ROLA DIAGNOSTYKI W POSTĘPOWANIU LEKARSKIM - wykład 1

nowe rozwiązania techniczne badania naukowe

praktyka lekarska

Dziedziny diagnostyki:

• chemia kliniczna ( badania biochemiczno-enzymatyczne )

• diagnostyka hematologiczna z koagulologią

• parametry krytyczne ( RKZ, elektrolity )

• diagnostyka serologiczna ( transfuzjologia )

• immunodiagnostyka ( immunoenzymatyczna, immunoradiologiczna )

• analiza moczu ( urinalysis - badanie moczu, kału, płynów z jam ciała )

• diagnostyka mikrobiologiczna ( bakteriologia, wirusologia, mykologia )

Cele i zadania:

• badanie właściwości fizycznych, chemicznych, biologicznych i składu wydzielin, płynów ustrojowych, wydalin w celu profilaktycznym, diagnostycznym, leczniczym oraz sanitarno-epidemiologicznym

• zadanie badań laboratoryjnych → dostarczenie lekarzowi informacji niezbędnych lub istotnych dla diagnozy i leczenia, jak i profilaktyki

• takie informacje mają dla lekarza wartość decyzyjną

tylko wyniki w pełni wiarygodne są użyteczne klinicznie

Wiarygodność:

1. analityczna → wynik uzyskany wskutek procedury analitycznej wykonanej zgodnie z przepisaną metodą i pod stałym procesem kontrolnym

2. kliniczna

uważa się że do 60% wiarygodnnej i pomocnej informacji o chorym, wykorzystywanej przez lekarzy dostarcza diagnostyka laboratoryjna

Objawy jako podstawowe rozpoznanie choroby

• choroba- to zespół dolegliwości manifestująca się objawami - pogłębiona przez badanie lekarskie

• zdrowie - to pełen dobrostan fizyczny, psychiczny i społeczny, a nie brak choroby lub niedomagania

Wynik poprawny analitycznie nie zawsze jest wynikiem wiarygodnym.

• Tzw. „ konwencja objawowa” → „ choroba jest wtedy, kiedy są jej objawy”

• Ale nie zawsze tam, gdzie nie ma objawów nie ma również choroby.

• Różna jest też samoocena ustroju przez pacjenta.

Zdrowie - przeciwieństwo choroby; ale człowiek bez widocznych objawów nie zawsze jest zdrowy.

Wynik nieprawidłowy = prawdziwie dodatni PD

Wynik prawidłowy = wynik prawdziwie ujemny PU

Przedmiot i cele badań laboratoryjnych

1. Rozpoznanie choroby

Definicja narządowa choroby → strukturalne uszkodzenie narządu

CHOROBA ( def. wg Polskiego Słownika Medycznego ) → reakcja ustroju na działanie czynnika chorobotwórczego prowadząca do wyczerpania zdolności adaptacyjnych ustroju, do zaburzeń współdziałania narządów i tkanek, a w następstwie do zaburzeń czynnościowych i zmian organicznych tkanek, narządów, układów i ustroju.

Markery uszkodzeń narządowych  enzymy i białka narządowo swoiste.

2. Zagrożenie chorobą ( przewidywanie, predykcja hsCRP), czynniki ryzyka ( cholesterol)

Czynniki ryzyka   ryzyko wystąpienia chorób ( np.  CH =  miażdżycy )

Do czynników należą:

Wiek, płeć,

Równocenność źródeł informacji diagnostycznej:

• ostre zapalenie trzustki ( objawy kliniczne, USG, badania laboratoryjne )

• zawał ( EKG, objawy kliniczne, badania laboratoryjne )

3. Kontrolowanie przebiegu choroby
   ( gazy krwi, klirens kreatyninowy - MDRD) i skuteczności leczenie ( hipercholesterolemia, niedobór Fe, INR. Stężenie leku)

Rozpoznawanie upośledzenia funkcji narządów

• Stężenie kreatyniny i mocznika wydolność filtracji kłębkowej

• l iczba RBC,MCV,MCH, MCHC, HGB wydolność układu czerwonokrwinkowego

• poziom glikemii we krwi zdolność trzustki do wydzielenia insuliny lub/i wrażliwość/tolerancja receptorów na insulinę

rozpoznanie zaburzeń struktury narządów

• ALAT,ASPAt osre uszkodzenie hepatocytów

• TnI,TnT ostre uszkodzenie myocardium

• Przyrost stężenia kreatyniny w osoczu w czasie ostra niewydolność nerek, uszkodzenie nerek

• Aktyność a-amylazu=y, lipazy ostre zapalenie trzustki

• Cholesterol o LDL wzrost ryzyka CSN, spadek w leczeniu statynami

• HDL spadek wraz ze wzrostem cholesterolu i LDL wzmaga ryzyko CSN i pozwala na wdrożenie leczenia

• TG wzrost wskazuje na zmianę struktury cząsteczek lipoprotein w kierunku bardziej atoerogennej LDL

• CRP

4. Rokowanie ( peptyd natriuretyczny, CRP w sepsie)

badania służące ocenie ryzyka uszkodzeń nrządów

• hsCRP, troponiny, peptyd natriuretyczny,

badania służace ocenie skutków uszkodzeń

Racjonalna diagnostyka

• uzyskanie prawidłowego rozpoznania przy optymalnym nakładzie środków:

• stosowanie właściwych metod diagnostycznych → bez taktyki „na wszelki wypadek zlecę badania-może zażąda szef, może wynik się przyda”; stosowane metody powinny się uzupełniać ( z badaniem EKG, USG, RTG ) → zbyt duża liczba badań jest niewskazana

• interpretacja wyników badań synoptycznie → tzn. oceniać wyniki w grupach badań → daje to całościowy obraz choroby

• na I miejscu wywiad, badanie podmiotowe, potem tworzenie hipotezy roboczej ( rozpoznanie wstępne ), potem racjonalne zlecanie metod diagnostycznych

Diagnostyka etapowa

badania podstawowe( przydatność) badania poszerzone ) potwierdzenie wstępnego rozpoznania)

!! Diagnostyki etapowej nie stosujemy w przypadku stanów ostrych, przy wysokim prawdopodobieństwie prawidłowego rozpoznania wstępnego.

Zlecenie na badania laboratoryjne:

1. kod kreskowy

2. nazwisko, imię, PESEL

3. data urodzenia, płeć

4. nazwa ZOZ, oddziału szpitalnego, poradni, gabinetu lekarskiego, lekarza ( pieczątka )

5. adres pacjenta

6. cel badania ( wstępne rozpoznanie ), ew. leki mogące mieć wpływ na wynik

7. wykaz zleconych badań

8. rodzaj materiału biologicznego kierowanego do badania

9. pieczątka i podpis lekarza

rodzaje materiału biologicznego do badań

1. krew

1. wg rodzaju badania

1. krew pełna - na skrzep do badań grup krwi - nie krzepnie

2. osoczne - na antykoagulant, badania pilne, trudności z wykrzepianiem

3. surowica z krwi pełnej do badań biochemicznych i immunochemicznych ( brak jonów wapnia - nie oznaczamy krzepnięcia krwi!!)

2. wg rodzaju oznaczeń krwi pełnej

1. żylna

2. włośniczkowa

3. włośniczkowa arterializowana ( obwodowa np.z opuszka palca, płatka ucha pięty dziecka) do RKZ, elektrolitów i gazów krwi

4. tętnicza

antykoagulanty

1. heparyna - 0,1 mg/ml ( nie do hemostazy)

2. Wersenian - EDTA - 1 mg/ml ( morfologia, interferuje w oznaczeniach elektrolitów i enzymów )

3. cytrynian sodu - 4 mg/ml ( nie do RKZ i elektrolitów ), badania krzepnięcia tak!!

4. szczawian potasu - 2 mg/ml ( nie do elektrolitów, RKZ, enzymów )

2. mocz można przechowywać

1. porcja ranna

2. porcja dowolna

3. dobowa zbiórka ( wydalanie elektrolitów, albuminuria) - od 8 do 8,mocz przed 8 wylać; mierzymy objętość, dobrze wymieszać, przelać kilkadziesiąt ml i odać do laboratorium

4. na badanie bakteryjne ( ranny, środkowy strumień)

3. płyn mózgowo-rdzeniowy

1. opóźnienie zmian w stosunku do krwi o kilka h

4. kał

1. badanie ogólne

2. krew utajona

3. pasożyty

5. płyny z jam ciała ( opłucnej, stawów)

6. ślina

7. nasienie - aktywność biologiczna plemników

8. rozmazy

9. włosy - wydalanie Arsenu !!

3 etapy badania laboratoryjnego:

1. etap przedanalityczny ( przedlaboratoryjny )

• właściwe ustalenie wskazań i dobór badań zleconych

• czynności przedanalityczne odpowiedzialne są za 50-80% wyników niepoprawnych analitycznie

Przygotowanie pacjenta do badania

• na czczo ( dopuszczalny lekki posiłek dla osób długo dojeżdżających, ale nie w przypadku oznaczania glikemii)

• pacjent wypoczęty, bez stresu, bez wysiłku fizycznego

• po odpowiedniej diecie i bez alkoholu → może zjeść obiad poprzedniego dnia, na kolację produkty tylko ubogowęglowodanowe, rano na czczo, do badania lipidów do 16h bez tłuszczów, alkohol!

• po umiarkowanym spożyciu leków poprzedniego dnia ( tylko leki niezbędne)

Warunki pobrania krwi:

• rano między 7.00 a 9.00-10,0 ( rytm dobowy niektórych parametrów)

• do badania stężenia leków przed podaniem rannej dawki leku

• pobierać w pozycji siedzącej / półleżącej / leżącej, ale oczekiwać na pobranie w pozycji siedzącej ( białko ortostatyczne brak!)

• ucisk stazy max 1 min

• objętość krwi niezbędna do wykonania badania - zwykle do badań biochemicznych i immunochemicznych 2-5 ml,
  do morfologii 2-3 ml

• wskazany jest system podciśnieniowego pobierania krwi - odpowiednie mieszanie krwi pobranej do probówek

Warunki transportu i przechowywania materiału:

• czas ( łączny od momentu pobrania do badania ) Mocz musi być badany do 4h od pobrania

• warunki transportu ( temperatura, nasłonecznienie, wstrząsanie, pojemniki )

• identyfikacja pacjenta ( nierozłączność z badaną próbką, trwałość oznakowania)

• miejsce i sposób odesłania wyniku

• identyfikacja lekarza

• glukozy nie trzymamy w lodówce do następnego dnia , bo stężenie będzie 2x niższe

2. etap analityczny ( laboratoryjny )

3. etap postanalityczny ( pozalaboratoryjny )

Zmiana pozycji pacjenta z leżącej na stojącą:

•  HDL o 10-15%

•  wartości HGB o 5-20%

•  [Ca²⁺]

Długotrwałe głodzenie:

•  elektrolity

• Na⁺, Cl^- →  o 50-100%

• K⁺, Ca²⁺, Mg²⁺ →  o 20-50%

•  mocznik, kreatynina o ~ 10%

•  amoniak o 100-300%

Posiłek:

•  TG 1,7-2 x

•  bilirubina, Glu, AspAT 1,3 x

Alkohol:

• częste picie alkoholu w niewielkich ilościach tolerowanych ( 15-30 g ) lub wypicie ilości 50-80 g w przeddzień pobrania nie ma istotnego wpływu na wynik

• wypicie dużych ilości może mieć wpływ na wynik → dochodzi do tzw. zespołu następnego dnia:

• kwasica metaboliczna ( tu mleczanowa )

•  kwasowości soku żołądkowego

• niedobór elektrolitów i odwodnienie

•  działania odurzającego

• objawy ze strony przewodu pokarmowego

• ogólne rozbicie ( bóle głowy, zawroty, osłabienie )

Przewlekły alkoholizm:

• GGT ( γ-glutamylotransferaza ) -  kilkanaście x

• AlAT, AspAT -  do 2-3 x

• MCV -  u ponad 50% do 95 fl i więcej

• wit. B₁₂ , foliany -  u ponad 50%

PODSTAWY INTERPRETACJI WYNIKU
BADANIA LABORATORYJNEGO - WYKŁAD 2

Dokładność oznaczania

• Dokładność - to zgodność wyniku z wartością rzeczywistą oznaczanego parametru

• Różnicę między wartością uzyskaną w oznaczeniu ,a rzeczywistą badanego parametru określa błąd oznaczenia

• Im różnica między wartością uzyskaną, a rzeczywistą jest mniejsza tym dokładność większa,
  a błąd oznaczenia mniejszy

• Im większy jest rozrzut wyników oznaczeń tym mniejsza jest precyzja, a błąd systematyczny większy

• Błąd trywialny - ujawnia się przy interpretacji wyniku np. złe pobranie, omyłka, zanieczyszczenie próbki

Precyzja metody:

• powtarzalność - miarą jest rozrzut wyników w tym samym materiale w serii jednoczesnej

• odtwarzalność - rozrzut wyników w tym samym materiale w dłuższym czasie

Zmienność analityczna:

• błąd pomiaru

• błąd powtarzalny ( przypadkowy ) - różnice pomiędzy oznaczeniem tej samej próbki

Przyczyny błędów:

• niedokładność przyrządów

• nieprawidłowości

• brak możliwości dokładnego oznaczenia parametrów

• czynniki losowe

Kryteria analityczne wiarygodności wyniku:

• dopuszczalny błąd metody - błąd, który nie zmienia znaczenia klinicznego wyniku

• historyczne kryterium Tonksa - błąd nie może być większy niż ¼ zakresu wartości prawidłowych

Błąd analityczny

• NIE DO UNIKNIĘCIA. Mierzymy w wartościach bezwzględnych lub względnych

• Błąd systematyczny - błąd wynikający z zastosowanej metody pomiaru lub innych przyczyn, zwykle zmieniający wynik pomiaru jednostronnie

• Czułość analityczna - najmniejsza ilość badanej substancji, która może być miarodajnie oznaczona z użyciem określonej metody. Czułość zależy od precyzji i dokładności metody

• Swoistość analityczna - zdolność stosowanej metody do swoistego reagowania z oznaczaną substancją w danym materiale biologicznym. Problem oznaczeń w płynach ustrojowych

• Matryca analityczna badanej próbki - wszystkie składniki chemiczne w badanej próbie

Kontrola jakości badań laboratoryjnych

1. Wewnątrz laboratoryjna

1. Kontrola powtarzalności

2. Kontrola odtwarzalności

3. Kontrola dokładności

2. Zewnątrz laboratoryjna - Centralny ośrodek jakości badań w diagnostyce laboratoryjnej

Wielkości oznaczane

1. Badania jakościowe

1. Białko, cukier, bilirubina w moczu,

2. obecność p/ciał lub antygenów we krwi,

3. badania na krew utajoną w kale

4. Badania mikroskopowe - jakościowe i ilościowe

5. Bakteria HP w żołądku - test oddechowy

2. Badania ilościowe ( j.masy/l lub mmol/l)

1. Ocena półilościowa

2. Oznaczanie w pełni ilościowe

• Drobnocząsteczkowych metabolitów np. mocznik, kreatynina, bilirubina, cholesterol, TG

• Białko całkowite i pojedynczych białek

• Pośrednia biopsja biochemiczna - aktywność katalityczna w U/I, różna swoistość narządowa

• Swoistych „markerów narządowych” sercowych, onkologicznych

Zmienność wewnętrzna w grupie badanej populacji

Zmienność biologiczna - zróżnicowanie wartości stężeń substancji biologicznych endogennych występujących w danej populacji. Wpływają na nią:

• Wiek, płeć, waga,

• rasa,

• dieta, tryb życia, pora roku,

• stan fizjologiczny,

• czynniki przedlaboratoryjne,

• zastosowana metoda oznaczeń.

• Determinowana jest również w sposób losowy - zależy od każdego badanego osobnika

Zbiór wartości stężeń substancji biologicznych opisujących zmienność danego parametru
można ocenić za pomocą parametrów statystycznych

Zakres normy - Zbiór wartości określających stężenie danej substancji w populacji osób zdrowych ( populacja powinna być szeroka i zróżnicowana )

Może mieć rozkład:

• symetryczny - rozkład normalny, krzywa Gaussa - 5% populacji jest poza rozkładem normalnym !!

• niesymetryczny

wyznaczanie wartości prawidłowych

• metoda +/- 2SD ( odchylenia standardowe) dla rozkładu normalnego

• metoda per centylowa ( najczęściej 2,5-97,5 percentyl) 50percentyl to mediana

Mediana - wartość środkowa ( średnia arytmetyczna przy rozkładzie symetrycznym, wartość występująca najczęściej.) przy rozkładzie niesymetrycznym nie jest średnią arytmetyczną, ani nie jest najczęstsza

Wartości prawidłowe i nieprawidłowe

• „Norma” dotyczy osób zdrowych. Nie zawsze określona choroba ma istotny wpływ na zmienność biologiczną określonego parametru.

• Wynik w granicach normy nie może być uznany jako wskaźnik ogólnego zdrowia.

• Wartości prawidłowe mogą zmieniać się z wiekiem

• Częstość występowania wyników FD i FU można zmniejszyć obniżając rozrzut wyników mieszczących się w zakresie normy przez ograniczenie zmienności biologicznej wewnątrz badanej grupy

• Ludzi zdrowych charakteryzują wyniki PRAWDZIWIE UJEMNE, a ludzi chorych wyniki PRAWDZIWIE DODATNIE

Wartość nieprawidłowa - choroba wpływa w istotny sposób na wartość stężeń oznaczanych parametrów.

Wyznaczanie wartości prawidłowych:

• przy rozkładzie normalnym ± 2 S_D

• metoda percentylowa ( najczęściej 2,5-97,5 percentyl  95% populacji )

Zakres wartości referencyjnych

• zbiór wartości określających stężenia danej substancji w dobrze dobranej i określonej populacji u osób zdrowych.

• Wyznacza się w oparciu o płeć, wiek rasę, rejon zamieszjania, odżywianie, stan fizjologiczny

Stosowanie wartości referencyjnych zwiększa moc diagnostyczną testów laboratoryjnych → łatwiej ustalić wartości graniczne.

Wartość decyzyjna WD ( graniczna, odcięcia ) - określa rozgraniczenie między grupą chorych i grupą zdrowych; ma charakter umowny ( najczęściej empiryczny ), rozdziela wyniki prawidłowe od nieprawidłowych.

Przesuwanie WD ( wartości decyzyjnej ) w kierunku wartości wyższych ( w kierunku wartości występujących w grupie chorych ) zwiększa % wyników w grupie zdrowych, wzrasta czułość diagnostyczna testu ( brak wyników F_U ).
Jednocześnie spada swoistość testu ( wzrasta % wyników F_D ).

Wartość krytyczna jej przekroczenie w górę lub w dół stanowi zagrożenie dla życia.

Wartości krytyczne wybranych parametrów:

HCT < 14% > 60%

trombocyty < 20 000μl > 1 000 000μl

bilirubina w surowicy > 18 mg/dl

glukoza < 40 mg/dl > 500 mg/dl

K⁺ < 2,5 mmol/l > 6,5 mmol/l

Na⁺ < 120 mmol/l > 160 mmol/l

pO₂ < 40 mmHg

pCO₂ < 20 mmHg > 70 mmHg

posiew krwi (+)

Czułość i swoistość diagnostyczna badań laboratoryjnych

Cz = x 100%

Czułość diagnostyczna - określa zdolność testu do wykrycia prawdziwie chorych w populacji ( wykluczenie zdrowia)

Sw = x 100%

Swoistość diagnostyczna - określa zdolność testu do wykrycia prawdziwie zdrowych w populacji ( wykluczenie choroby )

Zdolność rozpoznania choroby - wartość predylekcyjna wyniku - nie trzeba umieć !!

WPD =

Wartość predykcyjna dodatnia - określa prawdopodobieństwo rozpoznania choroby na podstawie dodatniego wyniku testu; oznacza prawdopodobieństwo, że badany człowiek jest rzeczywiście chory.

WPU =

Wartość predykcyjna ujemna - określa prawdopodobieństwo wykluczenia choroby na podstawie ujemnego wyniku testu, czyli oznacza wartość prognostyczną wyników P_U.

Ef =

Efektywność diagnostyczna - iloraz sumy wyników P_D i P_U w odniesieniu do wszystkich badanych przypadków. TRZEBA UMIEĆ

LAbaratoryjne badania profilaktyczne

Podstawowe u ludzi zdrowych przed 40rż.

• Badanie ogólne moczu

• Morfologia krwi obwodowej

• Stężenie glukozy

Podstawowe badanie u ludzi zdrowych po 40rż:

• Badanie ogólne moczu

• Morfologia krwi obwodowej

• Stężenie glukozy, mocznika, kreatyniny, białka całkowitego, cholesterolu, TG i Ew. HDL, LDL

Badania poszerzone

• Zagrożonych miażdżycą: profil lipidowy, CRP

• U cukrzyków: mikroalbuminuria, Hb glikowana, GFR

• U mężczyzn po 50rż.: PSA, krew utajona w kale

• Parametry związane z narażeniem zawodowym

Albumina w moczu - test predykcyjny niewydolności nerek

Mikroalbuminuria - powikłania cukrzycy i HA

Należy uwzględnić chorobę przewlekłą lub inne czynniki związane z nieznaną chorobą pacjenta:

• cukrzyca

• leczenie Fe

• pacjent nieprzytomny

• białaczki

Zewnątrzlaboratoryjne czynniki przedanalityczne:

• związane z pacjentem

• fizjologiczne ( dziecko, noworodek, ciężarna )

• stabilność pacjenta

• wstrząs

• staza, pobranie z wenflonu

• rodzaj pobranego materiału

• inne choroby pacjenta

• związane z warunkami pobrania próbki

• staza, rodzaj pobrania, pro- i antykoagulanty

• sposób postępowania z próbką ( transport - czas, temperatura, światło )

• identyfikacja pacjenta i próbki

• identyfikacja lekarza

Materiał:

• surowica / osocze → chemia kliniczna, immunochemia

• krew na cytrynian → hemostaza

• krew na EDTA → hematologia

• krew kapilarna → glukoza, gazometria

• mocz

Glikemia → krew kapilarna na NaF

Wykład 3
choroby cywilizacyjne i przewlekły stan zapalny w chorobach
sercowo-naczyniowych

Choroby cywilizacyjne - globalnie szerzące się , powszechnie znane choroby, spowodowane rozwojem cywilizacji. Częstotliwość ich występowania zależy od stopnia rozwoju cywilizacyjnego społeczeństwa

• Cukrzyce

• A, udar mózgu

• OHD i niewydolność krążenia

• Nowotwory

• Alkoholizm

• Gruźlica

• POCHP

• Astma oskrzelowa i inne choroby alergiczne

• Psychozy afektywne

• Otyłość i zespół metaboliczny

• Narkomanie i lekomanie, palenie tytoniu

• Karoshi ( medyczne skutki przeciążenia pracą)

• Anoreksja i jadłowstręt psychiczny

Czynnik ryzyka - substancja mająca wpływ bezposrendi lub po,sredni związany z rozwojem choroby

Wskaźnik ryzyka-

• nie ma wpływu na procesy patofizjologiczne choroby a jedynie wskazuje na zagrożenie lub stopień zaawansowania choroby ( troponiny)

Cechy wskaźnika ryzyka

• Pozwala oszacowac zagrożenie

• Brak związku przyczynowo-skutkowego z chorbą

• Wskaźnik uszkodzenia narządów

• Odzwierciedla wielkość zaawansowania już istniejącej chorboy

Cechy idealnego czynnika ryzyka

• Istnieje test diagnostyczny o odpowiedniej czułości i swoistości diagnostycznej

• Istnieje ilościowa korelacja między oznaczonaą wartością a ryzykiem choroby wykazana w prospektywnych badaniach epidemiologicznych

• Czynnik ten jest niezależny od innych znanych czynników ryzyka

Szczególne kategorie ryzyka IHD

• Cukrzyca typu 2

• Papierosy

• Cholesterol >190mg/dl (4,92mmol/l)

• >140/90mmHg

• Zespół metaboliczny i otyłość

• Przewlekły stan zapalny w tętnicach CRP

• Zakażenia Chlamydia, Helicobater, CMV, Herpes Simplex, Mycoplasma

Przypadkowe stwierdznie glukozy >200mg/dl + wielomocz + utrata masy ciała lub glikemia na czczo >126mg/dl

HbA1C w ocenie ryzka chorobami N-S

• Retrospektywny wskaźnik gliekemii - monitorowanie leczenia cukrzycy

• Niezależny czynnik późnych, przewlekłych powikłanń cukrzycy i w konsekwencji chorób S-N ( mikroangiopatiaL nefropatia, neuropatia, retinopatia)

• Oznaczanie HbA1C powinno być wykonywane rutynowo co 3 imesiące u wszystkich pacjentó chorych na cukrzycę w celu kontroli wyrównania metabolicznego

lipoproteiny

• LDL apo B

• HDL apo A

Lipidogram

• Cholesterol 140-200mg/dl

• HDL

• M 40-60

• K 50-75

• LDL < 130mg/dl

• TG

• M 60-170

• L 40-140

MAłę gęste LDL to

• LDL zawierające 2x więcej apoB ( 1,6g/l)

• Występują u ludzi:

• Z hipertriglicerydemią

• Łatwiej przenikają przez ścianę tętnicy

• Większa podatność na oksydację i glikację

• Apo B nie koreluje ze stężeniem TG

HDL-C

• Koreluje z niskim ryzykiem rozwoju miażdżycy i jej konsekwencji

• Działąnie p/zpaplne

• Antyapoptotyczne

• Poprawa funkcji śródbłonka i działanie wazodilatacyjne

• Działanie p/zakrzepowe i fibrynolityczne

• Działanie antyoksydacyjne

Kwartet śmierci prowadzący do IHD

• Cukrzyca

• HA

• Otyłość

• BMI=masa w kg/ wzrost w m^2

• Nadwaga25-30 kg/m2 33%

• Norma <25kg/m2 48%

• Otyłość 19%

• dyslipidemie

Zespół metaboliczny

• Kryteria rozpoznania wg APTIII.APT IV (3 lub więcej nieprawidłowości)

HDL	<40 M <50 K
TG	>=150
Obwód talii BMI	M > 102cm K>88cm
Ciśnienie	>130/85
Gliekemia na czczo	>100 (110-125)

Funkcje śródbłonka naczyniowego

• Przepuszczalność

• Angiogeneza

• Transport lipidów

• Aterogeneza

• Odpowiedź immunologiczna

• Aktywność metaboliczna

• Zapalenie

• Wzrost nowotworu

• Hemostaza

• Napięcie ściany naczyniowej

Otyłość brzuszna

• Hipertriglicerydemia

• Niski HDL-C

• Wzrost apoB

• Małe gęste LDL

• Profil zapalny

• Hiperinsulinomia

• Nietolerancja glukozy

• Insulino oporność

• Zaburzenie fibrynolizy

• Dysfunkcja śródbłonka

• Prowadzą do cukrzycy typu 2, HA i chorób S-N

Jak podnieść stężenie HDL C

• Obniżenie masy ciała wzrost wysiłku

• Rzucić palenie

• Statyny

• Fibra ty

• Niacyna + statyny

• Estrogenowa terapia zastępcza

• Aktywacja genów ABCA1 i ABCG1, Apo-A1, LCAT

Markery zagrożenia zawałem

• Palenie

• Cukrzyca

• HA

• Otyłość brzuszna

• Czynniki psychologiczne

• Apo Bi apoA1

Ryzyko zawału obniżają

• Owoce/warzywa antyoksydanty < kakao, herbata, wino, kawa

• Aktywność fizyczna

• Alkohol 30mg czystego alkoholu dziennie

Miażdżyca

• To postępująca choroba o podłożu zapalnym, rozwijająca się przez wiele lat

• Proces ten odgrywa istotną rolę w pęknięciu blaszki miażdżycowej

• Biomarkery zapalenia próbuje się wykorzystać dla przewidywania ryzyka chorób sercowo- naczyniowych

• Udowodniono, że niektóre biomarkery zapalne są lepszymi predykatorami ryzyka niż tradycyjne, głóNe czynniki ryzyka chorób S-N

Czynniki ryzyka miażdżycy naczyń:

• klasyczne → przyspieszają proces

• cukrzyca

• HA

• tytoń

• dyslipidemia (  CHc,  LDL,  TG,  HDL)

• dieta wysokotłuszczowa

• otyłość

• przerost LK ♡

• brak aktywności fizycznej

• nowe

• przewlekły proces zapalny

• zakażenia miejscowe w tętnicach ( zęby, dziąsła, oskrzela) i ogólne wywołane przez:

• Ch. pneumoniae

• H. pylori

• Mycoplasma pneumoniae

• Herpes simplex

• CMV

• Fibrynogen >= 350mg/dl

• Homocysteina>=12umol/l ( jej    kw. foliowego,  B₆ i B₁₂)

• Lipo proteina a >/30mg/dl

• Apolipoproteina B >=140mg/dl

• Apolipoproteina A1 <120mg/dl

• VCAM i ICAM

• Angiotensyna II

• Wzrost oxy LDL

• Białka sozku termicznego HSP bakterii i gospodarza

• angiotensyna II

• jako czynnik efektorowy układu RAA związanego z regulacją ciśnienia

• jako czynnik prozakrzepowy przez  aktywności tkankowego aktywatora plazminogenu PAI-1

• jako  aktywności oksydazy NADPH

• czynniki genetyczne → gł. pierwotne dysfunkcje śródbłonka

Otyłość → bezpośrednia i główna przyczyna to dodatni bilans energetyczny, a nie czynniki wewnętrzne ( genetyczne, metaboliczne, regulacyjne, degeneracyjne).

CH N: do 200 mg/dl ( 5,2 - 5,6 mmol/l )

 CH do > 6,7 mmol/l →  ryzyka zawału 2-3 x






























Jeden z głównych czynników miażdżycy to proces zapalny.

Komórka zapalna sterowana przez cytokiny → blaszka miażdżycowa → miażdżyca

Są leki, które hamują działanie prozapalne komórek zapalenia ( statyny i aspiryna, fibraty, antybiotyki).

Finałem zapalenia komórki jest  CRP i innych markerów ( SAA i Il-6). Nie wiadomo czy są zwiastunami ryzyka, czy odgrywają istotną rolę w patofizjologii miażdżycy.

Miażdżyca naczyń:

• ch. niedokrwienna serca

• ostre zespoły wieńcowe

• zawał serca

• dławica stabilna

• dławica niestabilna

• śmierć sercowa

• ch. naczyń obwodowych ( chromanie przestankowe)

• udary mózgu




Laboratoryjne wskaźniki stanu zapalnego

• Fibrynogen, CRP, SAA

• Cytokiny Il1b, 6, 8, 10, TNF

• WBC

CRP związane z lokalnym procesem zaplanym - pierwotna przyczyna pękania blaszki miażdżycowej

Laboratoryjne czynniki ryzyka:

• Glu → cukrzyca

• CH → odkładany przyściennie

• TG → odkładany przyściennie

• b.o.f. - CRP, SAA, fibrynogen

• homocysteina

• dyslipidemia (  CH,  LDL,  TG,  HDL)

• zakażenia miejscowe / uogólnione w tętnicach

CRP we krwi zdrowego człowieka:

• szybkość tworzenia CRP w wątrobie 2,4 mg/24 h ( norma 0,6 mg/l)

• T_1/2 CRP = 19 h

• stężenie u 95% populacji niemieckiej mieści się w granicach 0,2 - 8,0 mg/l , śr. 1,6 mg/l

• stężenie uznawane jako niezagrażające ocenia się w granicach do 2,5 - 3 mg/l

 CRP   ryzyko wystąpienia ostrych zespołów wieńcowych.

Propozycje algorytmu w ocenie ryzyka ostrych zespołów sercowo-naczyniowych i naczyniowo-mózgowych:

1. oznaczyć stosunek CHc / HDL-CH

2. oznaczyć kwartyl (?) hs-CRP

3. określić względne ryzyko

Zasady wykonywania oznaczeń hsCRP

1. oznaczanie 2x w odstępie 2 tygodni

2. wynik należy uśrednić i wyrazić w mg/l

3. krew pobierać niekoniecznie na czczo w czsie pełnej stabilności metabolicznej

4. jeśli oznaczenie > 10mg/l, badanie powinno być powtórzone

5. względne ryzyko

• niskie <1mg/l

• średnie 1-3mg/l

• wysokie >3mg/l

• CRP ( zwykle > 3 mg/l) przy wysokim stęż. CHc ( zwykle > 300 mg/dl) ułatwia decyzję wprowadzenia do leczenia leków z grupy statyn ( inhibitorów HMG-CoA - reduktazy)

Zastosowanie kliniczne ultraczułego CRP:

1. oznaczanie CRP w surowicy zdrowych ma właściwości predykcyjne w czasie do 5 lat i więcej dla przewidywania OZW

2. szczególnie to ważne dla dławicy niestabilnej i zawału m. serca bez załamka Q

3. największa predykcja CRP jest dla zawału m. serca u ludzi zdrowych bez wcześniejszych objawów ch. wieńcowej

4. CRP jest wskaźnikiem niezależnym od innych czynników ryzyka miażdżycy ( np. CH)

5. w połączeniu z równoczesnym oznaczaniem stężenia CHc i HDL-CH wartość przewidywana CRP 

6. w dławicy piersiowej poprawia wartość predykcyjną troponin

Kto powinien być badany i kiedy

• Na dławicę peiwsiową w dowolnym czasie

• Na dławicę niestabilną przy przyjęciu do szpitala

• Z zwałaem 3 tygodnie po zawale

• Poddani PTCS bezpośrednio przed zabiegiem

Właściwości statyn

• Hipolipemizujące

• Obniżające CRP

• Zwiększające aktywność antyoksydacyjną i NO

• Hamowanie trombogenezy

• Hamowanie proliferacji mm. gładkich

Markery predykcyjne OZW

1. Markery destabilizacji blaszki miażdżycowej

1. ICAM, VACAM

2. Lp-PLA1 - fosfolipaza A2 związana z liporpteinami

3. MPO mieloperoksydaza

4. MMP9

2. Markery pęknięcia blaszki miażdżycwoej

1. PaPPA związana z ciązą osoczowe białko typu A

2. SCD40L rozpuszczalna forma ligandu CD40

3. PLGF łożyskowy czynniki wzrostu

Profilaktyka chorób sercowo -naczyniowych u:

M >55rż, K>65rż

Palenie

Dodatni wywiad rodzinny w kierunku

Choroby sercowo nacyzniowe i przewlekła choroba nerek charakteryzuje się tymi samymi czynnikami ryzyka przewlekły proces zapalny !!

DIAGNOSTYKA LABORATORYJNA W STANACH ZAPALNYCH I UOGÓLNIONYCH INFEKCJACH - wykład 4

Zapalenie- zeppół zjawisk patologicznych w ustroju obejmujący odczyny miejscowe, odczyn węzłów chłonnych i odczyny ogólnoustrjowe

Zakażenie - wniknięcie do ustroju i rozwój biologicznego czynnika

Proces zapalny - przyczyna chorób o charakterze przewlekłym, np. przez wiele lat → choroby nowotworowe ( płuc, piersi, szyjki macicy, prostaty, jelita grubego, skóry ), miażdżyca naczyń wieńcowych ( zawały, udary ), choroba Alzheimera, choroba Crohna i in.

Ostra odpowiedź zapalna AIR

• Mechanizm wstępnej obrony zapoczątkowujący procesy naprawcze

• Rozprzestrzenia się po ustroju drogą dyfuzji - tkankowo nieswoisty

• Aktywacja odpowiedzi w AIR jest nieswoista w stosunku do czynnika wywołującego

Zespół układowej odpowiedzi zapalnej SIRS,

Zespół uszkodzenia wielonarządowego MODS/ MOF

• Patologiczny stan AIR

• W SIRS występuje paradoksalne zjawisko: stan zapalny o wielkim nasielniu



















uszkodzenie tkanek







makrofag cytokiny:


Il-6, Il-1, TNF, (INF, INFγ

Synteza w 3 okresach:

• wzrasta aktywność komórek wątrobowych wskazująca zmiany przepuszczalności błon komórkowych ( 2-5 h po urazie)

•  syntezy wstępnych form b.o.f. ( 8 h po urazie)

•  syntezy z tworzeniem ostatecznych postaci b.o.f. i wydzielaniem do krwi ( 18-24 h od urazu)

hamowanie proteinaz	AMG, AAT, AAC
krzepnięcie i fibrynoliza	AAP,AAG,CRP
usuwanie obcych ciał

Podział białek ostrej fazy w oparciu o dynamikę stężenia w reakcji ostrej fazy:

1. bardzo silne ( spektakularne) → stęż.  20-100 x i więcej ( nawet do 500 x)

1. białko C-reaktywne ( CRP)

2. białko amyloidowe A ( SAA)

2. silne → stęż.  2-5 x

1. ₁-kwaśna glikoproteina ( AAG)

2. ₁-antytrypsyna ( AAT)

3. ₂-haptoglobina ) HPT)

4. ₂-antychymotrypsyna

5. fibrynogen ( FBG)

3. słabe → stęż.  2x

1. ₂-ceruloplazmina (CER)

2. skł. C₃ i C₄ dopełniacza

3. 2-antyplazmina

4. obojętne → ich stęż.  kilka-kilkadziesiąt %, ale  jest słabo widoczny w I okresie reakcji

1. ₂-makroglobulina ( AMG)

2. białko amyloidowe P

3. Ig

5. ujemne(?) → w początkowym okresie reakcji ich stężenie  o kilka-kilkanaście %

1. albuminy ( ALB)

2. transferyna

3. ₁-lipoproteina

Białka ostrej fazy z wyjątkiem albuminy i CRO=P należa do glikoprotein

Okres T1/2 wynosi 2-4 dni, oprócz CRP = 19h

Wzrost stężenie różnych białek nie przebiega równolegle

Mukoproteiny →  świadczy o reakcji ostrej fazy ( konglomerat białek ostrej fazy)

Cel reakcji ostrej fazy → procesy naprawcze i odtwórcze organizmu; np. CRP → krzepnięcie i fibrynoliza

Diagnostyka laboratoryjna uogólnionych stanów zapalnych:

• badania hematologiczne

• odczyn opadania krwinek czerwonych ( OB = ESR → erytrocyte sedimentation rate)

• OB norma ♀ 12 mm/h ale do 20

♂ 8 mm/h

• morfologia

• liczba krwinek białych Leukocyty norma do 10 000/ml

• wzór odsetkowy

• uogólniony proces zapalny bez infekcji lub z infekcją bakteryjną  neutrofilów ( dlatego cała leukocytoza )

• infekcja wirusowa   limfocytów ( 80% i więcej; cała leukocytoza )

• przesunięcie w lewo

• badania biochemiczne

• elastaza

• cytokiny prozapalne

• Il-6, Il-1, Il-8

• TNF

• INF

• białka ostrej fazy

• CRP

• SAA, AAT, HPT

• wskaźniki specyficzne

• RF

• enzymy w OZT

• Selektyny E, L, P

• Czynniki krzepnięcia - D-dimery stany zakrzepowe obustronne, endogenne aktywowane białko C

Zalety oznaczania CRP w surowicy:

• duży ↑ stęż. CRP w stosunku do stęż. Fizjologicznego łatwy do wykrycia

• nieznaczny ↑ lub brak ↑ stęż. CRP w infekcjach wirusowych różnicowanie z SIRS i infekcjami bakteryjnymi, gdzie  CRP

• szybka odpowiedź organizmu na bodziec zastosowanie do wstępnej diagnostyki

• normalizacja stężeń CRP w korelacji z cofaniem się infekcji bakteryjnej zastosowanie w ocenie skuteczności prowadzonej antybiotykoterapii

• łatwe i szybkie oznaczenia, możliwość porównania wyników oznaczeń uzyskanych różnymi metodami

• wysokie stężenie w zakażeniu bakteryjnym o 100x, a w zakażeniu wirusowym 15-20x

Interpretacja wyników CRP w surowicy:

• 0-6 (8,10) mg/l norma

• 10-20 mg/l wynik wątpliwy

• 21-99 mg/l proces bakteryjny ( bakteriemia)

• > 100 mg/l masywny proces bakteryjny ( posocznica)

Zastosowanie kliniczne pomiarów CRP w surowicy:

1. wstępna diagnostyka infekcji bakteryjnej (  )

2. diagnostyka różnicowa ostrych infekcji bakteryjnych (  ) i wirusowych (  )

3. monitorowanie leczenia p-zapalnego, np. sterydami (  )

4. monitorowanie leczenia p-bakteryjnego

5. wczesne wykrycie powikłań u chorych w okresie pooperacyjnym (  CRP i w ciągu kilku dni  , jeśli nie - to infekcja)

6. ocena odpowiedzi ustroju po przeszczepach (  CRP w przeszczepach z niepowodzeniem)

7. ocena wznowy i przerzutów chorób nowotworowych  gwałtowny  CRP → wznowa / przerzut do innego narządu

8. monitorowanie leczenia nowotworów ( np. przed operacją  CRP, a  po operacji)

9. różnicowanie zawału mięśnia ♡ od ataku dławicy piersiowej (  CRP w zawale)

10. rokowanie ciężkości choroby

Ogólnoustrojowy proces zapalny a posocznica

1. SIRS  zespół ogólnoustrojowej odpowiedzi zapalnej - objawy nieswoiste, co najmniej 2 z poniższych

Etiologia nieinfekcyjna!

Min. 2 kryteria z 4 muszą być spełnione:

1. T > 38°C / hipotermia < 36°C

2. tachykardia > 90/min

3. tachypnoe > 20/min / hiperwentylacja z  pCO₂ < 32 mmHg

4. leukocytoza > 12 000/l lub < 4 000/l lub przesunięcie w lewo > 10% niedojrzałych neutrofili

2. SEPSA → objawy SIRS z etiologią infekcyjną

1. Sepsa - zespół określonych objawów chorobowych spowodowanych gwałtowną reakcją ustroju na zakażenie, mogący prowadzić do niewydolności wielu narządów, wstrząsu i śmierci śmiertelność <5%

2. ciężka posocznica = posocznica + destrukcja narządów śmiertelność 20%

• min 2 uszkodzenia narządów lub układów: sercowo-naczyniowy, nerki, oddechowy, wątroba, krwiotwórczy, CUN, kwasica metaboliczna

• hipotensja skurczowa < 90 mmHg

• upośledzenie przepływu krwi z objawami systemowymi ( kwasica mleczanowa, oliguria, obj. OUN )

• wstrząs septyczny = posocznica ( ciężka posocznica z hipotensją i upośledzeniem przepływu krwi) śmiertelność >50%

Posocznica:


infekcja

endotoksyny bakteryjne




stymulacja mediatorów stanu zapalnego




posocznica


( bez lub z uszkodzeniami wielonarządowymi)

wstrząs septyczny

( bez lub z uszkodzeniami wielonarządowymi)




wyzdrowienie / śmierć

hemostaza nie jest zrównoważona w ciężkiej sepsie przewaga krzepnięcia nad fibrynolizą !!

Sepsie towarzyszy hipoperfuzja, spadek ciśnienia i dysfunkcja narządów !!

Rola cytokin w diagnostyce laboratoryjnej

• produkowane na skutek aktywności układu immunologicznego

• najważniejsze funkcje to ...........................................................................................................................

• do celów diagnostycznych wykorzystuje się stężenie cytokin, których zmiany stężenia w osoczu dają możliwość nasilenia uogólnionych stanów zapalnych i chorób związanych z układem immunologicznym

• szybko pojawiają się i bardzo szybko znikają

• zaliczamy do nich:

• Il-2, Il-6, Il-8, Il-1, Il-12

• czynnik martwicy guza TNF

• INF, INFγ

• działają bezpośrednio uszkadzająco na funkcje danego organizmu pośrednio przez NO, TX, leukotrieny, PAF, PG, dopełniacz

Zastosowanie:

• diagnozowanie i monitorowanie przebiegu OZT, ostrych stanów zapalnych w jamie brzusznej, urazów wielonarządowych,

• diagnozowanie i monitorowanie przebiegu ostrych infekcji bakteryjnych, bakteriemii, posocznicy

• rokowanie po ciężkich operacjach, posocznicy








 

Posocznica = infekcje + ogólnoustrojowy proces zapalny

• najczęstsza przyczyna pobytu na OIOM-ach

• w ciągu 20 lat leczenie ciężkiej posocznicy  x 2 ( starzenie społeczeństw, odporność na antybiotyki, inwazyjne leczenie)

• w ciągu roku na posocznicę umiera na świecie 750 000 osób

• w Polsce odsetek zachorowalności na posocznicę należy do najmniejszych na świecie ( 1-2%)

SIRS a posocznica:

Śmiertelność wzrasta ze  ciężkości choroby:

7% u pacjentów z SIRS

16% u pacjentów z posocznicą

20% z ciężką posocznicą

46% ze wstrząsem septycznym

Diagnostyka posocznicy:

• biochemiczne parametry laboratoryjne

• endotoksyny bakteryjne LPS, LBP, IL-6

• prokalcytonina

• CRP, SAAm AAG, HPT

• IL-6, 1, TNFa

• suPARm proANP

• Cytokiny

• Spadek biała C

• Wzrost D-dimerów

• parametry hemodynamiczne

• wzrost PT, APTT

• WBC, ESR

• BP

• stan naczyń

• systemy „score”

• APACHE

• Multiple Organ

• Failure-score

APACHE → system oceny stanu i rokowania pacjenta; składa się z parametrów biochemicznych i fizjologicznych, które są punktowane ( jest ich 24)

1. wcześniejsze wykrycie posocznicy → efektywniejsze leczenie

2. ognisko infekcji winno być wykryte jak najwcześniej w celu szybkiego jego usunięcia (antybiotykoterapia, leczenie chirurgiczne)

3. rozwój powinien być monitorowany ze względu na dużą śmiertelność

4. przebieg posocznicy z odp. ogólnoustrojową zapalną

5. 3 elementy oceniane

• wiek chorego

• choroby przewlekłe

• ocena parametrów fizjologicznych pO2, pH krwi, HCO3,K+,Na+

PROKALCYTONINA

• Promotorem syntezy jest gen calc-1 - miejsce dla NKkB ( kom miąższowe wątroby, płuc, adipocytów)

• Powstaje z komórek neuroendokrynnych jelit i płuc;

• jest proteolizowana w komórkach C tarczycy ( przekształcana do kalcytoniny i katakalcyny)

• Pro kalcytonina = kalcytonina 32AA + katakalcyna 21AA

• 116 aminokwasów - zapalna 114AA

• Steżenie kalcytoniny nie rośnie po rozpadzie pro kalcytoniny !!

Jej stężenie rośnie TYLKO w infekcjach bakteryjnych !!

- Marker infekcji bakteryjnych !!

PCT w przeciwieństwie do CRP jest dobrym markerem rokowania w sepsie !!

N: <20 ng/ml

Np. zap. bakteryjne / wirusowe opon m-r:

bakteryjne  PCT 57,9

wirusowe  PCT 0,33

• Odrzucenie przeszczepu (  PCT), a gdy dołączy się infekcja bakteryjna ,to  PCT

• PCT w normie w urazie wielonarządowym bez objawów klinicznych infekcji, a CRP wtedy 

• ARDS o etiologii nieinfekcyjnej   Il-6 i CRP, PCT norma ( bo nie ma infekcji)

Zastosowanie PCT:

• wczesna diagnostyka ciężkich infekcji bakteryjnych i posocznicy

• monitorowanie przebiegu choroby i terapii

• prognozowanie przebiegu posocznicy

• diagnostyka różnicowa etiologii choroby

Zastosowanie kliniczne pomiaru PCT:

1. diagnostyka różnicowa ostrej infekcji bakteryjnej i wirusowej

2. monitorowanie leczenia posocznicy i bakteryjnych infekcji układowych

3. diagnostyka różnicowa ch. zapalnych i stanów krytycznych ( diagnostyka infekcji)

4. rokowanie i kontrola leczenia posocznicy, wstrząsu septycznego i MODS ( Multiple Organ Dysfunction Syndrome)

5. diagnozowanie przebytych infekcji grzybiczych i pasożytniczych

BIOLOGIA MOLEKULARNA W DIAGNOSTYCE - wykład 4

białka + specyficzne znakowane przeciwciała  detekcja

kwasy nukleinowe + sondy  detekcja

Cechy markera:

• trwałe wiązanie

• łatwe wykrywanie

• specyficzne wiązanie

• generowanie sygnału zależnego od stężenia

Enzymy markerowe:

• dla białek

• fosfataza alkaliczna

• peroksydaza chromowa

• -galaktozydaza

• znakowany J¹²⁵

• dla kwasów nukleinowych

• włączanie biotyny i digoksygeniny

• włączanie markerów przy końcu 3' i 5'

• stosowanie starterów

Przeciwciała:

• poliklonalne

• rozpoznaje kilka epitopów antygenu

• silne wiązanie

• silny sygnał

• wysoka czułość

• niska specyficzność

• monoklonalne

• jeden epitop antygenu

• słabszy sygnał

• niższa czułość

• wysoka specyficzność

Metody diagnostyczne:

1. analiza białek

• immunoblotting

• ELISA

przeciwciała monoklonalne wyłapują antygen; wyłapane cząsteczki antygenu są uwidoczniane przeciwciałami poliklonaklnymi ( zawierają marker ); w celu zwiększenia czułości → inny wariant: do unieruchomionych przeciwciał dodajemy TXB₂ ( tromboksan B₂ ) i przeciwciała wiążące ten TXB₂; TXB₂ jest znakowany z dwóch stron; egzogennie dodajemy przeciwciała, które rywalizują o antygen z TXB₂

• RIA ( metoda radioimmunoenzymatyczna )

• falloidyna wiążąca się z formą polimeryczną aktyny

im więcej spolimeryzowanej aktyny w płytkach, tym bardziej są one reaktywne; markerem tej formy aktyny jest falloidyna znakowana przez FITC

2. analiza kwasów nukleinowych

• PCR

• PCR-ELISA ( southern blotting )

DNA znakowany digitoksyną

• rt-PCR-ELISA

• mRNA-cDNA ( northern blotting )

Końcowa liczba kopi PCR = początkowa liczba kopi x 2ⁿ; n=liczba cykli.

Reakcja PCR zachodzi w termocyklerze.

Wykorzystanie PCR i rt-PCR:

• wykrycie obcych DNA przy zakażeniach

• wykrycie mutacji genów i translokacji chromosomów

• monitorowanie polimorfizmów

• badanie identyfikacji osobniczej → medycyna sądowa

Modyfikacje PCR:

• gniazdowy PCR ( nested PCR )

kilka różnych starterów dodawanych po kolei; startery są swoiste , komplementarne do coraz bliższych fragmaentów poszukiwanego genu

• multipleks PCR

wiele różnych par starterów dla różnych fragmentów genomu

• reakcja łańcuchowej ligazy - LCR

ligaza, a nie polimeraza; ligaza ma zdolność do łączenia większych fragmentów DNA

• SSCP ( single strended conformatine polymorphism ) PCR

• PCR heterodupleksów

różni się tym od SSCP, że nie ma denaturacji, ale natywne fragmenty tworzą heterodupleksy / homodupleksy

Mutacja punktowa warunkuje powstanie unikalnej sekwencji oraz pojawienie się / zanik miejsca restrykcyjnego.

Badanie mutacji punktowych:

• RFLP PCR ( restriction fragment lenghth polymorphism )

• ASO PCR ( acide specific oligonukleotides )

Identyfikację zmutowanych genów odpowiedzialnych za zmiany fenotypowe ułatwiają analizy sprzężeń; ma to sens, gdy:

• znamy mechanizm indukowania choroby przez uszkodzenie genu

• istnieje wysoka korelacja między wykrywanymi uszkodzeniami genu, a objawami chorobowymi

Diagnostyka genetyczna:

• zaburzenie / choroby jednogenowe - najwięcej

• niektóre wielogenowe / wieloczynnikowe

• aberracje chromosomowe

• zaburzenia komórek somatycznych

Choroby jednogenowe:

• ok 1,5% noworodków

• 10% zgonów w okresie okołoporodowym

• ok 7000 chorób

Autosomalne dominujące:

• wielotorbielowatość nerek

• pląsawica Huntingtona

• hipercholesterolemia

Autosomalne recesywne:

• fenyloketonuria

• dysleksja

• otyłość

• schizofrenia

Sprzężone z płcią:

• hemofilia

Choroby wielogenowe:

• nowotwory

• osteoporoza

• choroba Alzheimera

• schizofrenia

• dysleksja

• alkoholizm

Molekularna diagnostyka onkologiczna na podstawie markerow nowotworów:

• specyficzny antygen transformacji błon komórkowych

• zmienione receptory błonowe dla hormonów, czynników wzrostu oraz innych ligandów

• badanie zmian w komórkach nowotworowych

• badanie klonalności genów

• badanie przesiewowe grup ryzyka

• monitorowanie terapii

Cytogenetyka:

• cytogenetyka interfazalna - aberracje chromosomowe

przewlekła białaczka szpikowa CML

ostra białaczka limfoblastyczna ALL

chłoniak Burkitta

• metoda FISH

in situ → w danej komórce → dajemy sondy tworzące hybrydy z danymi sekwencjami, które świecą po przyłączeniu sondy

W onkologii pomocne jest wykrycie unikalnych sekwencji genów nowotworów → polimorfizm mikro- i makrosatelitarny.

Typowanie układów antygenowych płytek ( HPA ) - to układ analogiczny do HLA, ale na płytkach:

• receptor dla fibrynogenu HPA-1 ( częstsze poronienia u kobiet )

• polomorfizm glikoproteiny ( HPA-1a/HPA-1b )

• polimorfizm HPA-2

Dziedziczne czynniki ryzyka choroby zakrzepowej:

czynnik	częstość
niedobór AT III	1-5%
niedobór białka C	6-9%
niedobór białka S	3-13%
mutacja G/A genu protrombiny	ok. 5%
mutacje Leiden czynnika V ( APC-R )	>20%

• Czynnik V jest kluczowym dla generacji trombiny ( im więcej czynnika V tym więcej trombiny, co nie jest korzystne ).

• Białko C trawi czynnik V w formie dzikiej???

• Mutacja Leiden czynnika V ( Arg - Glu ) → białko C nie trawi tej formy białka →  ilości czynnika →  trombiny   zakrzepicy

Mutacja ta wiąże się z tendencją do zakrzepic w warunkach środowiskowych:

• zabiegi chirurgiczne

• antykoncepcja doustna

• nieruchomy tryb życia

Fibrynogen → zbudowany z 3 łańcuchów; szybkość syntezy fibrynogenu warunkuje synteza łańcucha .

PROFILAKTYKA W DIAGNOSTYCE - wykład 6

Podstawowe oznaczenia u ludzi zdrowych przed 40 r.ż.

• badanie ogólne moczu

• morfologia krwi obwodowej

• badania biochemiczne → glukoza

Podstawowe oznaczenia u ludzi zdrowych po 40 r.ż.

• badanie ogólne moczu

• morfologia krwi obwodowej

• badania biochemiczne → glukoza, mocznik , kreatynina, białko całkowite, CHc, TG, ew. frakcje HDL i LDL

Po 30 r.ż. zmienia się metabolizm węglowodanowy i tendencja do „wchodzenia” w cukrzycę t. II insulinoniezależną → zmiana konformacji receptora insulinowego

Badania ogólne moczu:

• właściwości fizyko-chemiczne

• osad moczu

Badania wykonujemy na tzw. suchym pasku testowym z 12 polami, na których przebiegają reakcje.

20-30 mg/24 h  norma białka wydalanego z moczem; jest to za mało, by wykryć je analitycznie,

więc na wyniku białko w normie jest „-”

Krew + białko w moczu  stan zapalny

Leukocyty, nitraty, białko  bakteriuria

Morfologia:

• badania podstawowe

• RBC

• HGB

• HCT

• WBC

• skriningowe badania automatyczne ( 16-18 par)

• pełne badania automatyczne ( 18-30 par)

Odczyn granulocytarny → neutrocytoza z odmłodzeniem komórkowym w przebiegu infekcji

Badania poszerzone profilaktyczne( chory pod obserwacją):

• badania podstawowe +

• czynniki ryzyka miażdżycy

• stęż. ultraczuły CRP i ew. homocysteina

• pełny profil lipidowy ( CH, HDL, LDL, TG i Lp(a) )

• u ludzi z cukrzycą wyrównaną

• mikroalbuminuria

• hemoglobina glikowana

• ♂ po 50 r.ż.

• PSA i ew. wolny PSA

• krew utajona w kale

• w narażeniu zawodowym ( np. na czynniki chemiczne → próby wątrobowe)

Homocysteina ( HCY) → wskaźnik ch. sercowo-naczyniowych.

Powstaje z metioniny i do niej też się rozpada.

Wit. B₆ → katalizator rozpadu homocysteiny do cysteiny.

Kwas foliowy z wit. B₁₂ → przyspieszone rozpadanie homocysteiny do metioniny.

Enzymy:

• -syntaza cystationiny

• reduktaza metylenotetrahydroftolenu (?)

N: < 16 mmol/l


Przyczyny hiperhomocysteinemii:

• genetyczne niedobory enzymów przemiany homocysteiny

• nabyte niedobory kwasu foliowego i wit. B₆ i B₁₂

• wtórna → przebyte choroby: nwd nerek, nowotwory

• jatrogenne ( leki, używki, papierosy, nadmierne spożycie mięsa)

HCY

• ryzyko choroby wieńcowej, ch. naczyń obwodowych , mózgowych

• hiperhomocysteinemia to niezależny czynnik ryzyka porównywalny jak palenie papierosów i HA

• hiperhomocysteinemia to czynnik chorób zakrzepowo-zatorowych układu żylnego

Mechanizm działania:

• charakter aterogenny → przez aktywne rodniki tlenowe uszkadzające śródbłonek

• działanie trombogenne → interakcja HCY ze skł. ukł. hemostazy → zmiana p-krzepliwych właściwości śródbłonka → zakrzepy

Leczenie → wit. B₆, B₁₂, kw. foliowy

PSA → antygen swoisty prostaty

Łagodny przerost stercza → łagodny gruczolak stercza → rak stercza ( liczne guzki → naciekanie → rozrost)

Wraz ze starzeniem ♂ B poziom fizjologiczny PSA.

Prawdopodobieństwo raka rośnie ze  PSA




> 0,25 ( 25%)  rozpoznanie w kierunku gruczolaka

< 0,25 - 0,1  rak prostaty

zaleta → niskie koszty

P_D .

P_D + F_U

P_U - prawdziwie ujemne

P_D - prawdziwie dodatnie

F_U - fałszywie ujemne

F_D - fałszywie dodatnie

P_U .

P_U + F_D

P_D .

P_D + F_D

P_U .

P_U + F_D

P_D + F_U .

P_D + P_U + F_D + F_U

reakcje ostrej fazy

posocznica

SIRS:

• uraz

• oparzenie

• stany po operacji

• OZT

• inne

Infekcja

• bakteriemia

• wiremia

• fungemia

• parazytemia

• inne

WĄTROBA ( SYNTEZA)

• stężenia w osoczu pozytywnych białek ostrej fazy ( b.o.f.) CRP >70g/dobę !!
  SAA, FBG

• stężenia w osoczu negatywnych b.o.f.

• zmiany profilu glikozylacji b.o.f.

• ↓ preALB, ALB, TRSF

MEDIATORY

• cytokiny: Il-1→Il-6

• PG

• histamina

• serotonina

• kininy

kom. zapalna → makrofag → cytokiny → wątroba → prod. b.o.f.

monocyty,

makrofagi w stanie zapalnym ( płuca palaczy, płytka miażdżycowa, H. pylori)

tk. tłuszczowa ( otyłość)

wątroba

r. ostrej fazy:

 fibrynogenu

 CRP, SAA, AAT

 lepkość krwi

 elastazy, neutrofili

 HDL

Il-6 i inne mediatory st. zap. ( TNF, INF, Il-1)

 agregacja płytek

 LPL

 insulinooporność

śródbłonek ( zwężenie naczyń)

choroba sercowo-naczyniowa

cząsteczki adhezyjne

fPSA

tPSA

stres psychosocjalny

reakcja lokalna

• rozszerzenie i  przepuszczalności naczyń

• alergie płytek (?) i skrzep

• gromadzenie granulocytów i makrofagów

• uwalnianie proteaz i enzymów lizosomalnych

• stymulacja fibroblastów

• synteza mediatorów

reakcje systemowe

• gorączka, ból

• leukocytoza

•  wydzielania hormonów

• aktywacja dopełniacza i kaskady krzepnięcia

•  stęż. Fe i Zn w osoczu

• przeniesienie AA (?) z mięśni do wątroby

•  syntezy białek ostrej fazy

Czynniki wywołujące

• zapalenie

• oparzenia

• martwica tkanek

• odczyn zapalny

• zakażenie

• wzrost nowotworowy

13

---