całkowitej objętości krwi)

MPV - średnia objętość płytek krwi wyliczona na podstawie rozkładu objętości

PDW -wskaźnik zróżnicowania objętości płytek krwi

PLT Volume Histogram - histogram objętości trombocytów

P-LCR - odsetek dużych płytek o objętości powyżej 15 fl

LP - bezwzględna liczba lub odsetek dużych płytek o objętości powyżej 20 fl

NORMOCYT - 6 - 9 μm; w prawidłowej krwi stanowią ponad 90 %;
MCV= 87 μm3

MIKROCYT - ↓ 6 μm; w prawidłowej krwi stanowią < 10 %;

* niedobór Fe

* niedokrwistości chorób przewlekłych

* talasemie i hemoglobinopatie

* czasem MDS

MAKROCYT - 9 - 12 μm; w prawidłowej krwi stanowią < 10 %; fizjologicznie występują u noworodków

* niedobór B12 i kwasu foliowego
* po leczeniu cytostatykami

* choroby wątroby
* czasem MDS

* niekiedy niedokrwistość aplastyczna

MEGALOCYT- ↑ 12 μm;
* niedobór B12 i kwasu foliowego
* po leczeniu cytostatykami

ANIZOCYTOZA - jednoczesne występowanie we krwi obwodowej normo-, makro- i mikrocytów. Niewielki stopień anizocytozy (do 10 %) można spotkać w prawidłowej krwi obwodowej.

RDW [%]

Wskaźniki czerwonokrwinkowe - ich wartość informacyjna w ocenie zaburzeń układu krwiotwórczego i w zaburzeniach wodno-elektrolitowych.

HGB

MCHC MCH

[31 - 36 g/dl] [27 - 32 pg]

HCT RBC

MCV [ 80 - 98 fl, mm3]

Niedokrwistość z powodu niedoboru Fe - IDA

• deficyt żelaza w diecie;

• utrata żelaza (krwawienia; głównie z przewodu pokarmowego i dróg rodnych);

• nieprawidłowe wchłanianie Fe z przewodu pokarmowego (choroby żołądka i jelit - nowotwory, zapalenia zanikowe błony śluzowej); zawarte w pokarmach fosforany, fityniany, szczawiany, mleko, środki alkalizujące;

• zwiększone zapotrzebowanie (dorastanie, ciąża, laktacja);

Zmiany w badaniach laboratoryjnych:

1. Morfologia krwi obwodowej: HGB, HCT, MCV, MCH, MCHC, RBC, PLT

2. Preparat barwiony MGG: hipochromia, mikrocytoza, anulocyty, owalocyty, erytroblasty

3. Retykulocytoza ↓

4. Badanie szpiku wraz z barwieniem na obecność syderoblastów

5. Badania biochemiczne: [Fe], TIBC, UIBC, [ferrytyna], [transferyna], sTfR

NIEDOKRWISTOŚĆ CHORÓB PRZEWLEKŁYCH

anaemia of chronic disorders/diseases

• ACD należy do niedokrwistości wtórnych najczęściej spotykanych u ludzi dorosłych

• proces patologiczny toczy się poza układem krwiotwórczym

• nasilenie niedokrwistości koreluje z zaawansowaniem choroby podstawowej

• towarzyszy

• przewlekłym zakażeniom

• stanom zapalnym

• urazom z rozległym uszkodzeniem tkanek

• NOWOTWOROM

Cytokiny prozapalne (IL-1, TNF-α, INF-α i -γ):

• hamują proliferację i różnicowanie komórek progenitorowych BFU-e i CFU-e, hamują działanie EPO oraz hamują uwalnianie Fe z makrofagów

• wzmagają syntezę ferrytyny i innych bof

W różnicowaniu ACD należy uwzględnić niedokrwistość na tle:

• uszkodzenia nerek

• przewlekłych krwawień

• niedoborów pokarmowych

• zaburzenia wchłaniania

• polekowego uszkodzenia szpiku

• przerzutów nowotworowych do szpiku

• niedokrwistość autoimmunologiczną z przełomem hemolitycznym

	Niedobór Fe IDA	Choroby przewlekłe ACD
HGB	↓	↓ (9- 11g/dl)
HCT	↓	↓
MCV	↓ 80 fl	N lub ↓lub ↑
MCH	↓	N lub ↓
MCHC	↓	N
Ret	↓lub ↑
RBC	↓lub N	N lub ↓
PLT	↑	różnie
WBC		↑ z neutrofilią i przesunięciem w lewo
[Fe]	↓ (N: 10.7-32.2 μmol/l)	N lub↑ nieprawidłowa dystrybucja Fe
TIBC/ UIBC	↑ (N: 54-72 µmol/l)	N lub ↓
[ferrytyna]	↓ 15 µg/l (N: 15-300 µg/l)	↑ (bof często > 1000 µg/l)
transferyna	↑280 mg/dl	↓ nadmiar Fe, bof
Wysycenie transferyny	< 10% (N: 20-45%)	↓ /N/ ↑ nawet >80%
sTfR	↑ ↑	↑?

Dobrym wskaźnikiem różnicującym ACD od niedoboru żelaza jest

sTfR/ferrytyna

Lub

sTfR/log ferrytyny*

*> 2.55 wskazuje na niedobór Fe

< 2.55 niedokrwistość chorób przewlekłych

NIEDOKRWISTOŚĆ MAKROCTARNA I MEGALOBLASTYCZNA

• upośledzenie syntezy DNA spowodowane niedoborem;

• witaminy B12

• kwasu foliowego

• witaminy B12 i kwasu foliowego

• podłoże immunologiczne:

• przeciwciała przeciwko czynnikowi wewnętrznemu (IF)

• Blokujące (typ I), nie dopuszczające do wytworzenia kompleksu IF z vit. B12

• Wiążące (typ II) wolny czynnik IF lub kompleks IF z vit. B12

MORFOLOGIA KRWI OBWODOWEJ

↓ HGB, HCT, RBC

↑ MCV, MCH N: MCHC

↑ RDW

↓ WBC, PLT

Wskaźniki czerwonokrwinkowe - ich wartość informacyjna w ocenie zaburzeń układu krwiotwórczego.

Typ niedokrwistości	HGB	RBC	MCV	MCH	MCHC	HCT
z niedoboru Fe	¯	N,¯	¯	¯	¯	¯
z niedoboru vit. B12 i /lub kwasu foliowego	¯	¯	­	­	N	¯, ­
aplastyczna	¯	¯	N	N	N	¯
hemolityczna	¯	¯	N, ¯, ­	N	N ­sfero.	¯

Wskaźniki czerwonokrwinkowe - ich wartość informacyjna w ocenie zaburzeń wodno-elektrolitowych.

Typ zaburzenia		Na+	HGB	RBC	MCV	MCH	MCHC	HCT
O	izoton	N	­	­	N	N	N	­
		hipoton (zespół niedoboru sodu)	¯	­	­				­ ­
		hiperton (niedobór wolnej wody)	­	­	­				­N
	P	izoton	N	¯	¯	N	N	N¯	¯
		Hipoton (zatrucie wodne)	¯	¯	¯	­	­	­	¯N
		Hiperton (pierwotny nadmiar Na)	­	¯	¯	¯	¯	¯	¯ ¯

Poikilocytoza - różnokształtność wśród krwinek czewonych.

Ocena aktywności erytropoetycznej.

W celu:

- oceny prawidłowości erytropoezy

- klasyfikacji niedokrwistości,

- monitorowania leczenia, np.:

żelazem, EPO,

vit. B12

kwasem foliowym,

odnowy pokrwotocznej i pohemolitycznej,

cytoredukcyjnego,

lub po przeszczepie szpiku

Oceniamy liczbę retykulocytów.

Są to proerytrocyty (dojrzewające erytrocyty) i stanowią grupę komórek poprzedzających krwinki czerwone w szeregu rozwojowym erytropoezy. Cechą wyróżniającą je w masie erytrocytów jest obecność zasadochłonnej substancji, siateczki polirybosomalnej syntetyzującej kwas rybonukleinowy RNA (substantia reticulofilamentosa).

Stadium dojrzałości retykulocyta

Retykulocyty - klasyfikacja wg Heilmeyera oraz orientacyjna zawartość we krwi zależna od stadium dojrzewania

Porównanie metod wykorzystywanych do ilościowej oceny retykulocytów

‰, %R	3000 ery - 36 Ret 1000 ery - x x = 12 ‰ (1,2 %)
RETC	RBC = 5 x 106 / μl 12 ret - 1000 ery x - 5 000 000 ery x = 60 000 ret / μl
SBRL	Oblicza się w przypadkach niedokrwistości. Wartość ta w przybliżeniu odpowiada liczbie retykulocytów uwolnionych ze szpiku kostnego do krwi obwodowej w ciągu doby w oparciu o WK= współczynnik korekcyjny, zależny od HCT osoby badanej. WK jest równy czasowi dojrzewania retykulocytów (CDR). WK w warunkach fizjologii = 1-1,5, czyli wynosi 24 - 36 h. WK przy HCT=35% wynosi 1,5 RETC 60 000 SBLR= = = 40 000 WK 1,5

PSWLR	Podwójnie skorygowana względna liczba retykulocytów - przedstawia przybliżoną dobowo liczbę retykulocytów uwolnioną przez szpik do krwi obwodowej.
WWR	Wskaźnik wytwarzania retykulocytów - przedstawia procent retykulocytów uwalnianych ze szpiku do krwi obwodowej w ciągu doby.

Typ niedokrwistości	RET
z niedoboru Fe	↓, N
z niedoboru vit. B12 i /lub kwasu foliowego	↓
aplastyczna	↓
hemolityczna	↑

KRWINKI BIAŁE

Zakresy referencyjne wskaźników krwinek białych w populacji ogólnej.

Wiek	WBC (x109/L)	NEU (x109/L)	LYM (x109/L)	MONO (x109/L)	EOS (x109/L)	BASO (x109/L)
noworodki	9-30	2,6-20	1,5-11,8	0,-1,0	0,0-1,4	0,0-0,3
7 dni	8-24	2,1-10,0	1,2-12,4	0,2-1,8	0,2-1,9	0,0-0,3
1 - 5 lat	6-17,5	1,5-7,0	2,5-8,5	0,2-1,3	0,1-1,2	0,0-0,2
5 - 10 lat	5-14,5	1,8-7,7	1,7-5,5	0,2-1,3	0,1-1,0	0,0-0,2
10 - 18 lat	4,5-13,5	1,5-6,0	1,5-4,0	0,2-1,3	0,1-0,8	0,0-0,2
> 18 lat	4-10	2,5-6,5	1,0-3,5	0,2-1,0	0,1-0,5	0,0-0,1

Zmiany w liczebności leukocytów.

Leukocytoza- zwiększenie ogólnej liczby krwinek białych powyżej 10x 10 9 /L (10 000 / μl) na skutek generacji poszczególnych populacji składających się na leukocyty:

Choroby odczynowe

- infekcje

- stres

- procesy zapalne

- po krwotokach

- ch. zakaźne

- ch. posurowicza

- urazy

Choroby rozrostowe

- białaczki ostre i przewlekłe

- Zespoły mieloproliferacyjne

- ch. Hodgkina

- mięsaki

- MDS (czasami)

- zawały

- ch. nowotworowe

- cukrzyca

Neutrofile, eozynofile, limfocyty, monocyty

Zmiany w liczebności leukocytów.

Leukopenia -zmniejszenie ogólnej liczby leukocytów poniżej 4 000/ μl. Może jej towarzyszyć neutropenia - obniżenie liczby granulocytów obojętnochłonnych lub agranulocytoza - brak granulocytów we krwi obwodowej.

Polekowe - hormonalne

- psychotropowe

- tarczycowe

- p/cukrzycowe

- a/biotyki

Napromieniowania i chemioterapie

Infekcje wirusowe (koklusz, różyczka, odra, ospa wietrzna, AIDS)

Aplazje szpiku na różnym tle

Niedokrwistości niedoborowe ( bardzo wyraźna leukopenia w A-B, słabiej zaznaczona w innych)

Białaczki aleukemiczne (z silnie obniżoną liczbą granulocytów, np. do 500)

MDS-y

Przesunięcie w lewo.

To pojawienie się we krwi obwodowej młodszych postaci neutrocytów tj.: granulocyty z jądrem pałeczkowatym (BAND > 0,5 x 109 / L), metamielocyty, mielocyty, promielocyty lub mieloblasty. Przesunięcie w lewo dzielimy na:

* Fizjologiczne: noworodki i niemowlęta, ciąża, wysiłek fizyczny, stres.

* Odczynowe: zakażenia bakteryjne, urazy, po operacyjne, nowotwory złośliwe, stany śpiączkowe, kwasica metaboliczna, zatrucia.

* Patologiczne = rozrostowe: przewlekłe zespoły mieloproliferacyjne (czerwienica prawdziwa, mielofibroza w hipercelularnej fazie, przewlekła białaczka szpikowa), ostre białaczki.

Przerwa białaczkowa.

Stan taki obserwujemy najczęściej w przypadku ostrej białaczki szpikowej i ostrej białaczki limfoblastycznej.

Jest to obecność we krwi obwodowej licznych komórek blastycznych (kilka lub kilkanaście) oraz postaci dojrzałych szeregu rozwojowego komórek bez postaci rozwojowych pośrednich.

Przerwa białaczkowa wyraźniej jest widoczna w badaniu szpiku.

Flagowanie: BLAST

Eozynofilia - zwiększenie bezwzględnej liczby eozynofilii u dorosłych powyżej 500-600/ μl

• Chorób alergicznych

• Chorób pasożytniczych

• Chorób skóry (świerzb, łuszczyca, pęcherzyca)

• Kolagenoz

• Przewlekłej białaczki szpikowej (z przesunięciem w lewo)

• Przewlekły zespół mieloproliferacyjny eozynofilowy (hipereozynofilia)

• Choroby nowotworowe

• gruźlica

Jutrzenka stanów zdrowienia !!!!!

Bazofilia - zwiększenie bezwzględnej liczby granulocytów zasadochłonnych u dorosłych powyżej 200/ μl

• przewlekła białaczka szpikowa zwłaszcza w okresie zaostrzenia

• mielofibroza

• czerwienica prawdziwa

• choroby alergiczne (czasem, najczęściej uczulenia polekowe)

• po leczeniu estrogenami

• świerzb

Limfocytoza - zwiększenie bezwzględnej liczby limfocytów u dorosłych powyżej 4x 10 9 /L (4000/ μl).

• Fizjologicznie obserwowana u niemowląt i dzieci.

• Choroby wirusowe ( WZW, ospa, odra, różyczka, mononukleoza, cytomegalia)

• Choroby zakaźne (bruceloza, krztusiec, gruźlica)

• Zespoły limfoproliferacyjne (↑15000/ μl)

Limfocytopenia - zmniejszenie bezwzględnej liczby limfocytów u dorosłych poniżej 1x 10 9 /L (1000/μl).

• Fizjologicznie obserwowana w ciąży i po wysiłku

• Po zabiegach operacyjnych

• Przewlekłej i ostrej białaczce szpikowej

• Toczeń rumieniowaty trzewny

• Po leczeniu immunosupresyjnym

• Po glikokortykoidach

Virocyty = komórki limfo-monocytoidalne = mononukleary to limfocyty atypowe, odczynowe, większe od fizjologicznego limfocyta o silnie zasadochłonnej cytoplazmie. Występują w przypadku:

* chorób wirusowych (mononukleozy, cytomegalii, OZWW i innych chorób szczególnie wysypkowych)

Flagowanie: VAR LYM, ALY, ATYP, LUC

Monocytoza - zwiększenie bezwzględnej liczby monocytów u dorosłych powyżej 1x 10 9 /L (1000/ μl).

• Choroby wirusowe ( mononukleoza, cytomegalia, WZW, ospa)

• Choroby infekcyjne (świnka, bruceloza, gruźlica) oraz jako wyraz uprzątania procesu chorobowego

• RZS

• Toczeń rumieniowaty układowy

• Choroby nowotworowe

• OBS M4 i M5

• zespól mielodysplastyczny CMML

• nowotwory złośliwe

Są bardzo czułym wskaźnikiem regeneracji szpiku. Ich liczebny wzrost po białaczce aplastycznej świadczy o „zdrowieniu”.

Monocytopenia - zmniejszenie bezwzględnej liczby monocytów u dorosłych poniżej 0,2x 10 9 /L (200/ μl).

• Ostre białaczki

• Aplazja szpiku

• Leczenie mielosupresyjne, immunosupresyjne lub glikokortykoidami

• Ostre infekcje

• Błędnie wykonany i oceniony rozmaz

Diagnostyka zaburzeń układu płytkowego.
Zakres wartości prawidłowych : 150 - 450 x 109/L (150 000 - 450 000/ μl)

Małopłytkowości:

• Pierwotne:(wrodzone- rzadko występujące) PLT < 100 x 109/L, często PLT < 50 x 109/L

• wtórne:

• - niedostateczne wytwarzanie płytek krwi: aplazja szpiku, nowotworowe przerzuty do szpiku, białaczki, toksyczne działanie związków chemicznych i farmaceutyków

• - zwiększone niszczenie lub zużycie płytek krwi: zakażenia, kolagenozy, choroby nowotworowe, limfoproliferacyjne, DIC, polekowe, sztuczne zastawki, krążenie pozaustrojowe, powikłania zatorowo-zakrzepowe

• - hiersplenizm - nieprawidłowa dystrybucja i/lub niszczenie płytek krwi

Nadpłytkowości:

• Pierwotne: (samoistne trombocytozy) PLT > 600 x 109/L, niekiedy PLT > 1000 x 109/L: nadpłytkowość samoistna, zespół mieloproliferacyjny ze złośliwym rozrostem megakariocytów

• Wtórne (odczynowe, nabyte):

- choroby nowotworowe

- RZS

- niektóre infekcje

- krwawienia i stany pooperacyjne

- niedokrwistości z niedoboru żelaza, hemolityczne wrodzone, chorób przewlekłych

- okres okołomenopauzalny

- przewlekłe choroby mieloproliferacyjne: czerwienica prawdziwa, PBS, mielofibroza

www.wojsk-lek.org

1

---