Mocz prawidłowy i patologiczny

Każdy student zobowiązany jest do przyniesienia na zajęcia około 200 cm³ moczu, który posłuży do wykonywania doświadczeń.

ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA

1. Powstawanie moczu i prawidłowe składniki moczu.

2. Wykrywanie prawidłowych i patologicznych składników moczu

3. Tematy na samokształcenie do zaliczenia podczas ćwiczenia :

1.) Synteza i katabolizm hemu (ogólnie). Porfirie. Powstawanie bilirubiny. Bilirubina wolna (przedwątrobowa) i sprzężona (wątrobowa). Produkty przemiany bilirubiny w przewodzie pokarmowym. Żółtaczki.

2.) Synteza nukleotydów purynowych i pirymidynowych de novo i przez reutylizację zasad azotowych. Różnice w budowie DNA i RNA.

3.) Rozpad nukleotydów purynowych i pirymidynowych w organizmie człowieka. Zaburzenia metaboliczne związane z metabolizmem nukleotydów: dna moczanowa, zespół Lecha-Nyhana, ksantynuria, acyduria orotanowa. Skutki niedoborów: deaminazy adenozynowej, fosforylazy nukleozydów purynowych, fosforybozylotransferazy adeninowej oraz 5'- nukleotydazy.

Zalecane podręczniki:

Podstawowy: Biochemia. Podręcznik dla studentów studiów licencjackich i magisterskich.

Edward Bańkowski, MedPharm, od 2005 r.

Uzupełniający: Biochemia Harpera, PZWL, od 2004 r.

WPROWADZENIE

Nerka bierze udział w utrzymywaniu stałej objętości i stałego składu płynów ustrojowych (utrzymywanie homeostazy organizmu). Funkcja ta spełniana jest poprzez wytwarzanie moczu. W ten sposób z organizmu usuwany jest nadmiar wody i związki pochodzące z zewnątrz (np. leki i produkty ich degradacji, substancje toksyczne), które zostały wytworzone w organizmie podczas procesów metabolicznych, jak np. kreatynina, mocznik, kwas moczowy.

Mocz tworzy się w nerce, w nefronach. Nefron jest jednostką czynnościową nerki. U człowieka jest ich około 1 mln. W jego skład wchodzi: 1. kłębek nerkowy (zawierający torebkę Bowmana), 2. kanalik bliższy (proksymalny), 3. pętla Henlego zawierająca ramię zstępujące i ramię wstępujące, 4. kanalik dalszy (dystalny), 5. kanalik zbiorczy. W wyniku ultrafiltracji osocza powstaje mocz pierwotny, który podlega resorpcji zwrotnej i wydzielaniu kanalikowemu (sekrecji kanalikowej) i tworzy się mocz ostateczny.

Szybkość ultrafiltracji zależy od ciśnienia krwi (wzrost ciśnienia krwi powoduje wzrost ultrafiltracji), od ciśnienia koloido-osmotycznego związanego z obecnością w osoczu białek, głównie albumin (zmniejszenie tego ciśnienia prowadzi do wzrostu ultrafiltracji) i od ciśnienia panującego w torebce Bowmana (spadek ciśnienia wewnątrz torebki prowadzi do wzrostu ultrafiltracji). Skuteczne ciśnienie filtracyjne (EFP - ang. effective filtration pressure) = ciśnienie krwi w naczyniach włosowatych kłębuszka (55 mm Hg = 7,3 kPa) - ciśnienie koloido-osmotyczne w naczyniach włosowatych kłębuszka (25 mm Hg = 3,3 kPa) - ciśnienie w torebce Bowmana (15 mm Hg = 2 kPa). Szybkość ultrafiltracji w warunkach prawidłowych wynosi 125 cm³ osocza na minutę. Powstaje w ten sposób mocz pierwotny, który od osocza różni się tylko brakiem białek, które z uwagi na dużą masę cząsteczkową nie mogą przechodzić przez błonę komórkową komórek torebki kłębuszka. Przechodzą przez nią związki, których masa cząsteczkowa nie przekracza 60 000. Podczas przepływu moczu pierwotnego przez kanaliki nerkowe zachodzi wchłanianie zwrotne (resorpcja) wody i rozpuszczonych w niej związków organicznych i jonów. W efekcie tych procesów powstaje mocz ostateczny, w ilości 1,5 dm³ na dobę (1 cm³ na minutę).

W kanalikach proksymalnych zachodzi obligatoryjne (obowiązkowe) zwrotne wchłanianie wody, niepodlegające regulacji hormonalnej, związane z aktywnym wchłanianiem jonów Na⁺. W ten sposób wchłania się 85% wody. Wraz z wodą resorbowane są z moczu pierwotnego do osocza substancje w niej rozpuszczone. Niektóre z nich są wchłaniane aktywnie i potrzebna do tego procesu energia pochodzi z rozpadu ATP. Substancje te są wchłaniane w kanaliku proksymalnym całkowicie lub prawie całkowicie i w moczu w warunkach prawidłowych nie występują lub ich ilość jest bardzo mała. Związki te noszą nazwę wysokoprogowych i należą do nich: glukoza, aminokwasy, kreatyna, Na⁺, HCO₃^-. Pojawiają się one w moczu dopiero wtedy, gdy ich stężenie w osoczu przekroczy próg nerkowy, tzn. będzie wyższe od zdolności kanalików nerkowych do ich wchłonięcia aktywnego. Inną grupą są związki niskoprogowe, które są wchłaniane biernie, bez nakładu energii, w małych ilościach i są one zawsze wydalane z moczem. Należą do nich np. mocznik i kwas moczowy. Natomiast związki nazywane bezprogowymi nie ulegają resorpcji, przykładem takiego związku jest kreatynina.

W pętli Henlego odbywa się dalsze zagęszczanie moczu. Na skutek wchłaniania wody w ramieniu zstępującym rośnie osmolarność moczu pierwotnego (do 1200 mosmoli), a w ramieniu wstępującym, które jest nieprzepuszczalne dla wody osmolarność maleje, gdyż zachodzi resorpcja jonów Na⁺ i Cl^-. Tak, więc mocz opuszczający pętlę jest izotoniczny w stosunku do osocza (osmolarność = 300 mosmoli), pomimo tego, że wiele substancji ulega w nim zagęszczeniu.

W kanalikach dystalnych i zbiorczych resorpcja zwrotna wody i jonów Na⁺ podlega regulacji hormonalnej przez wazopresynę i aldosteron. Wazopresyna jest hormonem peptydowym, wydzielanym przez tylny płat przysadki wtedy, gdy wzrasta osmolarność płynów ustrojowych. Nazywana jest hormonem antydiuretycznym (ADH), gdyż po jej wydzieleniu następuje wchłanianie zwrotne wody - fakultatywne, z wtórnym wchłanianiem jonów Na⁺. Drugim hormonem jest aldosteron, hormon steroidowy, należący do mineralokortykoidów, syntetyzowany w korze nadnerczy, którego wydzielenie powoduje wchłanianie zwrotne Na⁺, co pociąga za sobą wtórne wchłanianie wody. Oba te hormony biorą udział w regulowaniu gospodarki wodno-elektrolitowej.

Powstający w kanaliku zbiorczym mocz ostateczny jest hipertoniczny w stosunku do osocza. Jego osmolarność jest cztery razy wyższa niż osocza i nie może przekroczyć 1200 mosmoli. Tak więc wydalany mocz w porównaniu do osocza jest czterokrotnie zagęszczony, natomiast poszczególne związki wydalane w moczu są zagęszczane znacznie bardziej, np. kwas moczowy około 15 razy, mocznik około 80 razy, kreatynina 100 razy, jony NH₄⁺ 400 razy.

Jeżeli w moczu wydalane są związki, które w warunkach prawidłowych są resorbowane całkowicie (np. glukoza), to wiąże się to ze zwiększeniem ilości wytwarzanego moczu. To zjawisko nosi nazwę diurezy osmotycznej.

Mocz wydalany w ciągu doby zawiera substancje nieorganiczne, których ilość waha się od 20 do 30 g i są to jony: sodowy, potasowy, chlorkowy, siarczanowy, fosforanowe. Wydalane są również z moczem substancje organiczne, w ilości 30-40 g na dobę. Głównie są to produkty przemiany azotowej i należą do nich: mocznik, kwas moczowy, kreatynina. amoniak (NH₄⁺).

CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA

1. Oznaczanie pH moczu

Odczyn moczu jest najczęściej lekko kwaśny. Jego pH może się wahać w granicach 5,5 - 6,5 i zależy od stosowanej diety. Mocz może mieć odczyn zasadowy szczególnie przy diecie bogatej w jarzyny, owoce i produkty mleczne. Odczyn bardziej kwaśny ma mocz osób stosujących dietę wysokobiałkową.

Materiał i odczynniki

1. Paski wskaźnikowe pH

2. Mocz

Wykonanie doświadczenia

Na pasek wskaźnikowy nanieść kilka kropli moczu i porównać uzyskane zabarwienie ze skalą barw.

Składniki moczu prawidłowego

2. Wykrywanie jonów Cl^-

Jon Cl^- jest głównym anionem osocza. Wydalany jest w ilości od 6 do 10 g na dobę. Ilość wydalanych chlorków jest ściśle związana z wydalaniem wody. Im więcej wody organizm usuwa, tym więcej wydala chlorków.

Zasada metody

Jony Cl^- tworzą z jonami Ag⁺ biały, serowaty osad AgCl, nierozpuszczalny w HNO₃.

Cl^- + Ag⁺ Ⴎ AgClႯ

Materiał i odczynniki

1. Stężony HNO₃

2. 5% roztwór AgNO₃

3. Mocz

Wykonanie doświadczenia

Do 2 cm³ moczu dodać 0,5 cm³ stężonego kwasu azotowego, a następnie kilka kropli roztworu azotanu srebra.

3. Wykrywanie jonów SO₄^2-

W ciągu doby wydalanych zostaje od 2 do 3 g jonów siarczanowych. Powstają one głównie podczas przemiany (utleniania) cysteiny, aminokwasu zawierającego grupę -SH i w całości są wydalane z moczem, nie ulegają resorpcji zwrotnej w kanalikach nerkowych.

Zasada metody

Jony SO₄^2- tworzą z jonami Ba²⁺ biały, drobnokrystaliczny osad BaSO₄.

SO₄^2- + Ba²⁺ Ⴎ BaSO₄Ⴏ

Materiał i odczynniki

1. 10% roztwór BaCl₂

2. Mocz

Wykonanie doświadczenia

Do kilku cm³ moczu dodać 1-2 cm³ roztworu chlorku barowego.

4. Wykrywanie mocznika (reakcja z podbrominem)

Mocznik powstaje w organizmie w tzw. cyklu mocznikowym. Związek ten pochodzi głównie z przemiany azotowej białek.

Podczas deaminacji aminokwasów tworzy się bardzo toksyczny amoniak. Powstaje on również w mniejszej ilości, w przemianach innych związków, np. nukleotydów purynowych i pirymidynowych oraz amin. Proces syntezy mocznika pełni ważną biologiczną rolę w przekształcaniu amoniaku w łatwo rozpuszczalny, nietoksyczny w stężeniach fizjologicznych związek, który następnie jest wydalany z moczem.

Zdrowy, dorosły człowiek, na prawidłowej diecie jest w stanie tzw. równowagi azotowej. Dobowa ilość azotu wydalana z organizmu jest równa ilości azotu przyjmowanego z pożywieniem. Przy spożyciu białka w ilości około 100 gramów na dobę wydalane jest 16 gramów azotu. 80 - 90% całkowitej puli wydalanego azotu stanowi mocznik. Ilość wytworzonego w organizmie dorosłego człowieka mocznika zależy głównie od zawartości białka w pożywieniu i przeciętnie wynosi od 20 do 40 g na dobę. Stężenie tego związku we krwi w warunkach prawidłowych waha się w szerokich granicach, od 20 do 40 mg/100 cm³, a nawet może osiągać 50 mg/100 cm³. Z moczu pierwotnego mocznik resorbowany jest biernie.

Synteza mocznika zachodzi wyłącznie w wątrobie. Amoniak łączy się z CO₂ tworząc karbamoilofosforan, reakcja ta wymaga udziału dwóch cząsteczek ATP, jako źródła energii. Karbamoilofosforan następnie reaguje z ornityną, tworząc cytrulinę. Cytrulina przy udziale energii pochodzącej z hydrolizy ATP kondensuje z asparaginianem, który jest dawcą drugiego atomu azotu. Powstały argininobursztynian ulega rozszczepieniu na argininę i fumaran. Arginina hydrolizuje dając mocznik i ornitynę, zamykając w ten sposób jeden obrót cyklu. Dwie pierwsze reakcje zachodzą w mitochondriach komórek wątroby, pozostałe trzy przebiegają w cytoplazmie.

Zasada metody

Pod wpływem podbrominu sodowego następuje utlenienie i rozkład mocznika z wytworzeniam CO₂, H₂O i azotu (Rys. 1).

Materiał i odczynniki

1. Roztwór podbrominu sodu (10% Br₂ w 40% roztworze NaOH)

2. Mocz

Wykonanie doświadczenia

1. Do 1 cm³ moczu dodać kilka kropel roztworu podbrominu sodowego.

2. Zawartość probówki wymieszać.

3. Pojawienie się pęcherzyków gazu świadczy o obecności mocznika.

4. Gazem tym będzie tylko azot, bo CO₂ w środowisku zasadowym przekształci się w węglany i wodorowęglany.

Równolegle wykonać próbę z indywidualnym zadaniem na zaliczenie.

5. Wykrywanie kwasu moczowego

Kwas moczowy jest końcowym produktem katabolizmu zasad purynowych w organizmie człowieka. Nukleotydy w komórkach ulegają stałym przemianom. Związki te są rozkładane za pomocą enzymów, a także ulegają samorzutnemu rozpadowi na skutek wpływu środowiska.

Nukleotydazy rozkładają hydrolitycznie nukleotydy do nukleozydów. Z nukleozydów fosforylazy nukleozydowe uwalniają wolne zasady i rybozo-1-fosforan. Większość uwolnionych zasad purynowych zostaje ponownie użyta do tworzenia nukleotydów na drodze rezerwowych szlaków metabolicznych.

Niewielka część uwolnionych zasad ulega przekształceniu do kwasu moczowego i jest wydalana z moczem.

Główne szlaki metaboliczne przemiany AMP i GMP prowadzące do utworzenia kwasu moczowego nieco się różnią. Katabolizm AMP rozpoczyna deaminaza AMP:

AMP + H₂O → IMP + NH₃

IMP i GMP są substratami dla 5' nukleotydazy, która przekształca je w nukleozydy.

IMP + H₂O → inozyna + P_i

GMP + H₂O → guanozyna P_i

Następnie nukleozydy są rozkładane za pomocą fosforylazy nukleozydów purynowych.

inozyna + P_i → hipoksantyna + rybozo-1-fosforan

guanozyna + P_i → guanina + rybozo-1-fosforan

Guanina pod wpływem hydrolazy - guanazy (deaminazy guaninowej) przekształcana jest do ksantyny.

guanina + H₂O → ksantyna + NH₃

Hipoksantyna i ksantyna są przekształcane w kwas moczowy przy udziale oksydazy ksantynowej.

hipoksantyna → ksantyna→ kwas moczowy

Mechanizm tej reakcji jest złożony, enzym do swojego działania wymaga udziału O₂, FAD, jonów molibdenu i żelaza. Jeden atom tlenu cząsteczkowego, utleniacza w obu reakcjach, zostaje dołączony do pierścienia puryny, drugi zaś zostaje zredukowany do H₂O_2. Nadtlenek wodoru następnie jest rozkładany przez katalazę do H₂O i O_2.

Przyłączenie tlenu do pierścienia puryny powoduje zwiększenie polarności, a zatem zwiększa rozpuszczalność związku w wodzie. Jednak kwas moczowy jest nadal związkiem trudno rozpuszczalnym. Lepiej rozpuszczalne są jego sole - moczany, które tworzą się w pH obojętnym i zasadowym. Kryształy moczanów wytrącają się w roztworach przekraczających stężenie 7 miligramów tego związku na 100 cm³ wody. Dlatego też znaczna część moczanów w osoczu zaadsorbowana jest na albuminach, co przeciwdziała ich wytrącaniu.

Prawidłowe stężenie kwasu moczowego (głównie w postaci moczanów) we krwi dorosłych kobiet wynosi od 2 do 6 mg/100 cm³, u mężczyzn od 3 do 7,5 mg/100 cm³. Stężenie kwasu moczowego w osoczu zależy także od diety, niższe stężenia tego związku występują u ludzi stosujących dietę wegetariańską.

W ciągu doby organizm zdrowego, dorosłego człowieka wytwarza przeciętnie od 400 do 800 miligramów kwasu moczowego, który następnie jest wydalany z moczem. Jest on częściowo wchłaniany aktywnie w kanalikach proksymalnych. Na dobę wydalany jest w ilości 500-800 mg w postaci wolnej lub jako moczany sodu lub potasu.

Nadmierne jego wytwarzanie powoduje podwyższenie jego stężenia we krwi (hiperurykemia) i jest przyczyną zmian chorobowych wywołanych przez wytrącanie się kryształów moczanu sodu, szczególnie w stawach i nerkach. Choroba ta jest znana jako dna moczanowa. Większość ssaków przekształca dalej kwas moczowy do łatwo rozpuszczalnej substancji - alantoiny. Brak możliwości przekształcania kwasu moczowego do alantoiny jest jednak korzystnym czynnikiem selekcyjnym. Moczany bardzo łatwo się utleniają i są bardzo wydajną substancją usuwającą wysoce reaktywne, szkodliwe formy tlenu, np.: rodniki hydroksylowe, aniony ponadtlenkowe. Obecność moczanów w osoczu może wydatnie przyczyniać się do wydłużenia życia ludzkiego i do zmniejszenia zapadalności na choroby nowotworowe. Moczany jak również bilirubina są przykładami reguły, że niektóre produkty końcowe pochodzące ze szlaków metabolicznych odgrywają ważną rolę jako czynniki ochronne.

Zasada metody

Pod wpływem kwasu moczowego kwas fosforowolframowy w środowisku zasadowym (Na₂CO₃) ulega redukcji do tlenków wolframu o niższym stopniu utlenienia, mających niebieskie zabarwienie. Za reakcję dodatnią uważa się również pojawienie się intensywnego, zielonego zabarwienia, powstającego na skutek nakładania się na barwę niebieską, żółtej barwy pochodzącej od innych składników moczu.

Materiał i odczynniki

1. Odczynnik fosforowolframowy (4% Na₂WO₄x 2H₂O w 3% roztworze H₃PO₄)

2. 10% roztwór Na₂CO₃

3. Mocz

Wykonanie doświadczenia

Do 1 cm³ moczu dodać kilka kropli odczynnika fosforowolframowego i 1 cm³ 10% roztworu Na₂CO₃.

Równolegle wykonać próbę z indywidualnym zadaniem na zaliczenie.

6. Wykrywanie urobilinogenu - reakcja Ehrlicha

Urobilinogen powstaje w przewodzie pokarmowym z bilirubiny wątrobowej w wyniku działania enzymów bakterii jelitowych, skąd częściowo zostaje wchłonięty do krwioobiegu i utleniony w wątrobie do bilirubiny, która po sprzęgnięciu wydalana jest ponownie do przewodu pokarmowego. Niewielka ilość urobilinogenu jest wydalana z moczem, jest to fizjologiczna urobilinogenuria. Podczas niewydolności wątroby maleje jej zdolność do utleniania urobilinogenu i zwiększa się wtedy jego ilość wydalana z moczem. Przyczyną wydalania zwiększonej ilości urobilinogenu może być również wzmożony rozpad krwinek czerwonych np. przy żółtaczce hemolitycznej. Natomiast przy zaczopowaniu przewodów żółciowych ilość wydalanego z moczem urobilinogenu znacznie się obniża.

Zasada metody

Urobilinogen z odczynnikiem Ehrlicha, w obecności HCl, tworzy czerwony kompleks.

Materiał i odczynniki

1. Odczynnik Ehrlicha (2% roztwór aldehydu p-N,N-dimetyloaminobenzoesowego w 1mol/dm³ roztworze HCl)

2. Mocz

Wykonanie doświadczenia

Do 4 cm³ moczu dodać 0,5 cm³ odczynnika Ehrlicha. Zawartość probówki ogrzać. Przy zwiększonej ilości urobilinogenu mocz zabarwia się na czerwono już na zimno.

7. Wykrywanie kreatyniny metodą Jaffego

Kreatynina jest produktem degradacji kreatyny. Kreatyna występuje głównie w mięśniach i w postaci fosforanu jest magazynem energii. Cykl mocznikowy jest także punktem wyjścia do syntezy tego ważnego metabolitu. Arginina, metabolit cyklu mocznikowego, ulega w komórkach nerki kondensacji z glicyną. Powstaje guanidynooctan, który jest metylowany przez S-adenozylometioninę

(SAM) do kreatyny. Kreatyna jest następnie fosforylowana za pomocą ATP i przechodzi w fosforan kreatyny, stanowiący zapas łatwo uruchamianej energii w mięśniu. Ostatni etap przemiany odbywa się bez udziału enzymów. W ciągu doby około 1,6% fosfokreatyny przekształca się w bezwodnik - kreatyninę.

Kreatynina jest wydalana z moczem, przeciętnie od 1 do 1,8 gramów na dobę. Kreatynina nie ulega wchłanianiu zwrotnemu w kanalikach nerkowych. Na dobę wydala się jej od 1 g do 1,8 g, w zależności od wielkości masy mięśniowej.

Prawidłowe stężenie kreatyniny w surowicy wynosi u dorosłych kobiet od 0,5 do 1 mg/100 cm³, a u mężczyzn 0,6 - 1,2 mg/100 cm³. Znacznie niższe stężenie kreatyniny występuje u małych dzieci do trzech lat (0,2-0,4 mg/100 cm³). W miarę dorastania stężenie to stopniowo wzrasta, aby osiągnąć w wieku 17 lat wartości charakterystyczne dla ludzi dorosłych.

Podwyższone stężenie kreatyniny we krwi może wystąpić w chorobach nerek, mięśni i zatruciach witaminą D.

Zasada metody

Kreatynina w środowisku zasadowym tworzy z kwasem pikrynowym czerwony kompleks.

Materiał i odczynniki

1. 1,5% roztwór kwasu pikrynowego

2. 2 mol/dm³ roztwór NaOH

3. Mocz

Wykonanie doświadczenia

Do 1 cm³ moczu rozcieńczonego dwa razy wodą destylowaną, dodać 1 cm³ nasyconego roztworu kwasu pikrynowego, a następnie zalkalizować kilkoma kroplami 2 mol/dm³ roztworu NaOH.

Równolegle wykonać próbę z indywidualnym zadaniem na zaliczenie.

8. Wykrywanie kreatyniny metodą Weyla

Materiał i odczynniki

1. 10% roztwór nitroprusydku sodu

2. 2 mol/dm³ roztwór NaOH

3. 30% kwas octowy

4. Mocz.

Wykonanie doświadczenia

Do 2 cm³ moczu dodać 3-4 krople roztworu nitroprusydku sodu oraz 1 cm³ 2 mol/dm³ roztworu NaOH. Pojawia się czerwone zabarwienie, które po pewnym czasie blednie, a znika natychmiast po zakwaszeniu 30% kwasem octowym.

Równolegle wykonać próbę z indywidualnym zadaniem na zaliczenie.

Składniki moczu patologicznego

W stanach patologicznych z moczem wydalane są substancje, które w warunkach prawidłowych praktycznie nie pojawiają się w moczu lub są wydalane w bardzo małych ilościach i taki mocz określamy jako patologiczny. Patologicznymi składnikami moczu są: białko, ciała ketonowe, glukoza, bilirubina, kwasy żółciowe, hemoglobina, zwiększona ilość urobilinogenu. Przyczyny wydalania substancji patologicznych mogą być różne; związane nie tylko z zaburzeniami czynności nerek, ale także ze schorzeniami (zaburzeniami metabolizmu) innych narządów.

9. Wykrywanie ciał ketonowych (acetonu) - reakcja Legala

Ciała ketonowe (Rys. 2) są prawidłowymi produktami metabolizmu, syntetyzowane są w wątrobie z acetyloCoA. Należą do nich acetooctan i ၢ-hydroksymaślan. W warunkach prawidłowych ich stężenie we krwi jest bardzo niewielkie i wynosi od 0,2 do 0,8 mg/100 cm³, gdyż poza wątrobą i erytrocytami są one wykorzystywane jako materiał energetyczny i rozkładane do CO₂ i H₂O. U zdrowego człowieka z moczem wydalane są bardzo małe ilości tych związków i jest ich nie więcej niż 20 mg na dobę. Jest to tak mała ilość, że nie można jej wykryć stosowanymi metodami.

W pewnych warunkach np. w głodzie czy cukrzycy może dochodzić do wzmożonej syntezy tych związków w wątrobie. Ilość wytworzonych wtedy ciał ketonowych przekracza zdolność całkowitego wykorzystywania tych związków przez organizm. Wzrasta stężenie acetooctanu i w wyniku jego spontanicznej dekarboksylacji powstaje aceton. Jest on wydalany z moczem razem z acetooctanem i ၢ-hydroksymaślanem (ketonuria). Jeżeli ilość wytworzonych ciał ketonowych jest tak duża, że nerka nie może ich całkowicie wydalić z moczem, to dochodzi do ketonemii - zwiększenia ich stężenia we krwi, co prowadzi do zaburzenia równowagi kwasowo-zasadowej (kwasicy metabolicznej).

Materiał i odczynniki

1. 30% roztwór NaOH

2. 10% roztwór nitroprusydku sodu

3. 30% CH₃COOH

4. Mocz prawidłowy

5. Mocz patologiczny zawierający aceton

Wykonanie doświadczenia

Reakcję wykonać z moczem prawidłowym i patologicznym.

Równolegle wykonać próbę z indywidualnym zadaniem na zaliczenie.

1. 3 cm³ badanego moczu zalkalizować 5 kroplami 30% roztworu NaOH.

2. Dodać 3-5 kropli roztworu nitroprusydku sodu ( powstaje czerwone zabarwienie).

3. Dodać 10-15 kropli 30% kwasu octowego (zabarwienie nie znika, a nawet pogłębia się).

4. Zaobserwować różnice w reakcji z moczem patologicznym

5. Porównać z ćwiczeniem na wykrywanie kreatyniny.

10. Wykrywanie glukozy (reakcja Benedicta)

Glukoza resorbowana jest w kanaliku proksymalnym aktywnie, przy udziale energii z rozpadu ATP i w warunkach prawidłowych nie jest wydalana z moczem. Jest ona substancją wysokoprogową i dopóki jej stężenie we krwi nie przekroczy 180 mg/100 cm³ nerka jest w stanie zresorbować z moczu pierwotnego całą jej ilość. Glukozuria to wydalanie glukozy z moczem, występuje u ludzi chorych na cukrzycę, u których stężenie glukozy przekroczyło próg nerkowy. Chory może wydalać z moczem nawet kilkadziesiąt gramów glukozy na dobę.

Glukoza może pojawić się w moczu również wtedy, kiedy jej stężenie we krwi jest prawidłowe, ale dochodzi do zaburzenia jej wchłaniania zwrotnego w kanalikach proksymalnych, na skutek dysfunkcji nerek.

Zasada metody

Glukoza redukuje Cu²⁺ do Cu⁺ i powstaje nierozpuszczalny, czerwony osad Cu₂O.

Materiał i odczynniki

1. Odczynnik Benedicta (17,3% cytrynian trisodowy, 9% Na₂CO₃, 1,1% CuSO₄)

2. Mocz prawidłowy

3. Mocz patologiczny zawierający glukozę

Wykonanie doświadczenia

Próbę wykonać z moczem prawidłowym i patologicznym. Równolegle wykonać próbę z indywidualnym zadaniem na zaliczenie.

Do 2 cm³ odczynnika Benedicta (zawiera Cu²⁺) dodać kilka kropli badanego moczu. Wstawić na kilka minut do wrzącej łaźni wodnej.

11. Wykrywanie białka

Mocz zdrowego człowieka nie zawiera białka. Podczas ultrafiltracji osocza przez błonę torebki kłębuszka przechodzą tylko związki drobnocząsteczkowe. Dla białek jest ona nieprzepuszczalna. Niekiedy może przechodzić do moczu pierwotnego i pojawiać się w moczu albumina, której masa cząsteczkowa jest niższa niż globulin. Zjawisko to nosi nazwę białkomoczu fizjologicznego (proteinurii fizjologicznej) i jest związane np. z dużym wysiłkiem fizycznym, gwałtownym oziębieniem ciała.

Białko pojawia się w moczu w stanach patologicznych, np. kiedy zwiększa się przepuszczalność kłębków nerkowych w wyniku ich uszkodzenia. Ilość wydalanego wtedy z moczem białka może dochodzić nawet do kilkudziesięciu gramów na dobę.

Zasada metody

W środowisku kwaśnym pod wpływem kwasu sulfosalicylowego białko ulega denaturacji i wytrąceniu.

Materiał i odczynniki

1. 30% roztwór CH₃COOH

2. 20% roztwór kwasu sulfosalicylowego

3. Mocz prawidłowy

4. Mocz patologiczny zawierający białko

Wykonanie doświadczenia

Doświadczenie wykonać z moczem prawidłowym i patologicznym. Równolegle wykonać próbę z indywidualnym zadaniem na zaliczenie.

1. Do 4 cm³ moczu dodać 1-2 krople 30% roztworu kwasu octowego.

2. W razie wystąpienia zmętnienia roztwór przesączyć.

3. Do klarownego moczu lub przesączu dodać 3-5 kropli 20% roztworu kwasu sulfosalicylowego.

4. Próba jest dodatnia jeżeli roztwór ulega zmętnieniu (może powstać opalescencja) lub wytrąca się osad zdenaturowanego białka.

5. Wynik doświadczenia zależy od ilości białka obecnego w moczu.

12. Wykrywanie śladów krwi

Krew spełnia w organizmie wiele funkcji, umożliwia zachowanie homeostazy, uczestniczy w utrzymaniu równowagi kwasowo-zasadowej (utrzymywanie stałego pH w granicach 7,38-7,42) i w regulacji gospodarki wodno elektrolitowej. Krew transportuje do tkanek wiele różnych substancji oraz umożliwia usunięcie z komórek metabolitów. W składzie krwi można wyróżnić elementy morfotyczne i osocze. Elementami morfotycznymi są erytrocyty, leukocyty i trombocyty (płytki krwi). Głównym składnikiem erytrocytów jest hemoglobina, która odgrywa zasadniczą rolę w transporcie tlenu a także znaczącą w transporcie dwutlenku węgla. Hemoglobina jest hemoproteiną zbudowaną z czterech łańcuchów polipeptydowych, a każdy łańcuch połączony jest z cząsteczką hemu zawierającego dwuwartościowy kation żelaza (Fe²⁺).

W warunkach prawidłowych hemoglobina, która zostaje uwolniona z erytrocytów do osocza jest wiązana z ၡ₂ globuliną osocza - haptoglobiną i wytworzony kompleks nie przenika przez kłębuszki nerkowe. Haptoglobina może związać od 400 mg do 1,8 g hemoglobiny. Jeżeli dochodzi do uwolnienia z krwinek czerwonych większej ilości hemoglobiny (np. przy rozległych poparzeniach, niektórych zatruciach, wstrząsie potransfuzyjnym) to gwałtownie wzrasta stężenie hemoglobiny wolnej w osoczu (hemoglobinemia). Hemoglobina ta ulega filtracji w kłębuszkach nerkowych i resorpcji zwrotnej. Po przekroczeniu we krwi stężenia 70 mg/100 cm³ nadmiar jej nie jest wtórnie wchłaniany w kanalikach nerkowych i dlatego pojawia się w moczu.

Do moczu mogą przedostawać się krwinki czerwone z uszkodzonych odcinków układu moczowego, zaburzenie to nosi nazwę hematurii.

Zasada metody

Metoda oparta jest na właściwościach pseudoperoksydazowych hemoglobiny, która podobnie jak enzym peroksydaza, utlenia benzydynę w obecności nadtlenku wodoru. Katalityczne działanie wykazuje jon Fe²⁺ znajdujący się w niebiałkowej części hemoglobiny - hemie. W peroksydazie o reakcji benzydynowej decyduje centrum aktywne, znajdujące się w apoenzymie. Dlatego po zdenaturowaniu obu białek (peroksydazy i hemoglobiny) tylko w przypadku hemoglobiny próba benzydynowa będzie dodatnia.

Materiał i odczynniki

1. 10% roztwór benzydyny w lodowatym CH₃COOH

2. 3% roztwór H₂O₂

3. Mocz prawidłowy

4. Mocz patologiczny zawierający krew

Wykonanie doświadczenia

Doświadczenie wykonać z moczem: a) prawidłowym, b) patologicznym, c) patologicznym zagotowanym. Równolegle wykonać próbę z indywidualnym zadaniem na zaliczenie.

Do kilku kropli odczynnika benzydynowego, przygotowanego przez zmieszanie równych objętości roztworu benzydyny i roztworu H₂O₂ dodać kilka kropli moczu.

13. Wykrywanie bilirubiny - odczyn Gmelina

Erytrocyty żyją około 120 dni. Rozpad erytrocytów zachodzi w komórkach układu siateczkowo-śródbłonkowego, głównie wątroby, śledziony i szpiku kostnego. Tam też następuje przemiana hemu w bilirubinę. W pierwszym etapie tego procesu bierze udział zlokalizowana w mikrosomach oksygenaza hemowa, związana z mikrosomalnym łańcuchem transportu elektronów. Przy udziale O₂ i NADPH+H⁺ zachodzi rozerwanie pierścienia hemu. Powstaje werdoglobina, która następnie rozpada się na globinę (część białkową), biliwerdynę powstałą z hemu i jon żelaza. Biliwerdyna ma niebieskozielone zabarwienie. Następnie biliwerdyna redukuje się pod wpływem reduktazy biliwerdyny i powstaje pomarańczowożółta bilirubina, która dyfunduje do krwi.

Bilirubina jest związkiem trudno rozpuszczalnym i transportowana jest do wątroby w połączeniu z albuminami. Jedna cząsteczka albuminy łączy się z dwiema cząsteczkami bilirubiny.

W warunkach prawidłowych we krwi występuje tylko bilirubina wolna (przedwątrobowa, pośrednia), która jest połączona z albuminą i ten kompleks nie ulega przesączaniu kłębkowemu. Bilirubina wolna nie pojawia się w moczu nawet wtedy, kiedy jej stężenie w osoczu wzrośnie powyżej 1 g/100 cm³. Bilirubina wolna w wątrobie ulega przekształceniu głównie w diglukuronidy i siarczany. W tej postaci jest ona wydalana do przewodu pokarmowego. Ta bilirubina nosi nazwę związanej (wątrobowej) i w warunkach prawidłowych we krwi nie występuje. Pojawia się ona we krwi przy zaczopowaniu przewodów żółciowych lub uszkodzeniu komórek wątroby. Ulega ona, tak jak inne związki drobnocząsteczkowe, przesączeniu kłębkowemu i resorpcji zwrotnej. W moczu może pojawiać się dopiero wtedy, kiedy jej stężenie w osoczu będzie wyższe niż 1,6 mg/100 cm³.

Zasada metody

Bilirubina utlenia się pod wpływem HNO₃ do biliwerdyny, która ma barwę zieloną.

Materiał i odczynniki

1. Stężony HNO₃

2. Mocz prawidłowy

3. Mocz patologiczny zawierający bilirubinę

Wykonanie doświadczenia

Doświadczenie wykonać z moczem prawidłowym i patologicznym. Równolegle wykonać próbę z indywidualnym zadaniem na zaliczenie.

1. Do probówki nalać 1 cm³ stężonego HNO₃.

2. Następnie po ściankach probówki ostrożnie nawarstwić badany roztwór.

3. W obecności barwników żółciowych po kilku minutach na granicy płynów pojawia się tęcza barw (z dominującą barwą zieloną).

14. Wykrywanie kwasów żółciowych - reakcja Haya

Kwasy żółciowe są składnikiem żółci i w warunkach prawidłowych z żółcią są wydalane do przewodu pokarmowego. Powstają one w wątrobie z cholesterolu. Są naturalnymi detergentami, umożliwiają trawienie tłuszczów w przewodzie pokarmowym przez ich emulgację. Przy zablokowaniu drogi odpływu żółci (np. w żółtaczce mechanicznej) wzrasta ich stężenie we krwi i są one częściowo wydalane z moczem.

Zasada metody

Polega na wykazaniu obniżenia napięcia powierzchniowego przez kwasy żółciowe.

Maetriał i odczynniki

1. Siarka sublimowana

2. Mocz prawidłowy

3. Mocz patologiczny z żółcią

Wykonanie doświadczenia

1. Przygotować trzy probówki.

2. Do pierwszej nalać 2 cm³ prawidłowego moczu, do drugiej taką samą ilość moczu patologicznego, a do trzeciej 2 cm³ wody destylowanej.

3. Na powierzchnię każdego płynu wrzucić odrobinę siarki sublimowanej.

Studenci otrzymują jako zadanie „sztuczny mocz”, który jest mieszaniną różnych składników występujących w moczu prawidłowym i patologicznym. W zadaniu są obecne dwa spośród następujących związków:

1) mocznik,

2) kreatynina,

3) aceton,

4) glukoza,

5) krew,

6) bilirubina,

7) kwas moczowy,

8) białko.

4

---