5. izolacja DNA

Głównym celem izolacji jest -uzyskanie z maksymalną wydajnością wysoko- cząsteczkowego DNA, przy jednoczesnym oczyszczeniu preparatu DNA z białek i inhibitorów enzymów, które mogą utrudniać następne etapy pracy z DNA. Bardzo zbliżonymi metodami można uzyskać DNA z bakterii, komórek roślin, zwierząt i człowieka. Pierwsze procedury izolacji DNA były właściwie nieco zmienionymi procedurami izolacji polisacharydów, opublikowanymi przez Kirby'ego w licz­nych pracach z lat 50. i 60. ubiegłego wieku. Obecnie metody izolacji DNA można podzielić na trzy grupy:

• - izolacja DNA z zastosowaniem fenolu i chloroformu celem odbiałczenia

preparatów,

• - izolacja DNA przebiegająca przez wysolenie białek z lizatów komórek,

• - izolacja DNA przez związanie z nośnikiem, odmycie zanieczyszczeń i uwol­

nienie DNA.

Nadal najlepszą metodą pozostaje izolacja z zastosowaniem fenolu i chloro­formu, dostarczająca preparaty DNA o wysokim poziomie czystości, które można dalej stosować do analizy restrykcyjnej, klonowania, reakcji PCR, sekwencjonowa- nia, transformacji bakterii i transfekcji komórek.

W badaniach dotyczących człowieka i zwierząt najlepszym materiałem wyjścio­wym jest krew obwodowa, ponieważ do wykonania pełnych badań wystarcza zale­dwie 1 ml. Podczas izolacji DNA z krwi obwodowej w początkowym etapie lizie ulegają głównie komórki nie zawierające jąder, które odrzucane są razem z suro­wicą. Leukocyty są zbierane, przemywane, a następnie lizowane. Odbiałczanie przebiega głównie przez ekstrakcję fenolem i chloroformem lub wytrącanie białek NaCl bądź LiCl. Przy ekstrakcji fenolowej należy zwrócić uwagę, aby pH było wyższe niż 7,8, ponieważ przy niższym pH znaczna część DNA pozostaje w fazie

organicznej. W końcowym etapie DNA wytrącany jest alkoholem etylowym lub izopropylowym.

Komórki krwi, plamy nasienia i fragmenty tkanek (wątroba, mięśnie, kosmówka CVS) można również poddać lizie, a następnie inkubować z proteinazą K. Odbiał- czanie i wytrącanie DNA przebiegają podobnie jak dla pełnej krwi. Opisano do tej pory wiele metod izolacji DNA. Poczyniono również próby skonstruowania urzą­dzeń do automatycznej izolacji DNA,, tzw. ekstraktorów DNA. Najbardziej znane urządzenia zawierają kilka naczyń ekstrakcyjnych umieszczonych na wytrząsarce z kontrolowaną temperaturą. Do naczyń podawane są odczynniki, które są następ­nie usuwane. DNA zbierany jest na filtrach membranowych lub kolumienkach. Mimo zapewnienia możliwości pracy jałowej i sterowania całego urządzenia kom­puterem, jak do tej pory ekstraktory DNA nie spotykają się z dużym zainteresowa­niem. Jest to dość dziwne, ponieważ osiągnięto olbrzymi postęp w automatyzacji syntezy DNA i sekwencjonowania, natomiast bardzo ważny, wstępny etap całego procesu badania DNA nie jest jeszcze w pełni zautomatyzowany. Również koszty związane z inwestycją, amortyzacją, serwisem, odczynnikami i obsługą techniczną powodują, że w dalszym ciągu w większości laboratoriów DNA jest izolowany techniką manualną. W ostatnim czasie pojawiły się wielofunkcyjne roboty labora­toryjne przystosowane głównie do wykonywania reakcji PCR i sekwencjonowania celem uniknięcia błędu laboratoryjnego i zwiększenia wydajności. Mogą być one również przystosowane do izolacji DNA.

Przebieg doświadczenia

IZOLACJA DNA Z ZASTOSOWANIEM EKSTRAKCJI FENOLEM I CHLOROFORMEM

Przed izolacją DNA materiał biologiczny można przechowywać przez kilka tygodni. Wiele metod izolacji rozpoczyna się od przeprowadzenia lizy komórek, po czym lizaty bezpośrednio poddaje się izolacji lub przechowuje przez okres tygo­dnia lub dłużej. Przedstawione procedury umożliwiają wyizolowanie DNA z dobrą wydajnością. Etapy izolacji:

1. Przeprowadzić lizę komórek przez dodanie 5 objętości buforu zawierającego NH₄C1 (155 mM NH₄C1, 10 mM KHCO3, 0,1 mM Tris-HCl, pH 7,4) i krótko inkubować, ok. 5 min. Lizat wirować przy 900* g przez 10 min celem uzyska­nia osadu jąder komórkowych.

2. Przemyć jądra PBS, następnie zawiesić w 2 ml buforu TE. Lizat można prze­chowywać w zamrożeniu przez kilka lat.

3. Ekstrahować DNA z fazy wodnej, dodając równą objętość fenolu wysyconego buforem TE. Wskazane jest łagodne wstrząsanie próbki przez 10 min. Roz­dzielić fazy przez wirowanie przy 2000x g przez 5 min, zebrać fazę wodną i ponownie ekstrahować równą objętością mieszaniny zawierającej fenol, chlo­roform i alkohol izoamylowy w stosunku 50:49:1.

4. Zebrać fazę wodną przez wirowanie, następnie dodać 0,1 objętość 3 M octanu amonu i 1 objętość izopropanolu dla wytrącenia DNA. Ten rodzaj precypitacji DNA nie jest jednak polecany do wytrącania DNA przeznaczonego dalej do klonowania. Zaleca się wtedy dodać 0,1 objętość 3 M octanu sodu i wytrą­cać DNA 2,5 objętościami etanolu. W przypadku dużych precypitatów można je zebrać końcówką mikropipety i przenieść do probówki typu Eppendorf. W przypadku mniejszych osadów należy chłodzić wytrącony DNA w temp. -20°C przez 20 min.

5. Przemyć osad DNA 75-procentowym etanolem i wysuszyć w temperaturze pokojowej lub w 37°C, a następnie zawiesić w 500 jil buforu TE. Pełne roz­puszczenie DNA wymaga sporo czasu, dlatego wskazane jest, aby pomiar stę­żenia DNA wykonywać dopiero po 24 godz. od wytrącenia DNA.

IZOLACJA DNA Z ODSALANIEM BIAŁEK

1. Pobrać 10 ml krwi obwodowej do probówek zawierających 100 pi 10-procen- towego EDTA (stężenie końcowe 0,1%), dodać 30 ml buforu do lizy o skła­dzie: 155 mM NH₄C1, 10 mM KHC0₃, 0,1 mM Tris-HCl (pH 7,4), inkubować w temp. 0°C przez 0,5 godz. z kilkukrotnym mieszaniem.

2. Wirować lizat krwi w wirówce Sorvall RT6000B: 3000 rpm, 4°C, 10 min. Ponownie zawiesić osad limfocytów w buforze do lizy i wirować. Po trzy­krotnym powtórzeniu dodać do osadu 5 ml buforu SE (75 mM NaCl, 1 mM Na^EDTA, pH 8,0), 25 pl proteinazy K (10 mg/ml) i 250 pl SDS (20%), dokładnie wymieszać i inkubować 16 godz. w temp- 55°C.

3. Uzyskany lizat intensywnie mieszać z 750 pl 6 M NaCl przez 15 sek. po czym dwukrotnie wirować 3600 rpm, 15 min, w temperaturze pokojowej. Wytrącać DNA dwoma objętościami etanolu absolutnego, przemyć 75-procentowym eta­nolem i rozpuścić w sterylnej wodzie.

IZOLACJA DNA Z ZASTOSOWANIEM MOCZNIKA

1. Pobrać 10 ml krwi obwodowej do probówek zawierających EDTA o końco­wym stężeniu 0,1% i zamrozić na 24 godz. w temp. -20°C.

2. Krew wirować w wirówce, np. Sorvall RT6000B: 3000 rpm, 10 min, 4°C. Zawiesić osad komórek w roztworze do lizy o składzie: 0,8% Triton X-100, 150 mM NaCl oraz ponownie odwirować w wirówce Sorvalł: 12 000-15 000 rpm, 10 min, 4°C.

3. Lizować jądra komórkowe przez zawieszenie osadu jąder w 2 ml 7 M mocz­nika, 0,5 ml 10-procentowego SDS, dodać 0,3 ml 10* stężonego buforu do lizy o składzie: 3,5 M NaCl, 0,013 M EDTA, 0,09 M Tris-HCl, pH 8,0, a po dokładnym wymieszaniu dodać 7 ml tego buforu (lx stężonego).

4. Uzyskany lizat dwukrotne ekstrahować równą objętością mieszaniny fenolu (wysyconego 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0) i chloroformu (1:1).

5. Rozdzielać fazę wodną i fenolową przez wirowanie w wirówce Sorvall: 8000- -10 000 rpm, 10 min, 4°C.

6. Wytrącać DNA 2 objętościami etanolu absolutnego w obecności 0,3 M octanu sodu. Osad DNA dwukrotnie płukać 1 ml 75-procentowego etanolu, rozpuścić DNA w 200 pl sterylnej wody i przechowywać w temp. 4°C. Po wykonaniu badań przechowywać w temp. -20°C.

IZOLACJA DNA Z ZASTOSOWANIEM IZOTIOCYJANIANU GUANIDYNY (GTC)

1. Pobrać 5 ml krwi obwodowej na 50 jil 10-procentowego EDTA (stężenie końcowe 0,1%).

2. Dodać 25 ml buforu do lizy (155 mM NH₄C1, 10 mM KHC0₃, 0,1 mM EDTA, pH 7,4), mieszać, inkubować 30 min w temp. 0°C. Bufor do lizy (1000 ml): 8,28 g NH₄C1, 1 g KHC0₃, 0,034 g EDTA, pH 7,4.

3. Wirować w wirówce Sorvall RT6000B: 2500 rpm, 15 min, 4°C; odrzucić supematant.

4. Osad zawiesić w 500 pi buforu do lizy, dokładnie wymieszać i inkubować w temp. 0°C przez 10 min.

5. Dodać 2 ml GTC (4 M izotiocyjanian guanidyny, 34 mM cytrynian sodu, 0,5% sarkosyl, 0,78% 2-merkaptoetanol, pH 7,0), dokładnie wymieszać przez pipetowanie, inkubować 15 min w temp. 0°C. GTC (100 ml): 47,26 g GTC, 0,735 g cytrynian sodu, 0,5 g sarkosyl, 0,78 ml 2-merkaptoetanol, pH 7,0.

6. Dodać 2,5 ml mieszaniny fenol:chlorofonn-alkohol izoamylowy (25:24:1), pH 8,0, dokładnie wymieszać.

7. Wirować w wirówce Sorvall: 3000 rpm, 15 min, 4°C; zebrać supematant.

8. Dodać 2,5 ml chloroformu, dokładnie wymieszać.

9. Wirować w wirówce Sorvall: 3000 rpm, 15 min, 4°C; zebrać supematant.

10. Dodać 5 ml etanolu (-20°C) lub 2 ml izopropanolu, zebrać osad.

11. Przemyć osad 1 ml 75-procentowego etanolu, osad suszyć w temperaturze pokojowej lub w 37°C.

12. Rozpuścić DNA w 300 jil sterylnej wody.

IZOLACJA DNA Z TKANEK

1. Rozdrobnić nożyczkami lub skalpelem na małe fragmenty 50-150 mg tkanki i przenieść do 2-mililitrowej probówki. Dodać 800 fil mieszaniny o składzie 680 pi bufom SE (75 mM NaCl, 1 mM Na^EDTA, pH 8,0), 100 ul SDS (10%), 20 pl proteinazy K (10 mg/ml). Wymieszać i inkubować w temp. 55°C przez 16 godz.

2. Uzyskany lizat ekstrahować 800 pl mieszaniny fenolu (wysyconego 0,1 M Tris-HCl, pH 7,8), chloroformu i alkoholu izoamylowego w stosunku 25:24:1. Rozdzielić fazę wodną i fenolową przez wirowanie w mikrowirówce przy 13 000 rpm, 10 min w temp. 4°C.

3. Ekstrahować zebraną fazę wodną 800 pl chloroformu. Rozdzielić fazy przez wirowanie 13 000 rpm, 10 min w temp. 4°C.




4. Wytrącić DNA z zebranej fazy wodnej przez dodanie 800 pl 2-propanolu. Osad delikatne mieszać i wirować przy 13 000 rpm przez 10 min.

5. Usunąć supernatant i dwukrotnie przepłukać osad 500 pl 75-procentowego eta­nolu. Osad wysuszyć (około 20 min w 37°C) i rozpuścić w 100-200 pl steryl­nej wody.

IZOLACJA DNA Z KOMÓREK HODOWANYCH IN VITR0

1. Przygotować dwa naczynia hodowlane (25 ml) z komórkami w stanie konflu- encji. Ocenić komórki w mikroskopie odwróconym.

2. Do naczyń dodać 5 ml PBS zawierającego EDTA lub trypsynę. Inkubować komórki w temp. 37°C przez 10 min, uwolnić komórki ze ściany naczynia hodowlanego przez krótkie intensywne wstrząśnięcie.

3. Przenieść komórki do probówki wirówkowej, odwirować przy 2500 rpm w temp. 4°C przez 5 min. Zawiesić osad komórek w 1,5 ml PBS i przenieść do probówki typu Eppendorf.

4. Odwirować komórki w mikrowirówce przy 3500 rpm, 4°C, 5 min.

5. Zawiesić osad w 100 pl buforu do lizy, dokładnie wymieszać i inkubować w temp. 0°C przez 10 min.

6. Dodać 0,4 ml GTC (4 M izotiocyjanian guanidyny, 34 mM cytrynian sodu, 0,5% sarkosyl, 0,78% 2-merkaptoetanoł, pH 7,0), dokładnie wymieszać przez pipetowanie, inkubować 15 min w temp. 0°C. GTC (100 ml): 47,26 g GTC, 0,735 g cytrynian sodu, 0,5 g sarkosyl, 0,78 ml 2-merkaptoetanol, pH 7,0.

7. Dodać 0,5 ml mieszaniny fenol:chloroform-alkohol izoamylowy (25:24:1), pH 8,0, dokładnie wymieszać.

8. Wirować w mikrowirówce przy 13 000 rpm, 5 min, 4°C, zebrać supernatant.

9. Dodać 0,5 ml chloroformu, dokładnie wymieszać.

10. Wirować w mikrowirówce przy 13 000 rpm, 5 min, 4°C, zebrać supernatant.

11. Dodać 2,5 ml etanolu (-20°C) lub 0,5 ml izopropanolu, zebrać osad.

12. Przemyć osad 1 ml 75-procentowego etanolu, osad suszyć w temperaturze pokojowej lub w 37°C.

13. DNA rozpuścić w 100 pl sterylnej wody.

IZOLACJA DNA Z PLAM KRWI

1. Wyciąć mały fragment plamy z krwi o średnicy 2 mm z bibuły lub innego materiału i umieścić w probówkach typu Eppendorf.

1. Dodać 20 pl 0,2 M NaOH.

2. Inkubować przez 5 min w temp. 75°C.

3. Dodać 180 pl 0,04 M Tris-HCl pH 7,5.

4. Pobrać 1-5 pi do reakcji PCR wykonywanej w 25 pl.

IZOLACJA DNA W SKALI MIKRO DO REAKCJI PCR

1. Podzielić włos na kawałki długości 2-3 mm i umieścić w probówkach typu Eppendorf.

2. Dodać 50 pl buforu do lizy zawierającego proteinazę K i detergenty.

3. Inkubować w temp. 56°C przez 2 godz.

4. Inkubować 10 min w temp. 100°C.