Funkcja i regulacje Artemidy: bogini w utrzymywaniu integralności genomu

Artemida/ pęknięcia obu nici DNA/ niehomologiczne lepkie końce

Artemida jest strukturalnie specyficzną endonukleazą kiedy łączy się jednostką katalityczną ufosforylowaną przez DNA-zależne białko - kinazę. Ta strukturalnie specyficzna endonukleaza jest odpowiedzialna za rozwinięcie kodujących końców struktury spinki w V(D)J rekombinacji. W naprawie pęknięć obu nici DNA, Artemida bierze udział w końcowym etapie procesu na drodze niehomologicznego łączenia końców (NHEJ). Ostatnio wykazano, że udział Artemidy w NHEJ zależy od typu uszkodzeń DNA. Co ciekawe, ostatnie dowody sugerują, że aktywność Artemidy w końcowym etapie nie jest jedyną jej funkcją. W rzeczywistości, Artemida jest szybko fosforylowana przez mutagen ataksji teleangiektazji w odpowiedzi na uszkodzenia DNA i pojawienie się tej fosforylacji w Artemidzie, powoduje jej zaangażowanie w regulację punktów kontrolnych w cyklu komórkowym. Te odkrycia sugerują, że Artemida jest wielofunkcjonalnym białkiem biorącym udział w utrzymywaniu integralności genomu na dwóch różnych poziomach; pierwszym- w końcowym etapie procesu na drodze NHEJ, innym- na ścieżce sygnałowej w regulacji cyklu komórkowego. Toteż zrozumienie funkcji Artemidy może dać nam daleko idące wejrzenie w sieć naprawy DNA. W tym artykule podsumujemy funkcje i regulacje Artemidy.

NAPRAWA PĘKNIĘĆ OBU NICI DNA

Pęknięcia obu nici DNA (DSBs), które mogą być spowodowane przez rozmaite egzo- i endogenne czynniki, stanowią poważne niebezpieczeństwo dla integralności genomu i mogą doprowadzić do śmierci komórki jeżeli pozostaną nienaprawione. Eukariotyczne komórki ewoluowały dwoma ważnymi dla reperacji DSBs szlakami: homologicznej rekombinacji (HR) i niehomologicznego łączenia końców DNA (NHEJ). Naprawa DNA poprzez HR jest ograniczona do późnej fazy S i G2 w cyklu komórkowym, podczas gdy NHEJ nie jest ograniczona do konkretnej fazy cyklu komórkowego, w związku z tym DSBs mogą być naprawiane poprzez NHEJ podczas całego cyklu komórkowego. Konsekwentność w połączeniu z rolą szlaków HR i NHEJ w naprawie DSB, w komórkach ubogich w białka szlaków HR lub NHEJ ukazuje wzrost czułości na czynniki powodujące DSB. U wyższych eukariota DSBs są głównie naprawiane przez NHEJ, zatem komórki ubogie w szlak NHEJ są generalnie wrażliwsze na promieniowanie jonizujące (IR) bardziej niż komórki ubogie w szlak HR. Za to HR odgrywa główną rolę w widełkach replikacyjnych, komórki ubogie w HR wykazują zwiększoną wrażliwość na sprzężoną replikację, pojedynczo zakończone DSB wynika z upadku widełek replikacyjnych. Również powinniśmy zauważyć, że NHEJ jest ważne dla V(D)J rekombinacji, która wytwarza różne przeciwciała i receptory komórkowe dla limfocytów T. Reakcja NHEJ może być podzielona na trzy kroki: (1) łączenie końców (2) przetwarzanie końców (3) ligacja. W etapie łączenia końców, Ku kompleks (heterodimer z Ku 70 i Ku 80) natychmiast przywiązuje się do końców DSB. Po przyłączeniu kompleksu Ku do końców DSB, DNA-zależna podjednostka katalityczna kinazy białkowej (DNA-PKcs) jest rekrutowana do końców DSB. Uważa się, że kompleks Ku/DNA-PKcs uczestniczy w ostatnim łączeniu końców podczas NHEJ, aby zabezpieczyć końce przed nukleazami jak również ułatwić reakcję przetwarzania końców. Etap przetwarzania końców jest szczególnie ważny kiedy DSBs zawiera nieligowane końce, takie jak niekompatybilne końce i chemicznie modyfikowane końce, ponieważ wszystkie ligazy DNA, wliczając ligazę IV, katalizują formację wiązania fosfodiestrowego pomiędzy końcami 5'- fosforowym i 3'- hydroksylowym. Etap przetwarzania końców opiera się na kilku enzymach, wliczając w to nukleazę i kinazę polinukleotydową, aby wytworzyć końce DNA odpowiednie dla reakcji ligacji. W końcu ligowalne końce są ponownie łączone przez DNA ligazę IV. Pomimo, że wyższe eukariota posiadają trzy różne geny kodujące ligazy dla DNA (LIG1,LIG3 i LIG4), produkt genu LIG4 - ligaza DNA IV - jest jedyną ligazą DNA, która może ligować końce DSB w reakcji NHEJ, a inne ligazy DNA nie mogą zastępować funkcji DNA ligazy IV.

ARTEMIDA ( nazwa pochodzi od helleńskiej bogini łowów, która pomaga przy porodzie) została zidentyfikowana jako gen odpowiedzialny za wysoką wrażliwość na promieniowanie połączoną z upośledzeniem odporności (RS-SCID) lub Athabasca (nazwa jeziora) SCID. Nauki in vitro i in vivo ujawniły, że Artemida jest nukleazą wymaganą do rozwinięcia kodujących końców struktury spinki podczas V(D)J rekombinacji. Jak podano powyżej, komórki ubogie w Artemidę wykazują zwiększoną wrażliwość na IR^{(promieniowanie jonizujące)} , sugerując, że Artemida jest również wymagana dla naprawy DSB drogą NHEJ. Co ciekawe, ostatnie prace sugerują, że Artemida może być zaangażowana w regulację punktów kontrolych w cyklu komórkowym jako czynnik downstream (downstream factor) w mutacji ataksji teleangiektazji i/lub ATM- i Rad3- skojarzoną kinazę (ATR). Dlatego możliwe jest, że Artemida jest wielofunkcjonalnym białkiem w utrzymaniu integralności genomu i ważnym białkiem dla zrozumienia mechanizmu naprawy DSB. W tym artykule streścimy ostatni postęp w odkryci biologicznych funkcji Artemidy w naprawie DSB i odpowiedzi na uszkodzenia DNA.

BIOCHEMICZNE I STRUKTURALNE WŁAŚCIWOŚCI ARTEMIDY

Artemida posiada ssDNA-specyficzną 5' do 3' aktywność egzonukleazy i nabywa aktywność endonukleazy kiedy łączy się i fosforyzuje z DNA-PKcs. Kompleks Artemida/DNA-PKcs specyficznie rozdziela granicę ssDNA i ds.DNA i strukturę spinki DNA, generując tępy lub wystający koniec 3' DNA (rys.1). Pomimo, że trójwymiarowa struktura nie została jeszcze określona, dwie domeny w N-terminalnym końcu Artemidy ukazują, że są ważne dla aktywności enzymatycznej. Jedna z domen jest nazywana metalo-β-laktamazą, aminokwasy 1-155 ludzkiej Artemidy, która powszechnie obserwowana w członkach nadrodziny metlo-β-laktamaz (rys.2) Inna domena, aminokwasy 156-385 ludzkiej Artemidy, jest nazywana domeną β-CASP (metallo-β-lactamases-associated CPSF ARTEMIS SNM1 PSO2).

Domena ta jest wysoce konserwatywna w innych metlo-β-laktamazach, zwłaszcza w działaniu na kwasach nukleinowych (rys.2). Ostatnio de Villartay i inni ogłosili, że histydyna wewnątrz domeny β-CASP (His254) ma decydujące znaczenie dla całkowitej aktywacji Artemidy (rys.2). Pomimo, że dokładna rola His 254 jest obecnie niejasna, zasugerowano, że jest ona zaangażowana w łącznie cynku. Pannice i in. ogłosili, że kwas asparaginowy 37 i histydyna 33, 35, 38, 115 i 319 bezpośrednio koordynują dwa miejsca dla wiązania metalu ( w szczególności Mg²⁺ (rys.2) Podczas gdy N-terminalny koniec Artemidy jest ważny dla roli enzymatycznej, C-terminalny koniec Artemidy staje się regionem zaangażowanym w interakcję z DNA-PKcs. Rzeczywiście, Artemida jest fosforylowana przez DNA-PKcs tylko na C-terminalnej domenie. Ponieważ domena C-terminalna jest zbędna dla aktywności rozplatania struktury spinki w V(D)J rekombinacji in vivo, fosforylacja C-końca może spowodować zmiany konformacji, w rezultacie uruchamiając aktywną formę Artemidy. Z drugiej strony Goodarzi i in. ogłosili, że autofosforylowany DNA-PKcs rekrutuje Artemidę do miejsc DSBs. Jako autofosforylację DNA-PKcs traktuje się jako przyczynę zmian konformacyjnych w DNA-PKcs, zmiany konformacyje w DNA-PKcs, a nie w samej Artemidzie mogą być ważne dla aktywności Artemidy.

rys.1

Podsumowując, białko Artemida jest podzielone na dwie funkcjonalne domeny, katalityczną domenę N-końcową i C-końcową domenę regulatorową i regulacja aktywności endonukleazowej Artemidy może przyczynić się do zapobiegania niepotrzebnym uszkodzeniom DNA(rys.3).

ARTEMIDA I POWIĄZANE Z NIĄ BIAŁKA

Artemida jest członkiem rodziny SNM1, którą stanowią produkty genu homologiczne do drożdży SNM1 i stąd Artemidę często określa się jako SNM1C. Drożdże SNM1 posiadają aktywność 5' do 3' egzonukleazy, zależną od ich katalitycznej domeny. Analiza genetyczna pokazuje, że SNM1 uczestniczy w naprawie interstran cross-links (ICLs) i że aktywność egzonukleazy SNM1 jest ważna dla naprawy ICL. Co ciekawe, jakkolwiek aktywność egzonukleazy Artemidy jest niezależna od jej domeny katalitycznej, sugerujemy, że aktywność egzonukleazy Artemidy i SNM1 są funkcjonalnie niepowiązane. Zgodnie z tym, linie komórek fibroblastu od pacjentów z RS-SCID/SCID nie wykazują zwiększonej wrażliwości na czynniki wywołujące ICL, chociaż komórki te są nadwrażliwe na IR. Podobnie w komórkach DT40 kurczaka, SNM1 jest zaangażowane w naprawę ICL i niezaangażowane w naprawę DSB, podczas gdy Snm1c-ubogie komórki są wrażliwe na IR, ale nie są wrażliwe na cisplatynę czynnik wywołujący ICL. Ostatnio wykonano docelowe zakłócenia

genu ARTEMIDY w ludzkich komórkach pre-B

linii Nalm-6 i stwierdzono, że komórki ARTEMIDY^-/- wykazują zwiększoną wrażliwość
na niskie dawki IR (rys.4), ale nie na cisplatynę. Te wyniki są zgodne z poglądem, że Artemida nie jest zaangażowana w naprawę ICL, ale jest zaangażowana w naprawę DSB poprzez drogę NHEJ. Rzeczywiście ludzkie komórki ARTEMIDY^-/- wykazują zwiększoną wrażliwość na etopozyd, potencjalny inhibitor topoizomerazy II, który powoduje DSBs. Co istotne, jakkolwiek stopień wrażliwości na etopozyd w komórkach ubogich w Artemis była znacznie mniejsza niż ta w komórkach ze zmniejszoną ilością DNA ligazy IV, sugerując ograniczoną rolę Artemidy w naprawie DSB przez NHEJ. Co intrygujące, Riballo i in. poinformowali, że Artemis jest niezbędna jedynie do naprawy części (15%) DSB indukowanych przez IR, zwłaszcza tych naprawianych z wolną kinetyką i tych zlokalizowanych przy regionach heterochromatyny. Te wyniki stanowią ważne wskazówki co do funkcji Artemidy, ponieważ sugerują, że naprawa DSB zależna od Artemis jest zależna od ATM (patrz poniżej).

Kolejny członek z rodziny SNM1, SNM1B, również posiada aktywność 5' do 3' egzonukleazy. SNM1B określany jako Apollo, SNM1B jest ściśle związany z Artemis; Apollo jest bratem bliźniakiem Artemis w mitologii helleńskiej. Pomimo strukturalnych podobieństw Apollo i Artemidy, poinformowano, że komórki DT40 ubogie w Snm1b, w przeciwieństwie do komórek ubogich w Snm1c, wykazują zwiekszona wrażliwość na czynniki wywołujące ICL, ale nie na IR, co sugeruje, że Apollo jest zaangażowany w naprawę ICL, ale nie w naprawę DSB. Pokazane jest to w komórkach HEK293, że shRNA- pośredni bardzo obniża rezultaty Apollo w zwiększonej wrażliwości na czynniki wywołujące ICL. Co ciekawe, jakkolwiek aktywność egzonukleazy Apolla wydaje się być zbędną dla naprawy ICLs. Odkąd Apollo oddziałuje z ludzkim białkiem telomerowym TRF2, przez jego N-końcową domenę, Apollo może chronić telomery przed niechcianą naprawą DNA. Stąd, w przeciwieństwie do Artemidy, SNM1 i Apollo mają duże szanse być zaangażowane głównie w naprawę ICL.

BIOCHEMICZNA ROLA ARTEMIDY W NHEJ

Jak wspomniano powyżej, analiza genetyczna wykazała zaangażowanie Artemidy w NHEJ. Badania in vitro pokazały, że kompleks Artemida/DNA-PKcs może generować także tępe lub 3' wystające 2-4 zasad końce. Daltego uważa się, że Artemida bierze udział w etapie przetwarzania końców w NHEJ. DNA ligaza IV może ligować niekompatybilne końce DNA z 3' wystającymi końcami w obecności Ku, Artemida może odgrywać rolę w NHEJ tylko kiedy cięcie końców jest niezbędne dla ligacji. Na przykład kompleks Artemida/DNA-PKcs może usuwać chemicznie modyfikowane końce. Zgodnie z tą ideą, analiza biochemiczna ujawniła, że kompleks Artemida/DNA-PKcs może przetwarzać takie chemicznie modyfikowane końce na formę odpowiednią do ligacji z minimalną stratą w sekwencji terminalnej. Takie chemicznie modyfikowane DSBs są często indukowane przez IR i inne czynniki radiomimetyczne (dające efekty takie jak promieniowanie X). Wiadomo, że IR i inne wolne rodniki indukujące DSB z zarówno 3'- fosforowymi lub 3'- fosfoglikzydowymi końcami, podczas gdy radiomimetyczne enodiynowe antybiotyki, takie jak neokarcynostatyna, indukują końce 5'- aldehydowe. Stąd, etap przetwarzania końców przez aktywność endonukleazy kompleksu Artemida/DNA-PKcs może być wymagana dla usunięcia chemicznie modyfikowanych końców. Ostatnio Ma i in. skonstruowali system biochemicznie definiujący ssaczy NHEJ i ostrożnie zbadali łączenie niekompatybilnych końców DNA. W tym systemie podstawowe składniki NHEJ, Ku70, Ku80, Artemida, DNA-PKcs, ligaza DNA IV i XRCC4, były zdolne do łączenia niekompatybilnych końców DNA. Co ciekawe, na długość produktu reakcji miała wpływ obecność Artemida/DNA-PKcs zgodnie z nukleolityczną rolą tego kompleksu w przetwarzaniu końców. Co więcej, ostatnie badania zasugerowały, że C-koniec Ku80 jest ważny nie tylko dla naprawy uszkodzeń DNA indukowanych przez IR, ale także dla pośredniczenia Artemidy w przetwarzaniu końców DNA. Pomimo, że możliwe jest, że inne nukleazy również uczestniczą w reakcji
przetwarzania, kompleks Artemida/DNA-PKcs ma duże szanse zostać głównym enzymem w etapie przetwarzania końców w NHEJ u wyższych eukariota.

UCZESTNICTWO ARTEMIDY W ODPOWIEDZI NA USZKODZENIA DNA

Wykazano, że ATM i ATR jak również DNA-PKcs fosforyzują Artemidę w odpowiedzi na uszkodzenia DNA i ufosforylowana Artemida fizycznie wiąże się z kompleksem Mre11/Rad50/ zespół Nijmegen'a w sposób ATM-zależny. Co niezwykłe, Chen i in. wykazali, że ser645 osadzona w Artemidzie jest fosforylowana w odpowiedzi na napromieniowanie IR (rys. 2). Kilka grup zbadało związek pomiędzy fosforylacją Artemidy a postępem cyklu komórkowego. Jeggo i współpracownicy ogłosili, że komórki ubogie w Artemidę miały niezmieniony punkt kontrolny G2/M i w ten sposób wykazano przedłużenie zatrzymania G2/M po napromieniowaniu IR; dla porównania, Legerski i współpracownicy zaprezentowali złożone dane, że Artemida była niezbędna dla niezmienionego zatrzymania G2/M po napromieniowaniu IR. Możliwym wytłumaczeniem dla tej rozbieżności mogło by być to, że do badań użyto różnych linii komórkowych (główne fibroblasty czerpane od pacjentów SCID w stosunku do 293 transformowanych komórek nerki zubożonych w Artemidę). Ewentualnie rozbieżność może wynikać z różnicy w fazie cyklu komórkowego kiedy w trakcie badań komórki zostały opromieniowane (komórki asynchroniczne w stosunku do komórek wzbogaconych fazą S).

Grupa Legarskiego również wykazała, że Artemida jest fosforylowana na ser516 i ser645 przez ATR w odpowiedzi na światło UV i ta fosforylacja jest zaangażowana w regenerację zatrzymania fazy S. W ścieżkach sygnałowych ATM/ATR, kinazy Chk1 i Chk2 spełniają role klucza regulatorów downstream, które fosforylują rózne białka zaangażowane w punkty kontrolne cyklu komórkowego po uszkodzeniu DNA. Co intrygujące, ani Chk1 ani Chk2 nie jest zaangażowane w IR- i UV- indukowaną hiperfosforylację Artemidy. Te obserwację sugerują, żę Artemida jest bezpośrednim czynnikiem downstream w ścieżce sygnałowej ATM (i przypuszczalnie ATR). Zgodnie z tym poglądem analiza epistazy_{(wpływ jednego genu na ekspresję drugiego)} z użyciem ludzkich fibroblastów pochodzących od pacjentów z ataksją teleangiektazją i od pacjentów z deficytem Artemidy RS-SCID, okazało się, że ATM i Artemida pełnią funkcję w powszechnej drodze naprawy DNA. Co więcej droga ta wymaga H2AX, 53BP1 i DNA-PKcs jak również Mre11 i Nbs1. Dlatego fosforylacja ser645 może uruchomic zmiany konformacyjne w Artemidzie, które umożliwią jej fizyczną interakcję z kompleksem Mre11/Rad50/Nbs1. Genetyczną interakcję pomiędzy 53BP1i Artemidą wykazano w komórkach ssaków, zgodnie z obserwacją, że Artemida nawiązuje fizyczny kontakt z 53BP1, jednak w komórkach DT40 kurczaka 53BP1 ujawnia odgrywaną rolę w drodze różniącej się od drogi ATM Artemido-zależnej. Razem te obserwacje mocno sugerują, że Artemida pełni rolę strażnika powstrzymującego niestabilność genomu poprzez regulację postępu cyklu komórkowego wspólnie z ATM i czynnikami downstream (rys.6). Ponieważ ATM uruchamia apoptozy poprzez fosforylację p53 przy ser15, jest możliwe, że Artemida może być zaangażowana w p53-zależną drogę sygnałową apoptozy. Co ciekawe, jednakże ostatnio poinformowano, że Artemida może spełniać rolę ujemnego regulatora p-53. Szczególnie po stresie oksydacyjnym bardzo niski poziom Artemidy prowadzi do spontanicznej aktywacji p53 przez fosforylację przy ser 15 i ser37, powodując zatrzymanie G1 i dalszej apoptozy. Pomimo, że biologiczne znaczenie tej funkcji Artemidy jest obecnie niejasne, odkrycie to sugeruje, że Artemida może dawać sygnał dla p53 w określonych warunkach. Dalsza analiza wyjaśnia dokładny związek pomiędzy Artemidą i drogą p53.

W artykule tym opisaliśmy właściwości biochemiczne Artemidy i jej biologiczne funkcje w świetle utrzymywania integralności genomu. Wyobrażalne jest, że Artemida na dwóch wyraźnych poziomach; pierwszym na etapie przetwarzania końców w NHEJ i drugim na drodze sygnałowej w postępie cyklu komórkowego. W jednej i drugiej drodze te funkcje Artemidy są prawdopodobnie regulowane poprzez fosforylację.

Odkąd Artemida nie występuje w drożdżach, rozsądnym jest spekulować, że Artemida przyczynia się do skutecznej naprawy DSB u wyższych eukariota. Na przykład kompleks Artemida/DNA-PKcs może służyć do twożenia końców DNA, które są w sposób uprzywilejowany ponownie łączone przez ligazę DNA IV, powodując natychmiastową naprawę DSB z minimalną stratą nukleotydów. Dalsza analiza funkcji Artemidy dostarcza szczegółowej informacji o mechanizmie zapewniającym integralność genomu u wyższych eukariota.

---