Konspekt wykładu 7

Wzrost mikroorganizmów zależy nie tylko od dostępności odpowiednich pierwiastków biogennych, źródła energii, akceptora elektronów, ale także od odpowiednich dla tego organizmu warunków fizycznych, a w szczególności, temperatury, pH, dostępności wody, zasolenia. Każdy organizm jest zdolny do wzrostu w pewnym zakresie tych czynników środowiskowych.

Wpływ temperatury na wzrost

Każdy organizm może rosnąć i rozwijać się w pewnym zakresie temperatur, powyżej którego i poniżej którego nie może funkcjonować. Zakres ten jest ograniczony dwiema wartościami:

    - temperaturą minimalną, tzn. taką, poniżej której organizm nie jest zdolny do wzrostu;

    - temperaturą maksymalną, tzn. taką, powyżej której nie jest on zdolny do wzrostu.

Temperatura optymalna to temperatura, w której organizm rośnie najszybciej. Te trzy temperatury, zwane temperaturami kardynalnymi, są charakterystyczne dla danego typu mikroorganizmu, choć mogą się nieznacznie zmieniać, w zależności od innych czynników środowiska, a w szczególności od jego składu chemicznego.

W tabeli 1 zostały przedstawione maksymalne temperatury, w jakich mogą żyć różne grupy organizmów, zarówno eukariotycznych, jak i prokariotycznych. Jak widać, rekordzistami są tu mikroorganizmy prokariotyczne, a prym wiodą archeony. Ogólnie biorąc:

1) mikroorganizmy są zdolne do wzrostu w wyższych temperaturach niż makroorganizmy;

2) mikroorganizmy prokariotyczne niż eukariotyczne;

3) archeony niż bakterie.

Zakres temperatur, w jakim dany organizm może rosnąć, obejmuje zwykle około 30^oC.

- Na przykład E. coli ma temp. min. 8^oC, a maksymalną - 48^oC.

Niektóre mikroorganizmy mają jednak znacznie węższy zakres,

- np. Neisseria gonorrhoeae rośnie w zakresie od 30^oC do 38^oC (opt. 35-36^oC);

Podział organizmów na podstawie wartości temperatur optymalnych

Psychrofile charakteryzuje niski zakres temperatur optymalnych.

Mezofile mają optimum temperatury zlokalizowane między wartościami charakterystycznymi dla psychrofilów i termofilów.

Termofile rosną optymalnie w temperaturach przekraczających 45^oC, a hipertermofile przekraczajacych 80^oC.

Środowiska, w których panują warunki niedogodne do życia dla ludzi i większości makroorganizmów, a w których mogą żyć niektóre mikroorganizmy, w szczególności prokariotyczne, zwane są środowiskami ekstremalnymi, a organizmy, które tam żyją zwane są ekstremofilami. Do ekstremofilów zaliczamy psychrofile i termofile, a w szczególności hipertermofile.

Psychrofile - optimum temp. 15^oC lub mniej;- maksimum - poniżej 20^oC;- minimum - 0^oC lub mniej.

Psychrofile warunkowe (mikroorganizmami psychrotolerancyjnymi) rosną w temperaturach około 0^oC, ale są również zdolne do wzrostu w zakresie temperatur 20-40^oC.

1) są znacznie szerzej rozpowszechnione niż psychrofile;

2) można je wyizolować z gleby i wody w klimacie umiarkowanym, a także w produktach spożywczych przechowywanych w lodówce, takich jak, przetwory mleczne, mięso, warzywa czy owoce.

3) Rosną one najlepiej w temperaturach 20-40^oC, a ich wzrost w temp. około 0^oC jest wolny.

4) Niektóre z nich mogą w przechowywanym w nieodpowiedni sposób jedzeniu namnożyć się w takim stopniu, że stają się zagrożeniem dla zdrowia ludzi. Do takich bakterii należy np. Listeria monocytogenes, która wywołuje infekcje jelitowe zwane listeriozami (temp. min. - 1^oC; temp. opt. 30-37^oC; temp. maks. - 45^oC).

Przystosowania do niskich temperatur

1) enzymy mają w swojej strukturze drugorzędowej więcej struktur typu -helisy niż -kartki, która jest bardziej sztywna; daje im to większą plastyczność w niskich temperaturach.

2) enzymy mają więcej aminokwasów polarnych, a mniej hydrofobowych, co też im daje większą plastyczność, dzięki czemu mogą być aktywne w niskich temperaturach.

3) w lipidach błonowych większa zawartość nienasyconych kwasów tłuszczowych, co umożliwia utrzymanie stanu półpłynnego błony. nawet w niskich temperaturach.

Mezofile występują np. w ciałach zwierząt stałocieplnych, a także w glebie i wodach.

Escherichia coli, (podobnie jak jest typowym mezofilem. Optimum temperatury na podłożu bogatym to 39^oC, maksimum - 48^oC, a minimum - 8^oC. Na podłożu minimalnym wartości temp. maksymalnej i minimalnej mogą się nieco różnić, tzn. temp. maks. będzie nieco niższa, a temp. minimalna może być nieco wyższa. Mezofilami są wszystkie bakterie należące, wraz z E. coli, do rodziny Enterobacteriaceae, a także np. Bacillus subtilis.

Termofile i hipertermofile

Organizmy, które rosną optymalnie w temperaturze przekraczającej 45^oC nazywamy termofilami, a te których optimum temperatury przekracza 80^oC - hipertermofilami.

Hipertermofilami są różnego rodzaju archeony, w tym wszystkie, których nazwy zaczynają się przedrostkiem - Pyro-, np. Pyrococcus (np. Pyrococcus furiosus), Pyrolobus, Pyrobaculum. oraz bakterie i archeony mające w nazwie:

- Therm-, np. Thermus aquaticus, Bacillus stearothermophilus.

Termofile występować też mogą:

- w kompostach i kiszonkach (60-65^oC);

- w samozagrzewająch się hałdach górniczych;

-  w różnego rodzaju urządzeniach grzewczych (55-80^oC);

- w gorącej wodzie technologicznej

- w gorących źródłach na powierzchni Ziemi i na dnie oceanów.

Przystosowania do wysokich temperatur

1) Białka - skład aminokwasowy białek nie ma w sobie niczego niezwykłego. Zwiększona stabilność białek w wysokich temperaturach wynika ze sposobu ich zwinięcia (dzięki zwiększonej liczbie wiązań jonowych między różnymi aminokwasami i gęstemu upakowaniu hydrofobowego wnętrza białek. Obecność w cytoplazmie dużej ilości pewnych związków rozpuszczalnych, takich jak fosforan di-inozytolu, fosforan diglicerolu, które chronią białka przed denaturacją cieplną.

2) błony mają dużo nasyconych kwasów tłuszczowych, co umożliwia ich funkcjonowanie w wysokich temperaturach. U hiperterofilów (archeony) składają się z pojedynczej warstwy lipidowej (dibifitanylotetraetery) która jest znacznie bardziej odporna na denaturację termiczną.

3) DNA (różne mechanizmy u różnych archeonów):a)  Odwrotna gyraza wprowadza dodatnie superskręty, które czynią DNA opornym na denaturację cieplną („normalna” gyraza wprowadza superskręty ujemne); b) cykliczny 2,3-difosfoglicerynian potasu zapobiega zmianom chemicznym, np. depurynacji; c) specyficzne białka niskocząsteczkowe wiążą się z DNA, utrzymując jego strukturę dwuniciową.

pH

Każdy organizm rośnie w pewnym zakresie pH (zwykle obejmującym 2-3 jednostki) i można wyznaczyć jego pH optymalne. W większości środowisk naturalnych pH zawiera się między wartościami 5 a 9, więc najpowszechniej występują organizmy, które rosną w tym zakresie. Większość mikroorganizmów to neutrofile, żyjące w pH bliskim obojętnemu.

Acydofile - organizmy rosnące lepiej przy niskich wartościach pH. (pH 0-5,5). Grzyby jako grupa organizmów są bardziej kwasolubne niż bakterie. Wiele z nich rośnie optymalnie przy pH 5 lub nawet niższym. Niektóre bakterie i archeony też są acydofilami i to bezwzględnymi. Nie rosną w pH obojętnym. Do bezwzględnych acydofilów należą bakterie z rodzaju Acidithiobacillus, a także kilka rodzajów archeonów, np. Sulfolobus, Thermoplasma, Ferroplasma i Picrophilus. Występują one w kwaśnych źródłach, kwaśnych glebach i wodach kopalnianych.

Picrophilus oshimae

1) Najbardziej acydofilny prokariot (archeon), który jest też termofilem (temp. opt. 60^oC).

2) Rośnie on optymalnie w pH 0,6, a powyżej pH 4, jego komórki ulegają lizie.

3) pH wewnątrz komórek tego archeona wynosi 4,6.

4) Jego błona komórkowa jest nieprzepuszczalna dla kwasów.

5) Żyje on w skrajnie kwaśnych, gorących glebach, na terenach, gdzie występuje aktywność wulkaniczna.

Alkalofile

1) organizmy rosnące optymalnie w warunkach alkalicznych (8,5-11,5),

2) rosną słabo lub w ogóle nie rosnące w pH 7 lub niższym.

3) Do alkalofilów zaliczamy niektóre bakterie, np. z rodzaju Bacillus (B. alcalophilus) oraz archeony.

4) Wiele z archeonów to ekstremalne alkalofile (optimum pH 10 lub więcej), występują w jeziorach sodowych.

5) Wiele alkalofilnych archeonów to jednocześnie halofile. Ich nazwy zaczynają się przedrostkiem Natron-, np. Natronococcus, Natronobacterium, itp.

6) pH we wnętrzu komórek skrajnych alkalofilów wynosi 9,5.

Wpływ ciśnienia osmotycznego na wzrost prokariotów

Dostępność wody dla organizmów nie tylko zależy od zawartości wody w środowisku (tzn. od tego jak bardzo wilgotne czy suche jest dane środowisko), ale także od stężenia związków, takich jak sole, cukry i inne, które są w tej wodzie rozpuszczone.

Woda dyfunduje od miejsc, gdzie jej stężenie jest większe, ku miejscom gdzie jej stężenie jest mniejsze, a większe jest stężenie związków rozpuszczonych. Proces ten nazywa się osmozą. Na ogół stężenie związków rozpuszczonych w cytoplazmie prokariotów jest większe niż w środowisku, więc to woda ma tendencję do wchodzenia do komórki, czemu przeciwdziałają różne mechanizmy. Jednak gdy komórka jest w środowisku hipertonicznym woda wypływa z komórki do środowiska. Większość mikroorganizmów nie może rosnąć w środowiskach hipertonicznych, charakteryzujących się dużym stężeniem soli bądź cukrów. Ten fakt wykorzystuje się przy przechowywaniu żywności, gdy soli się ją, suszy lub dodaje dużą ilość cukru.

Halofile - to organizmy, które wymagają do wzrostu pewnego stężenia NaCl, np. mikroorganizmy morskie, bowiem w wodzie morskiej stężenie NaCl wynosi 3% (plus małe ilości innych soli). Istnieje grupa ekstremalnych halofilów, które wymagają do wzrostu co najmniej 9% NaCl (1,5 M). Większość z nich wymaga do optymalnego wzrostu 12-23% (2-4 M), w zależności od gatunku. Ekstremalne halofile rosną nawet w nasyconym roztworze NaCl (32%, 5,5 M).

Ekstremalne halofile występują w słonych jeziorach (np. Morze Martwe), jeziorach sodowych, salinach (basenach służących do otrzymywania soli z wody morskiej), słonej glebie, w jedzeniu zawierającym duże stężenie soli, np. wędzonych rybach. Wiele ekstremalnych halofilów nosi w swojej nazwie przedrostek Halo-. Istnieją jednak również nieliczne bakterie halofilne zaczynające się od tego przedrostka, np. Haloanaerobium i Halobacteroides.

Jednym z halofilnych archeonów jest Halobacterium (np. w Morzu Martwym)

1) Typowy archeon halofilny, chemoorganoheterotrof, tlenowiec, wymagający do wzrostu dużego stężenia NaCl w podłożu.

4) Jonów sodu nie można zastąpić innymi jonami, gdyż ściana komórkowa tego archeona, zbudowana z glikoproteiny, jest stabilizowana jonami Na⁺. Jeśli jest ich zbyt mało. ściana ulega zniszczeniu i komórka lizuje.

5) We wnętrzu komórki Halobacterium występuje natomiast duże stężenie jonów K⁺ (4 do 7 M), które archeon pobiera aktywnie ze środowiska (compatible solute).

6) Enzymy, rybosomy i białka transportowe tego archeona wymagają do funkcjonowania dużego stężenia K⁺.

7) Podobnie jak niektóre inne ekstremalnie halofilne archeony potrafi on wykorzystywać energię świetlną do syntezy ATP, ale bez udziału chlorofilów. Nie jest więc to fotosynteza.

8) Zawiera w komórce czerwone i pomarańczowe karotenoidy (w szczególności bakterioruberyny) i fioletowy (ang. purple) retinal, którego synteza jest indukowana, niskim stężeniem tlenu, i który uczestniczy w metabolizmie energetycznym.

9) przy niskim stężeniu tlenu Halobacterium syntetyzuje błonowe białko bakteriorodopsynę, dzięki której powstaje siła protonomotoryczna.

Mikroorganizmy halotolerancyjne nie wymagają obecności NaCl do wzrostu, ale tolerują pewne jego stężenie w środowisku. Na przykład bakterie z rodzaju Staphylococcus (np. S. aureus) tolerują NaCl w stężeniu 7,5%, co stanowi ich adaptację do życia na skórze człowieka. Wykorzystuje się to przy ich selekcji ze środowiska.

Przystosowania do środowisk hiperosmotycznych

Aby mikroorganizmy halofilne mogły żyć środowiskach zawierających duże stężenie soli, muszą one zwiększyć stężenie związków rozpuszczonych w cytoplazmie. Związki te (ang. compatible solutes):

1) nie mogą być szkodliwe dla komórki;

2) są pobierane prze komórki ze środowiska, albo przez nie syntetyzowane

3) mają różną budowę chemiczną (typu aminokwasów, np. prolina; typu cukrów, np. sacharoza, trehaloza; typu alkoholi. np. glicerol, mannitol; lub inne, np. KCl.

Staphylococcus aureus, bakteria halotolerancyjna, wykorzystuje aminokwas prolinę jako compatible solute, zaś archeon Halobacterium - KCl.

Wpływ tlenu na wzrost prokariotów

Toksyczne pochodne tlenu

Tlen w stanie podstawowym jest tzw. tlenem trypletowym (³O₂). W wyniku działania światła pewne składniki komórki, takie jak chlorofile, bakteriochlorofile, cytochromy i flawiny, mogą zostać wzbudzone, a energię wzbudzenia mogą przekazać cząsteczce tlenu w stanie trypletowym. Przechodzi ona wtedy w formę singletową (¹O₂), która jest bardzo reaktywnym czynnikiem utleniającym, toksycznym dla żywych komórek. Mikroorganizmy fototroficzne i te, które narażone są na działanie światła (np. występujące w powietrzu) często zawierają karotenoidy, które przekształcają tlen singletowy w tlen trypletowy.

W czasie normalnych procesów oddechowych w wyniku redukcji tlenu mogą powstawać inne jego toksyczne pochodne:

1) Rodnik ponadtlenkowy (ang. superoxide radical) (ang. superoxide=ponadtlenek)

O₂ + e- → O₂-•

2) Nadtlenek wodoru (ang. hydrogen peroxide)

O₂-• + e- + 2H⁺ → H₂O₂

3) Rodnik hydroksylowy (ang. hydroxyl radical)

H₂O₂ + e- + H⁺ → H₂O + OH•

Rodnik ponadtenkowy (O₂-•) jest bardzo reaktywny i może spowodować zniszczenie lipidów i innych składników komórkowych. Jest on prawdopodobnie tworzony w małej ilości w czasie normalnych procesów oddechowych. Powstaje też w wyniku połączonego działania światła i barwników. Flawiny, flawoproteiny, chinony, białka żelazo-siarkowe przeprowadzają jedno-elektronową redukcję O₂ do O₂-.

Nadtlenek wodoru (H₂O₂) powstaje w czasie normalnych procesów oddechowych przez dwuelektronową redukcję O₂, co zwykle zachodzi przy udziale flawoprotein.

Rodnik hydroksylowy (OH•) jest najbardziej reaktywnym z tych toksycznych produktów. Jest najsilniejszym ze znanych czynników utleniających, zdolnym do zaatakowania każdej cząsteczki organicznej na terenie komórki. Ma on bardzo krótki czas trwania (1/10 000 s).

Mikroorganizmy mają różne enzymy, które inaktywują te toksyczne pochodne tlenu.

1) Dysmutaza ponadtlenkowa:

2O₂-• + 2H⁺ → O₂ + H₂O₂

2) Katalaza:

2H₂O₂ → O₂ + 2H₂O

3) Peroksydaza:

H₂O₂ + NADH + H⁺ → 2H₂O + NAD

Tlenowce i warunkowe tlenowce mają zarówno dysmutazę ponadtlenkową jak i katalazę. Są więc chronione przed toksycznymi pochodnymi tlenu. Niektóre beztlenowce aerotolerancyjne, mogą nie mieć katalazy, ale mają dysmutazę ponadtlenkową. Inne, np. bakterie mlekowe, choć nie mają dysmutazy ponadtlenkowej, to mogą przeprowadzać dysmutację ponadtlenków z udziałem bezbiałkowych kompleksów zawierających Mn²⁺. Wszystkie znane dysmutazy zawierają Mn²⁺ lub Fe²⁺, lub Cu⁺ i Zn²⁺ w miejscu aktywnym enzymu. Mikroaerofile też są pozbawione niektórych mechanizmów obronnych przed toksycznymi pochodnymi tlenu, skąd ich lepszy wzrost przy obniżonym ciśnieniu parcjalnym tlenu. Np. Campylobacter jejuni nie ma katalazy.

Do niedawna uważano, że przyczyną wrażliwości bezwzględnych beztlenowców na tlen jest brak enzymu typu dysmutazy ponadtlenkowej, który inaktywowałby rodnik ponadtlenkowy. Okazało się jednak, że niektóre bezwzględne beztlenowce, np. archeon Pyrococcus furiosus, wprawdzie nie mają dysmutazy ponadtlenkowej, ale mają reduktazę ponadtlenkową, która przeprowadza redukcję ponadtlenku do H₂O₂ bez wytwarzania tlenu. Potem enzym typu peroksydazy rozkłada H₂O₂.

1) Reduktaza ponadtlenkowa:

O₂^-  + 2H+ + cyt c_zred  H₂O₂ + cyt c_utl

2) Enzym typu peroksydazy:

H₂O₂ + RH₂  2H₂O + R

Przyczyny wrażliwości bezwzględnych beztlenowców na tlen są więc nadal nieznane.

Z powodu wrażliwości beztlenowców na tlen trzeba z nimi pracować i je hodować w specjalnych urządzeniach, zwanych anaerostatami, w których powietrze jest zastąpione mieszaniną odpowiednich gazów.

E. coli ma 3 różne dysmutazy ponadtlenkowe i 2 katalazy.

Tabela 1

Najwyższe temperatury, w jakich mogą żyć różne grupy organizmów

Grupa organizmów	Najwyższa temperatura wzrostu [^oC]
Zwierzęta      Ryby i inne kręgowce wodne      Owady      Skorupiaki	38 45-50 49-50
Rośliny      Rośliny naczyniowe      Mchy	45 50
Mikroorganizmy eukariotyczne      Protisty      Glony      Grzyby	56 55-60 60-62
Mikroorganizmy prokariotyczne      Bakteria        Sinice        Fototrofy anoksygenowe        Chemoorganotrofy i chemolitotoautotrofy      Archeony	70-74 70-73 95 121

Tabela 2 Podział prokariotów na podstawie temperatur kardynalnych

Grupa prokariotów	temperatury kardynalne [^oC]
	minimalna	optymalna	maksymalna
Psychrofile    Micrococcus cryophilus    Polaromonas vacuolata	-4 0	15 lub mniej 10 4	~20 24 13
Mezofile    Escherichia coli    Staphylococcus aureus	15-20 10 6	20-45 37 30-37	45 46
Termofile    Thermus aquaticus    Bacillus stearothermophilus	40 30	>45 70-72 60-65	79 75
Hipertermofile    Pyrococcus abyssi    Pyrolobus fumarii    „szczep 121”	55 lub więcej 67 90 85	>80 96 106 ?	?? 102 113 121

Tabela 3 Podział prokariotów na podstawie optimum pH

Grupa prokariotów	Zakres pH	Przykłady	Opt. pH
Acydofile	0-5,5	Bakterie:      Acidithiobacillus ferrooxidans Archeony:      Sulfolobus      Picrophilus oshimae	3 2-3 0,7
Neutrofile	5,5-8,0	Escherichia coli	7
Alkalofile	8,5-11	Bakterie:      Bacillus alcalophilus* Archeony:      Natronobacterium	? 9,5-10

*Bacillus alcalophilus rośnie w pH 10

Tabela 4

Grupa mikroorganizmów	Charakterystyka	Przykład	Pozycja taksono-miczna
halotolerancyjne	nie wymagają NaCl, ale tolerują pewne jego stężenie (np. S. aureus - 7.5 %)	Staphylococcus aureus	bakteria
halofile	wymagają NaCl w stężeniu co najmniej 1% (np. Vibrio fischeri 3%)	Vibrio fischeri	bakteria
ekstremalne halofile	wymagają soli w stężeniu 15-30% w zależności od gatunku	Halobacterium salinarum	archeon
osmofile	rosną w środowiskach z dużą ilością cukrów	Saccharomyces bailii	grzyb
kserofile	rosną w środowiskach bardzo suchych	Xeromyces bisporus	grzyb

Tabela 5. Ekstremalni rekordziści

Czynnik ekstremalny	Grupa	Gatunek prokariota	Domena	Siedlisko	Min.	Opt.	Maks.
temperatura - wysoka - niska	hipertermofile psychrofile	Pyrolobus fumarii „szczep 121” Polaromonas vacuolata	Archaea Archaea Bacteria	gorące ujścia hydrotermalne lód w morzach	90^oC 0^oC	106 ^oC 121 ^oC  4 ^oC	113 ^oC 113 ^oC 12 ^oC
pH - wysokie - niskie	alkalofile acydofile	Natronobacterium gregoryi* Picrophilus oshimae**	Archaea Archaea	jeziora sodowe kwaśne źródła	8,5 0	10 0,7	12 4
Ciśnienie	barofile	szczep MT41***	Bacteria	głębina oceaniczna	500 atm	700 atm	>1000 atm
Stężenie NaCl	halofile	Halobacterium salinarum	Archaea	saliny	15 %	25 %	32 %

* Natronobacterium gregoryi jest też halofilem (opt. stęż. NaCl - 20%).

** Picrophilus oshimae jest też termofilem (temp. opt. - 60^oC).

*** Szczep MT41 nie ma jeszcze oficjalnej nazwy; jest psychrofilem.

1

8

---