Trzmiel Tadeusz

Instytut Biochemii Technicznej

Politechnika Łódzka

BIODEGRADACJA I BIOTRANFORMACJA HALOGENOWYCH ZWIĄZKÓW ORGANICZNYCH

1. Wstęp

Fluorowcopochodne (inaczej halogenopochodne lub według starego nazewnictwa chlorowcopochodne), to związki organiczne, których cząsteczki zawierają atomy fluorowca (F, Cl, Br, I). Do najprostszych halogenopochodnych należą: haloalkany (np. chlorometan), haloalkeny (np. chloroeten, chlorek winylu), haloareny (np. chlorobenzen, chloronaftaleny). Bardziej złożoną budowę mają halogenopochodne związków zawierających jeszcze inną grupę funkcyjną, np. karboksylową - fluorowcokwasy (halokwasy), karbonylową - fluorowcoketony (haloketony). Fluorowcopochodne, w cząsteczkach, których wszystkie atomy wodoru zastąpiono atomami fluorowców noszą nazwę perfluorowcopochodnych (freony, halony). Halogenoopochodne są zwykle czynne chemicznie (oprócz fluoropochodnych, freonów) - atom fluorowca łatwo ulega podstawieniu, np. grupą hydroksylową (synteza alkoholi), cyjankową (nitryli), amoniakiem (amin), atomem metalu (związków metaloorganicznych), w wyniku eliminacji fluorowca powstają związki nienasycone. Halogenopochodne aromatyczne są mało reaktywne. Halogenopochodne bardzo rzadko występują w przyrodzie, do nielicznych należą np. tyroksyna, purpura tyryjska. Ich obecność w środowisku naturalnym jest spowodowana działalnością człowieka [1].

Halogenopochodne są stosowane jako rozpuszczalniki oraz półprodukty w wielu działach syntezy organicznej, np. takich tworzyw sztucznych jak tetrafluoroetylen czy chlorek winylu. Stanowią one prawdopodobnie najbardziej rozpowszechnioną klasę zanieczyszczeń środowiska [1,2,3]. Są wypuszczane do otoczenia w wyniku ich stosowania w rolnictwie (środki: chwastobójcze, owadobójcze, grzybobójcze) i przemyśle (środki chłodzące, rozpuszczalniki, półprodukty i degradacja produktów). Są one również generowane przez chlorowanie wody lub w kilku przypadkach, poprzez naturalne procesy biologiczne [1,4,5].

Chlorowane węglowodory stanowią bardzo ważną grupę insektycydów i akarycydów (środków roztoczobójczych), np. metoksychlor, heksachlorocykloheksan, kamfochlor [1].

Praktycznie wszystkie halogenopochodne mają działanie rakotwórcze, są szkodliwe zarówno dla organizmu ludzkiego jak i środowiska. Podstawniki halogenowe utrudniają proces biodegradacji, a produkty rozkładu niektórych ze związków są jeszcze bardziej toksyczne niż sam produkt wyjściowy (tak jest w przypadku DDT). Konieczna jest skuteczna kontrola tej klasy związków [4]. Ze względu na ich toksyczność, biokoncentrację i trwałość [6], kwestia ich biodegradacji jest często poruszana w debatach publicznych. Podjęto kroki ograniczające ich produkcję, czy wręcz ich wycofywanie (np. PCB mają być wycofane do 2020 roku).

3. Podstawowe dane o pochodnych halogenowych związków organicznych

Występowanie halogenowych związków organicznych w środowisku naturalnym często jest przypisywane działalności człowieka. Jednakże związki halogenowe niekoniecznie muszą być ksenobiotykami. Obecnie sklasyfikowano około 3000 tego rodzaju związków pochodzenia naturalnego. Mikroorganizmy, insekty, rośliny i wyższe zwierzęta potrafią syntetyzować związki halogenowe, ale głównie są to proste haloalkany produkowane przez organizmy morskie. Związki organiczne halogenowe alifatyczne i aromatyczne, zawierające J, Br, Cl, są produkowane przez morskie mikroalgi i bezkręgowce od wielu milionów lat, np. makroalgi morskie potrafią produkować TCE (trichloroetan) i 1,2-dibromoetan. Do abiotycznych źródeł prostych haloalkanów należą wyziewy wulkaniczne, minerały i meteoryty [6].

Tabela 1. Halogenowe lotne związki organiczne, tzw. VOCs (ang. volatile organic compounds) [7]

1,1,1,2-tetrachloroetan	bromoform	cis-1,2-dichloroethylene
1,1,1-trichloroetan	bromometan	heksachlorobutadien
1,1,2,2-tetrachloroetan	czterochlorek węgla	heksachlorocyklopentadien
1,1,2-trichloroetan	chlorodibromometan	1,2-dichloropropane
1,1-dichloroetan	chloroetan	heksachloroetan
1,1-dichloroetylen	chloroform	chlorek metylenu
1,2,2-trifluoroetan (freon 113)	chlorometan	pentachloroetan
1,2-dichloroetan	chloropropan	perchloroetylen
1,2-trans-dichloroetylen	Cis-1,3-dichloropropen	trichlorotrifluoroetan
1,3-cis-dichloro-1-propen	dibromochloropropan	monochlorobenzen
dibromometan	dichlorobromometan	tetrachloroetylen (perchloroetylen) (PCE)
1-chloro-2-propen	dichlorometan	trichloroetylen (TCE)
tetrachlorek acetylenu	dibromek etylenu	chlorek winylu
bromodichlorometan	fluorotrichlorometan (freon11)	trichlorek winylu

.

Halogenowe związki organiczne znajdują szerokie zastosowane w przemyśle jako:

• środki do dezynfekcji,

• pestycydy,

• rozpuszczalniki,

• silikony,

• środki barwiące,

• polimery takie jak PCV czy teflon,

• plastyfikatory.

Chlorowane węglowodory były dotąd używane w dużych ilościach i to właśnie one dominują w publikacjach na temat degradacji halogenopochodnych. Około 60% wszystkich produktów przemysłu chemicznego jest otrzymywanych na drodze z wykorzystaniem elektorolizy NaCl. Z grupy chlorowanych alifatów jedynie chlorowany metan (czterochlorek węgla, chloroform i dichlorometan) i etan (trichloroetan) lub eten (trichloroeten, tetrachloroeten, PER) są najczęściej używane. Ze względu na dobrą rozpuszczalność w tłuszczu i niepalność, są one często używane jako rozpuszczalniki i stosowane w przemyśle jako ilościowe środki odtłuszczające, środki do przenoszenia na gorąco oraz chemiczne półprodukty w procesie syntezy. Ich użycie stopniowo zaczęło się zmniejszać z obawy narażenia zdrowia publicznego, ale w dalszym ciągu są szeroko stosowane (np. w przemyśle metalurgicznym, w celu odtłuszczania i chemicznego czyszczenia ubrań). Sprawa chlorowanych węglowodorów jest kontrowersyjna i często poruszana w publicznych dyskusjach. Próbuje się znaleźć związki, które mogłyby je zastąpić.

Obok chlorowych związków, stosunkowo dość dobrze poznane są fluoropochodne, choć na ich temat jest zdecydowanie mniej publikacji. Wywierają one niszczący wpływ na warstwę ozonową, największy udział mają w jej niszczeniu freony oraz halony.

Pod względem chemicznym freony (CFC) są pochodnymi chlorowcowymi węglowodorów nasyconych. W cząsteczce zawierają atomy chloru i fluoru, niekiedy również bromu. Powstają przez działanie fluorowodorem na halogenopochodne metanu lub etanu w obecności katalizatora - pięciochlorku antymonu. Niższe freony charakteryzują się znaczną prężnością pary w niskich temperaturach i wysokim ciepłem parowania. Ze względu na dużą pojemność cieplną mają znaczny udział w zwiększaniu się efektu cieplarnianego. Nie mają zapachu lub posiadają zapach eteru. Są bezbarwne i nietoksyczne. Znalazły zastosowanie w produkcji urządzeń chłodzących i klimatyzacyjnych oraz (obecnie coraz rzadziej) w produkcji kosmetyków i dezodorantów. Najbardziej znanymi i najczęściej używanymi freonami są dichlorodifluorometan (CCl₂F₂), zwany freonem F-12 oraz dichlorotetrafluoroetan (C₂Cl2F₄), zwany freonem F-114. Obecnie oblicza się, że w atmosferze znajduje się ponad 20 mln ton freonów. Halony natomiast są pochodnymi fluorowcowymi metanu i etanu. Są gazami lub cieczami. Nie ulegają spalaniu. Stosowane są do produkcji gaśnic halonowych [8].

Związki halogenowe stanowią również dużą część zanieczyszczeń ropy naftowej, olejów mineralnych oraz produktów petrochemicznych.

Halogenowe pochodne związków organicznych można rozpatrywać w trzech grupach: pochodne alifatyczne, aromatyczne i alicykliczne. Z uwagi na niewielką ilość danych literaturowych na temat halogenowych pochodnych alicyklicznych, w niniejszej pracy magisterskiej, zostaną omówione jedynie dwie pierwsze grupy związków.

Halogenowe pochodne alifatyczne

Dla halogenowych pochodnych związków alifatycznych można podać kilka ogólnych zasad dotyczących ich biodegradacji:

• są one wolniej degradowane niż proste łańcuchy bez podstawników halogenowych;

• stopień degradacji C₃-C₁₂ chloroalkanów wzrasta w miarę wydłużania łańcucha;

• tlenowe warunki sprzyjają degradacji związków z mniejszą liczbą halogenowych podstawników;

• warunki beztlenowe ułatwiają degradację związków z dużą liczbą halogenowych podstawników.

W tabeli 2 podano wykaz kultur bakteryjnych, zdolnych do wykorzystywania alifatycznych związków halogenowych w warunkach tlenowych, jako substratów do ich wzrostu.

Tabela 2. Zestawienie kultur bakteryjnych, wykorzystujących alifatyczne związki halogenowe jako substraty do wzrostu [9]

Halometany
Chlorek metylu	Hyphomicrobium sp.
Dichlorometan	Methylobacterium spp., hyphomicrobium spp., Methylophilis sp. DM11, Pseudomonas sp. DM1, Methylorhabdus multivorans DM13
Haloalkany
1,2-dichloroetan	Xantobacter autotropicus, Ancylobacter aquaticus
1-chlorobutan	Rhodococcus erythropolis
1,6-dichloroheksan	Rhodococcus erythropolis
1-bromooctan	Pseudomonas sp. ES-1, ES-2
Haloeteny
Chlorek winylu	Mycobacterium aurum L1
Haloalkohole
2-chloroetanol	Pseudomonas sp., Pseudomonas putida
2,3-dichloro-1-propanol	Pseudomonas sp. OS-K-29
1,3-dichloro-2-propanol	Agrobacterium radiobacter AD1, Arthrobacter sp. AD2, Coryneform bacterial strain AD3, Corynebacterium sp. N-1074
Kwasy haloalkanowe
Kwas chlorooctowy	Pseudomonas sp.
Kwas dichlorooctowy	Pseudomonas sp.
Kwas 2,2-dichloropropanowy	Pseudomonas putida
Kwasy haloalkenowe
Kwas 3-chloroarylowy	Coryneform bacteria
3-chlorokrotonian	Alcaligenes sp. CC1

Halogenowe pochodne związków aromatycznych

Halogenowe związki aromatyczne są generalnie odporne na biodegradację, ponieważ podstawniki halogenowe w pierścieniach aromatycznych przeszkadzają w normalnej ich degradacji. Halogeny są większe i mniej elektroujemne w porównaniu z atomem wodoru. W rezultacie obecność podstawnika halogenowego w miejscu atomu wodoru ma szkodliwy wpływ na zdolność enzymów do katalizowania wymaganych reakcji w procesie degradacji.

Mikroorganizmy rozkładają halogenowe związki aromatyczne na dwa sposoby:

• podstawniki halogenowe są usuwane z pierścienia i dalej taki związek aromatyczny jest względnie łatwo degradowany;

• pierścień aromatyczny jest utleniany do związku alifatycznego zanim podstawnik halogenowy zostanie usunięty [4].

Specyficzne enzymy stosowane w degradacjii halogenowych związków aromatycznych to m.in.:

• 2,3-dioksygenaza toluenowa (EC 1.14.12.11) albo 1,2-dioksygenaza benzoesanowa (EC 1.13.99.2),

• 2,3-dioksygenaza bifenylowa (EC 1.14.12.18) (gen bpha z P. testosteroni);

• monooksygenaza salicylanowa (EC 1.14.13.1.) - może katalizować hydroksylowanie 2-jodo-, 2-bromo-, 2-chloro-2-nitro-, 2-aminofenolu do katecholu;

• monooksygenaza metanowa (MMO) (EC 1.14.13.25) katalizuje reakcje zachodzące z udziałem tlenu cząsteczkowego. Enzym ten może utleniać alkany, alkeny, cykliczne i aromatyczne związki, CO, amoniak, mono- i dichlorobifenyle. Są dwie odmiany MMO - jedna jest nazywana cząsteczkową MMO lub pMMO, druga jest nazywana rozpuszczalną MMO lub sMMO [5]. Jeżeli monoksygenaza jest sprzężona z cytochromem P-450, działa znacznie skuteczniej m.in. na długie łańcuchy C₁₆, łańcuchy boczne aromatycznych związków, rozgałęzione alkany.

• inne monooksygenazy - MMO, AMO, T-4MO, fenol- MO, propan-MO - zmniejszają specyficzność substratu i prowadzą później do chemicznego rozkładu powstałych epoksydów; jest to ważne w przypadku haloalkenów, w których podwójne wiązanie może ulec przekształceniu w epoksyd;

3.1. Oddziaływanie halogenowych pochodnych na środowisko

Należy szczególnie podkreślić szkodliwość związków halogenowych na organizm ludzki i zwierzęcy. Konieczna jest kontrola emisji tych związków do atmosfery, aby ograniczyć ich toksyczność. Przykładem takich działań, ograniczających stosowanie związków toksycznych, są polichlorowane bifenyle (PCB).

W latach 60-tych stwierdzono, że PCB to związki toksyczne dla ludzi, ponieważ [6] :

• blokują naturalną przemianę materii w organizmie,

• trwale uszkadzają organy wewnętrzne,

• uszkadzają nieodwracalnie uszkadzać komórki systemu nerwowego,

• powodują zakłócenia w funkcjonowaniu systemu odpornościowego organizmu,

• mają działanie rakotwórcze,

• zniekształcają kod genetyczny [5].

W latach 70-tych podjęto decyzję o stopniowym wycofywaniu PCB z użycia oraz ograniczeniu ich stosowania ze względu na wysoką toksyczność w stosunku do organizmów żywych i środowiska naturalnego. Obecnie polichlorowane bifenyle oraz urządzenia i produkty, zawierające te substancje są w krajach UE obiektem skrupulatnej inwentaryzacji i muszą być zniszczone w sposób bezpieczny dla środowiska do końca 2010 roku.

Tabela 3. Oddziaływanie rakotwórcze wybranych związków chloroorganicznych na organizmy żywe [10]

trichlorometan	rakotwórczy, gromadzi się w tkance tłuszczowej, może uszkadzać wątrobę, nerki, mózg i system nerwowy
1,2-dichloroetan	rakotwórczy i mutagenny, może uszkadzać wątrobę, nerki
tetrachlorometan	rakotwórczy i mutagenny, może uszkadzać wątrobę, płuca, mózg
monochloroeten	rakotwórczy i mutagenny, podejrzewany o działanie teratogenne
1,1,1,1-trichloroetan	podejrzewany o działanie rakotwórcze
PCB	rakotwórczy i teratogenne, kumulacja w tkankach ludzi i zwierząt
chlorobenzeny	rakotwórczy, toksyczny dla ryb i alg, kumulacja w ludzkiej tkance tłuszczowej
trichloroeten	rakotwórczy i mutagenny, uszkadza system nerwowy
tetrachloroeten	rakotwórczy i mutagenny, może uszkadzać wątrobę, płuca, mózg
dichlorometan	rakotwórczy i mutagenny, podrażnia oczy, skórę i układ oddechowy

Według dr R. Reiss z Meksyku, świeże rezerwy wody na świecie są zagrożone przez zanieczyszczenie ich dihaloetanami: 1,2-dibromoetanem (EDB) i 1,2-dichloroetanem (EDC). Związki te są używane w przemyśle petrochemicznym, spożywczym i rolniczym. Dihaloetany są czynnikami rakotwórczymi i cytotoksycznymi, powodującymi uszkodzenia wątroby, żołądka i kory nadnerczy. Parowanie i reakcja fotochemiczna są procesami odpowiedzialnymi za usuwanie większości EDB i EDC z zewnętrznych warstw gleby [11].

Ze względów ekologicznych wiele badań poświęca się również biodegradacji chlorowcopochodnych aniliny. Związki te są podstawowymi metabolitami mikrobiologicznej degradacji szeroko stosowanych herbicydów fenylomocznikowych, acyloanilidowych i fenylokarbaminianowych [12,13]. Główną przyczyną wysokiej toksyczności tych związków jest chloropodstawiony pierścień aromatyczny nadający im charakter ksenobiotyków. Po dostaniu się do gruntu czy środowiska wodnego, ksenobiotyki te mają zdolność sprzęgania się z substancjami humusowymi lub też ulegają oksydatywnej dimeryzacji, tworząc wolno biodegradowalne chloropodstawione bifenyle, azobenzeny i triazeny [12,14,15]. Biorąc pod uwagę ich szkodliwe działanie po wprowadzeniu do środowiska przyrodniczego, znalezienie odpowiednich drobnoustrojów posiadających zdolności degradacyjne tych związków oraz opracowanie właściwej drogi ich biodegradacji jest głównym celem wielu prowadzonych w świecie badań.

Szczególną grupą zanieczyszczeń środowiska, której w ostatnich latach poświęca się coraz więcej uwagi są tzw. persystentne zanieczyszczenia organiczne (ang. Persistent Organic Pollutants, w skrócie POPs). Do grupy tej należy wiele związków chemicznych charakteryzujących się następującymi cechami [16,17]:

• zdolnością do wywoływania efektów toksycznych,

• trwałością we wszystkich elementach środowiska (persystencją),

• zdolnością do biokumulacji,

• zdolnością do transportu atmosferycznego na duże odległości,

• zdolnością do wywoływania niekorzystnych skutków w środowisku i dla człowieka, zarówno w pobliżu jak i w dużej odległości od źródła zanieczyszczenia.

Tak więc, biorąc pod uwagę, że okres półtrwania niektórych związków z grupy POPs sięga nawet kilkudziesięciu lat, ich zdolność do transgranicznej, czy też lepiej, transkontynentalnej migracji do najodleglejszych zakątków kuli ziemskiej, a także mając świadomość, że człowiek stanowi ostatnie ogniwo łańcucha pokarmowego należy przyjąć, że narażenie na te związki będzie trwało przez kolejne dziesięciolecia stawiając przed toksykologią środowiskową wciąż nowe wyzwania.

Wśród związków spełniających kryteria przynależności do POPs, na pierwszy plan wysuwa się liczna, szacowana na kilkanaście tysięcy substancji, grupa persystentnych związków chloroorganicznych. Należą do niej powszechnie stosowane w przeszłości insektycydy chloroorganiczne: DDT (oraz jego izomery i metabolity), izomery heksachlorocykloheksanu (HCH), związki cyklodienowe (aldryna, dieldryna, endryna), heptachlor, metoksychlor, i wiele innych, oraz związki stosowane w przemyśle bądź powstające w sposób niezamierzony: heksachlorobenzen (HCB), polichlorowane bifenyle (PCB), polichlorowane naftaleny (PCN), polichlorowane dibenzo-p-dioksyny (PCDD), polichlorowane dibenzofurany (PCDF) czy polichlorowane dibenzoetery (PCDE). Do grupy tej należy również zaliczyć wykrywane ostatnio w osoczu i tkance tłuszczowej ludzi związki bromopochodne stosowane powszechnie jako tzw. substancje uniepalniające (ang. brominated flame retardants), np. heksabromobenzen (HBB), polibromowane bifenyle (PBB) czy polibromowane dibenzoetery (PBDE).

Oszacowanie toksycznego działania większości ksenobiotyków na pojedyncze organizmy, gatunki czy też całe ekosystemy jest zadaniem niezwykle złożonym i trudnym.

Wśród przyczyn tego zagadnienia należy wymienić m.in.:

• bardzo niskie stężenia ksenobiotyków w poszczególnych elementach środowiska,

• trudności w oszacowaniu dawki progowej dla danego efektu toksycznego lub brak takiej dawki w przypadku działania kancerogennego czy mechanizmów opartych o działanie receptorowe [18,19]; trudności w ocenie zależności dawka-efekt [20],

• wielokierunkowość mechanizmów działania pojedynczych substancji [19],

• abiotyczne i biotyczne przemiany prowadzące do powstawania nowych, często nieznanych związków, wykazujących odmienne cechy toksykologiczne od substancji macierzystej [20],

• interakcje toksykologiczne między substancjami toksycznymi po ich dostaniu się do organizmu,

• trudności w wyborze, interpretacji i ekstrapolacji wyników badań laboratoryjnych in vivo i in vitro na warunki rzeczywiste [21].

3.2. Nowoczesne technologie unieszkodliwiania halogenopochodnych związków organicznych

Ze względu na nagłośnienie w mediach o szkodliwości halogenowych związków organicznych, prowadzonych jest wiele projektów, mających na celu znalezienie skutecznego sposobu unieszkodliwiania tego rodzaju związków. W rozdziale tym zostaną przedstawione niektóre z nich.

W Polsce instalacje spalania odpadów technologicznych z syntezy związków chloroorganicznych funkcjonują w Z.Ch.”Rokita” S.A. w Brzegu Dolnym oraz Z.A.”Anwil” S.A. we Włocławku. Utylizacja odpadów następuje przez zastosowanie metody spalania termicznego silnie zdyspergowanych substratów w temperaturze 1200-1500°C, z zastosowaniem intensywnego schładzania spalin, aby uniknąć powstawania PCDD/PCDFs. [10].

Interesującym procesem zachodzącym podczas unieszkodliwiania halogenopochodnych związków organicznych (w tym przypadku pestycydów) jest rizoremediacja, czyli degradacja opornego polutantu przez bakterie w rizosferze. Korzenie rośliny dostarczają dużej powierzchni dla rozwoju populacji bakterii i transportują je poprzez korzeń na odległość 10-15 m w głąb ziemi. Korzenie zaopatrują roślinę w składniki pokarmowe (aminokwasy, węglowodany i organiczne kwasy) tak, że żadne źródło węgla nie musi być wprowadzane dodatkowo i jednocześnie mogą zaopatrywać bakterie w kofaktory, wymagane dla aktywacji bakteryjnych enzymów w procesie degradacji. Trwają prace na modyfikacją genetyczną takich drobnoustrojów [22].

Industrial Liaison, Industrial Technology Development Center w USA, prowadzi badania nad technologią niszczenia chlorowcopochodnych i innych toksycznych związków organicznych. Technologia ta jest oparta na reakcji redukcji w ciekłym sodzie. Dostępne dane ograniczone są jedynie do trójchloroetanu i chlorobenzenu. Argonne National Laboratory (ANL) opracowuje dane projektowe dla obróbki toksycznych odpadów organicznych stanowiących przedmiot zainteresowania przemysłu gospodarki odpadami (np. PCB, dioksyny, czynniki chemiczne użyte w środkach bojowych) [23].

Z kolei Enviromental Technologies Incorporation z Canady prowadzi badania nad technologią destrukcji chlorowcowych związków organicznych. Metoda ta wykorzystuje reakcje zachodzące pomiędzy jonami żelaza a organicznymi związkami chlorowcopochodnymi. Lotne związki organiczne zawierające chlorowane etyleny (tetrachloroetylen, trójchloroetylen, PCV i inne), mogą być degradowane do setnych części mg/l. Końcowym produktem procesu są całkowicie zdehalogenowane związki, nieszkodliwe dla środowiska takie jak: etylen, etan, metan czy jony chloru. Proces wymaga biernego przepływu zanieczyszczonych wód podziemnych przez urządzenie z metalu, reagujące z zanieczyszczeniami (jony żelaza). Urządzenie to jest instalowane jako przepuszczalny ekran w miejscu występowania zanieczyszczeń. Jego rozmiary zależą od prędkości przepływu wód podziemnych i stopnia niszczenia poszczególnych zanieczyszczeń. Istnieje również możliwość zastosowania technologii do wód powierzchniowych.

Innowacyjne cechy technologii to:

• całkowita degradacja szerokiego zakresu chlorowanych lotnych związków organicznych,

• wysoki stopień niszczenia wielu związków,

• niskie koszty materiału reakcyjnego,

• żywotność materiału reakcyjnego,

• brak osadów, szlamów lub innych odpadów wymagających składowania,

• nie wymaga zewnętrznego źródła energii.

Pierwsza pełnowymiarowa instalacja została zainstalowana przy zakładzie przemysłowym w Kalifornii w grudniu 1994 roku. Obecnie zainstalowanych jest 6 technologii w tym 5 w USA i 1 w Wielkiej Brytanii. Również w USA przeprowadzane są liczne badania pilotażowe w celu oczyszczania wód powierzchniowych za pomocą tej technologii. Niewątpliwie jej zaletą jest prostota procesu, długi okres działania oraz opłacalność ekonomiczna technologii. Technologia ta, zastosowana w miejscu występowania zanieczyszczonych wód jest szczególnie atrakcyjna ze względu na oczyszczanie wód w naturalnym systemie hydrogeologicznym (brak parowania niebezpiecznych związków czy przepompowywania zanieczyszczonych wód). Konstrukcja przepuszczalnej ściany reagującej posiada ograniczenie głębokościowe i geologiczne, np. technologia ta nie może być stosowana do oczyszczania zanieczyszczeń w skałach luźnych. Ponadto technologia nie daje pozytywnych rezultatów przy oczyszczaniu związków takich jak: dichlorometan, 1,2-dichloroetylen, chloroetylen, benzen, toluen, ksylen [23].

ABB Environmental Services Incorporation przeprowadziła natomiast badania na temat tlenowych i beztlenowych warunków bioremediacji polichloroetylenu. Biodegradacja tetrachloroetylenu (PCE) za pomocą bakterii tlenowych i beztlenowych jest możliwa przy spełnieniu określonych warunków. W procesie beztlenowym PCE może ulec całkowitemu odchlorowaniu. Najwolniej w tym procesie przebiega przekształcenie chlorku winylu (VC) do etylenu. Chlorek winylu (VC) najlepiej poddaje się degradacji w tlenowym procesie metanotroficznym, dlatego dwustopniowy proces jest najbardziej skuteczny. Celem opracowanej technologii jest skuteczność tworzenia i utrzymania właściwych warunków w procesie rozkładu chloroetanu w formacjach wodonośnych. Dla osiągnięcia tego celu firma (ABB-EF) testuje metody wstrzykiwania węgla i odżywek mineralnych oraz dostarczenie ich do zanieczyszczonych PCE i TCE formacji wodonośnych. Stan chemiczny wód podziemnych będzie monitorowany wewnątrz. Jeśli wyniki analizy lotnych związków organicznych pokażą spadek rozkładu produktów zawierających TCE, DCE lub VC, to tlen i metan będą dodawane do wód podziemnych, aby stymulować rozkład tlenowy za pomocą bakterii metanotroficznych. Technologia ta usuwa PCE, TCE, DCE i VC z wód podziemnych [24].

Kolejną nową technologią jest system LARC, opatentowany w USA (Patent Nr 4 144 152). Został on opracowany przez Arctech Incorporation z USA w ramach badań nad technologią oczyszczania gleb i osadów zanieczyszczonych chlorowanymi związkami organicznymi. LARC jest procesem fotochemicznym, w którym wykorzystywane jest promieniowanie ultrafioletowe do redukcji chlorków (bez fluoru), bromków, związków organicznych, jodu. Proces został opracowany do oczyszczania cieczy, szlamów, osadów i odpadów stałych. Chlorowane związki organiczne mogą być oczyszczane w obecności innych związków organicznych lub nieorganicznych tak długo, dopóki występuje promieniowanie ultrafioletowe i reakcje wolnorodnikowe. Warunki fotochemiczne są wytwarzane w reaktorze LARC w wysoko regulowanych reakcjach, w wyniku których jako końcowy produkt rozkładu PCB otrzymuje się tylko bifenyle i chlorek sodu.

Zastosowanie technologii LARC do oczyszczania gleb i osadów zanieczyszczonych chlorowanymi związkami organicznymi wymaga skutecznego ich usuwania z zanieczyszczonych osadów i gleb. Technologia ta pomogła w przeprowadzeniu skutecznego unieszkodliwiania odpadów zawierających PCB i pestycydy (np. chloran) oraz inne związki organiczne. Nie można stosować tej metody do metali, proces został skonstruowany tylko do oczyszczania materiału zawierającego chlorki, nieorganiczne związki utrudniają proces [25].

4. Ogólne dane na temat biodegradacji związków organicznych

Degradacja węglowodorów zwykle wymaga obecności tlenu. Dotyczy to zarówno węglowodorów alifatycznych - od gazowego metanu, poprzez etan i propan do stałych parafin, jak i węglowodorów aromatycznych - od benzenu i naftolu do antracenu i związków policyklicznych. Wszystkie wymienione substancje po wstępnych reakcjach utlenienia wchodzą w główne szlaki metaboliczne. Reakcje te polegają na wbudowaniu cząsteczki tlenu do związku organicznego. Jest to etap tzw. oksygenacji, a enzymy go przeprowadzające to oksygenazy. Jeżeli enzym wprowadza tylko jeden atom tlenu, jest to monooksygenaza, a jeśli dwa atomy tlenu - dioksygenaza. Enzymy te zdecydowanie różnią się od oksydaz, katalizujących przeniesienie atomów wodoru od donora do tlenu z jego redukcją do wody, gdyż nie wbudowują one nigdy tlenu do cząsteczek organicznych ani do materiału komórkowego. Oprócz oksygenaz w procesie biodegradacji węglowodorów uczestniczą również enzymy należące do dehydrogenaz, hydrolaz i dekarboksylaz. Stopień biodegradacji zależy od indywidualnych predyspozycji drobnoustrojów i warunków środowiskowych (tj. pH, temperatury, źródła azotu i fosforu). Chemikalia muszą być dostępne dla mikroorganizmów, np. węglowodory są nierozpuszczalne i ich degradacja wymaga biosulfaktantów [26].

Węglowodory alifatyczne

Węglowodory alifatyczne łatwiej ulegają degradacji niż węglowodory aromatyczne. Długołańcuchowe C₁₀-C₂₂ są chętniej degradowane niż krótkołańcuchowe. Długołańcuchowe węglowodory (alkany) są wykorzystywane przez liczne bakterie. Długość łańcucha ma tu zasadnicze znaczenie. Liczba gatunków wykorzystujących je oraz intensywność degradacji wzrasta wraz z długością parafin.

We wstępnym ataku na łańcuch węglowodorowy uczestniczy tlen. W warunkach braku tlenu cząsteczkowego utlenianie parafin nie zachodzi. Utlenianie jest katalizowane przez monooksygenazę. Dalsze utlenianie parafin przebiega w wyniku degradacji długołańcuchowych kwasów tłuszczowych, tj. ß-oksydacji [22].

Degradacja n-alkanów C₉-C₄₄ może przebiegać na drodze terminalnej, subterminalnej lub poprzez alkeny. Proces degradacji jest przedstawiony poniżej (rys. 1).

Rys. 1. Ogólny schemat rozkładu n-alkanów na drodze terminalnej i subterminalnejWęglowodory aromatyczne

Pierścień aromatyczny rozszczepia wiele gatunków bakterii i grzybów, m.in. Pseudomonas, Mycobacterium, Flavobacterium, Bacillus, Nocardia, Aspergillus, Penicillium, Rhizopus. Większość spośród związków aromatycznych występujących w przyrodzie początkowo ulega degradacji przez bakterie do jednego lub dwóch związków: katecholu i kwasu protokatechowego. Wiele pojedynczo lub podwójnie (1,2-di-) podstawionych pierścieni aromatycznych, np. w kwasie migdałowym, toluenie, benzoesanie, salicylanie, fenolu i benzenie oraz ich pochodnych jest degradowanych do katecholu.

Benzen i pochodne związki charakteryzują się wyższą stabilnością termodynamiczną niż węglowodory alifatyczne. Pierwszym krokiem utleniania benzenu jest hydroksylacja katalizowana przez dioxygenazę. Produkt jest przekształcany do katecholu przez dehydrogenazę. Te początkowe reakcje, hydroksylowanie i odwodornienie, mają wspólne ścieżki degradacji innych aromatycznych węglowodorów. Wprowadzenie podstawnika do pierścienia benzenu stwarza alternatywny mechanizm, pozwalający na atakowanie bocznych łańcuchów lub do utleniania aromatycznego pierścienia [22].

Rys. 2. Ogólny szlak degradacji związków aromatycznych do katecholu

Do kwasu protokatechowego przekształcane są pierścienie aromatyczne podwójnie podstawione w pozycjach 1,3 i 1,4, jak również pierścienie podstawione wielokrotnie. We wszystkich przypadkach do pierścienia włączane są grupy hydroksylowe. Tlen jest pochodzenia cząsteczkowego.

Rys. 3. Ogólny szlak degradacji związków aromatycznych do kwasu protokatechowego

Rozszczepienie pierścienia aromatycznego często, ale nie zawsze, jest poprzedzone usunięciem z niego podstawników. Grupy chlorowe, nitrowe i sulfonowe są zastępowane grupami hydroksylowymi. Alifatyczne łańcuchy boczne mogą być różnie modyfikowane i skracane lub pozostawać nietknięte.

Pierścień rozszczepiają dioksygenazy. W trakcie tego procesu jest wbudowywany tlen cząsteczkowy. Pierścień zostaje rozerwany albo między dwiema sąsiadującymi grupami hydroksylowymi (rozszczepienie typu orto), albo pomiędzy hydroksylowaanymi i sąsiadującymi niehydroksylowanym atomem węgla (rozszczepienie typu meta). Najlepiej zbadano enzymy wyizolowane z różnych gatunków Pseudomonas.

Najszybsza i kompletna degradacja zachodzi w tlenowych warunkach. Typowymi bakteriami zdolnymi do degradacji zanieczyszczeń organicznych są chemoorganotroficzne gatunki, zdolne do przyswajania dużej liczby naturalnych składników i ksenobiotyków, tj. węgla czy dawcy donorów energii dla nowej generacji. Biodegradacja opiera się na dwóch procesach: wzroście i kometabolizmie. W przypadku wzrostu organiczne związki stanowią jedyne źródło węgla i energii, a proces ten kończy się całkowitą mineralizacją. Kometabolizm natomiast jest definiowany jako metabolizm związków organicznych w obecności substratu wzrostu, używanego jako węgiel i źródło energii. Mikroorganizmy degradujące wymagają tlenu na dwóch etapach metabolizmu: na początkowym etapie atakowania substratu i na końcu łańcucha oddechowego. Wyższe grzyby natomiast rozwinęły niezrównany system utleniania do degradacji lignin w oparciu o pozakomórkową oksydazę p-dwufenolową i peroksydazę ligninolityczną [22].

W procesie redukcji, dehalogenacja wysokohalogenowych związków, jest procesem, który redukuje stopień chlorowania i co więcej, pozwala na lepszą dostępność w przypadku mineralizacji przez bakterie tlenowe. Beztlenowa dechloryzacja (odchlorowanie) jest zawsze niekompletna.

W celu uzyskania lepszych parametrów procesu biodegradacji, stosuje się organizmy modyfikowane genetycznie. Zdolność do transferu informacji może być wykorzystana przy budowie bakterii ze specjalnymi zdolnościami, np. dwa gatunki mogą być połączone w jeden, który jest zdolny do degradacji związków zarówno do katecholu jak i do chlorowanego katecholu. Poniżej w tabeli 4 przedstawiono kilka przykładów mikroorganizmów stosowanych do budowy "specjalistów" przez skojarzenie z sp. B13, [28]:

Tabela 4. Przykłady mikroorganizmów skojarzonych z sp.B13

Gatunki	Związki inicjujące degradację	Związki inicjujące degradację po skojarzeniu z B13
Alcaligenes	benzen, fenol	chlorobenzeny chlorophenole
	salicylan	chlorosalicylan
	metylosalicylan	chlorometylosalicylan
Pseudomonas putida F1	benzen	chlorobenzen
Ps. putida N31	nitrofenol	chloronitrophenol
Ps. JL1	toluidyna	chlorotoluidyna
	naftalen	chloronaftalen

4. Biodegradacja halogenowych pochodnych związków organicznych

4.1. Reakcje biochemiczne w degradacji halogenowych związków organicznych

Redukcyjna dehalogenacja - w wyniku reakcji podstawnik halogenowy jest usuwany z pierścienia aromatycznego.

Rys. 4. Redukcyjna dehalogenacja

Dehalogenacja oksygenolityczna - w wyniku reakcji z udziałem monooksygenazy następuje rozerwanie wiązania podwójnego pomiędzy atomami węgla i powstanie epoksydu, a następnie usunięcie podstawników halogenowych poprzez zastąpienie ich atomami tlenu.

Rys. 5. Dehalogenacja oksygenolityczna

Dehalogenacja hydrolityczna - w wyniku reakcji podstawnik halogenowy zostaje zastąpiony grupą hydroksylową, pochodzącą z cząsteczki wody, biorącej udział w reakcji.

Rys. 6. Dehalogenacja hydrolityczna

Dehalogenacja tiolowa - w wyniku reakcji z udziałem transferazy S-glutationowej (EC 2.5.1.18) następuje zastąpienie podstawnika halogenowego grupą sulfhydrylową (-SH), pochodzącą od glutationu, a następnie na drodze dehalogenacji hydrolitycznej zastąpienie kolejnego podstawnika halogenowego przez grupę hydroksylową, pochodzącą od cząsteczki wody, biorącej udział w reakcji.

Rys. 7. Dehalogenacja tiolowa

Enzym ten nie dehalogenuje: CHCl₃, CCl₄, 1,1,1-TCA, 1,1-DCA, TCE, PCE. Enzym jest prawdopodobnie specyficzny dla di- albo mono halometanów, najefektywniej współdziała z podstawnikiem Cl i Br.

Intermolekularna substytucja - w wyniku reakcji podstawnik halogenowy zostaje usunięty i otrzymujemy epoksyd;

Rys. 8. Intermolekularna substytucja

Eliminacja - w wyniku reakcji następuje usunięcie podstawnika halogenowego, co prowadzi do powstania wiązania podwójnego.

Rys. 9. Reakcja eliminacji

Hydratacja - w wyniku reakcji następuje rozerwanie podwójnego wiązania i przyłączenie grupy hydroksylowej, pochodzącej z cząsteczki wody wprowadzonej do reakcji, a następnie usunięcie podstawnika halogenowego [29].

Rys. 10. Reakcja hydratacji [4,9]

4.2. Wybrane reakcje biochemiczne w degradacji halogenowych związków organicznych

Redukcyjna dehalogenacja

Główny mechanizm beztlenowego metabolizmu halogenowych związków stanowi redukcyjna dehalogenacja, która wprowadza H₂ do wiązania węgiel-halogen. Reakcja jest energetycznie korzystna i mogłaby służyć jak źródło energii dla wzrostu.

Redukcyjna dehalogenacja znajduje zastosowanie w przypadku bioremediacji gleby i zanieczyszczeń wody. W przypadku degradacji związków w beztlenowych warunkach, koszty związane z utrzymaniem tlenowych warunków otoczenia z powietrza, ozonu lub nadtlenku wodoru mogłyby być eliminowane. Z tego powodu prowadzi się aktualnie badania w celu lepszego zdefiniowania podstawowych mechanizmów reakcji redukującej dehalogenacji.

W celu zdefiniowania podstawowych mechanizmów reakcji dehalogenacji redukcyjnej bierze się pod uwagę następujące zagadnienia [5,6]:

• dodatek odpowiednich składników żywieniowych wymaganych przez mikroorganizmy o zdolnościach dehalogenujących;

• użycie zmodyfikowanych drobnoustrojów z optymalną aktywnością dehalogenującą;

• dodatek wolnych enzymów komórkowych, zdolnych do katalizowania reakcji redukującej dehalogenacji.

Tabela 5. Klasy halogenowych związków organicznych podatnych na degradację w procesie redukcyjnej dehalogenacji

Klasa halogenowych związków organicznych	Przykłady specyficznych związków
benzeny karboksylowe	amben dicamba 2,3,6-trichlorobenzen
benzeny z podstawnikami tlenowymi	pentachlorofenol chlorowany fenoksyoctan halogenowy eter dietylowy - herbicyd (np.chloronitrofen)
benzeny z podstawnikami azotowymi	3,4-dihalogenowe związki aromatyczne (np. linuron, propanil), pentachloronitrobenzen
cyjanobenzeny	2,4,5,6-tetrachloroizoftalonitryl (TPN)
metylenobenzeny	bentiowęglan
chlorowane benzeny	heksachlorobenzen
polichlorowane bifenyle	aroclor (kongenery PCBs)

Tabela 6. Klasy niearomatycznych związków, podatnych na degradację w procesie redukcyjnej dehalogenacji

Klasy halogenowych niearomatycznych związków	Przykłady specyficznych związków
Związki alifatyczne	tetrachlorometan (czterochlorek węgla) trichlorometan (chloroform) dichlorometan (chlorek metylenu) chlorometan (chlorek metylu) bromometan (bromek metylu) trichloronitrometan heksachloroetan tetrachloroeten (perchloroetylen) 1,1,1-trichloroetan trichloroeten (trichloroetylen) 1,2-dichloroetan (dichlorek etylenu, EDC) 1,2-dibromoetan (dibromek etylenu, EBC) 1,2-dibromo-3-chloropropan (DBCP) 1,1,1-trichloro-2,2-bis (p-chlorofenyl) etan (DDT)
Związki alicykliczne	toksafen mirex heptachlor
heksahalocykloheksany	lindan i jego izomery

Dehydrogenacja hydrolityczna

Dehydrogenacja hydrolityczna przebiega przy udziale dehydrogenazy haloalkanowej (DhlA) (EC 2.8.1.1) z Xanthobacter autotrophicus GJ10, która katalizuje hydrolityczne rozszczepienie wiązania halogen-węgiel w haloalkanach, wśród których są związki traktowane jako szkodliwe dla środowiska, np.1,2-dichloroetan (DCE), 1,2-dibromoetan (DBE) czy 1,3-dichloropropan. DhlA przekształca substraty w odpowiadające im alkohole bez konieczności użycia kofaktorów i osiąga maksimum aktywności katalitycznej w temperaturze 37°C i pH 8,2. Dehalogenaza haloalkanowa katalizuje usuwanie grupy halogenowej od halogenowych węglowodorów alifatycznych, jest enzymem specyficznym w stosunku do typów degradowanych związków [5].

DhlA ma strukturę trójwymiarową. Jest monomerycznym, rozpuszczalnym enzymem, składającym się z 310 aminokwasów [27].

Rys. 11. Przestrzenna budowa dehydrogenazy haloalkanowej (DhlA)

Mikrobiologiczna utylizacja halogenowych węglowodorów jako substratu wymaga, aby halogeny były usuwane jako pierwsze, pozostawiając za sobą łatwo ulegający rozkładowi szkielet węgla. Wiązania węgiel-halogen mogą być rozszczepiane na drodze enzymatycznej.

4.3. Degradacja związków halogenowych w warunkach beztlenowych

Celem projektu pod nazwą „Raport na temat beztlenowej degradacji herbicydów zdolnych do denitryfikacji” (EPA Grant Number R822487), przeprowadzonego przez Rutgers University w USA, miało być zbadanie w jaki sposób chlorowe, benzoesowe i kwaśne środki chwastobójcze mogą być biodegradowane w beztlenowych warunkach, faworyzujących denitryfikację. Badania opierały się na dwóch oddzielnych zagadnieniach:

1. degradacja herbicydu dicamba była badana w beztlenowych warunkach i przy wzbogaceniu kultury mikroorganizmów w ziemię i osady jako inokulum;

2. chloro-, bromo- i fluorobenzenoesany rozkładane przez bakterie denitryfikujące były wzbogacane i izolowane, w postaci mieszanych i czystych kultur; na ich podstawie obserwowano mechanizmy degradacji związków halogenowych [30].

Beztlenowa podatność na biodegradację i transformację dicamby (rodzaj herbicydu) była badana w procesie denitryfikacji, redukcji żelaza Fe (III) i siarczanu oraz w warunkach metanogenezy. Jako inokulum użyto próbek gleby i osadów. Badania pokazują wpływ różnych akceptorów elektronów na przekształcanie dicamby w beztlenowych warunkach i sugerują ścieżkę degradacji w warunkach metanogenezy - odzwierciedla to wpływ warunków na biodegradację środków chwastobójczych.

Rys. 12. Szlak degradacji i transformacji dicamby w zróżnicowanych warunkach redukcji

Osobno potraktowano rozkład biologiczny chloro-, bromo- i fluorobenzoesanu przez denitrifikujące bakterie. Chloro-, bromo- i fluorobenzoesanu chętnie są degradowane przy wzbogaceniu w denitryfikujące kultury bakterii w próbkach ziemi i osadów z rozmaitych środowisk i geograficznych lokalizacji. Mechanizmy utylizacji substratów są podobne w niemal wszystkich stosowanych w badaniach próbkach co sugeruje, że bakterie denitryfikujące ze zdolnością biodegradacyjną związków halogenowych są szeroko rozpowszechnione w naturze.

Interesujące są też różnice w podatności na biodegradację denitryfikacyjną różnych izomerów halobenzoesanów. Meta i para podstawione chlorowane i bromowane kwasy benzoesowe chętnie są utylizowane, podczas gdy orto podstawienie powodowało, że chloro- i bromobenzoesan nie były degradowane, z wyjątkiem kilku przypadków. Fluorowe izomery, ortho i para fluorobenzoesany chętnie są degradowane, ale dotychczas niemożliwa była utylizacja meta fluorobenzoesanu.

Wzbogacono stabilne kultury bakteryjne mikroorganizmami denitryfikującymi, utylizującymi halobenzoesany, które stanowią jedyne źródło węgla i energii. Degradacja 3- i 4-chlorobenzoesanu i odpowiednio bromowane i traktowane jodem kwasy benzoesowe, mogą być włączone do redukcji NO₃^- do N₂. Stechiometryczne nagromadzenie halogenku wskazuje, że dehalogenacja zdarza się na jakimś etapie metabolizmu. Beztlenowa degradacja halobenzoesanów połączona jest z denitryfikacją i może być opisana przez następującą reakcję: C₇H₅O₂X + 5,6 NO₃^- + 4,6 H⁺ →
7 CO₂ + 2,8 N₂ + 4,8 H₂O + X (X = Cl, Br, J). Degradacja chlorobenzoesanu nie zdarzała się w przypadku braku azotanów albo w obecności tlenu, wskazując na połączenie procesu z denitryfikacją [31].

Fiński Instytut Ochrony Środowiska Hakuninmaantie przeprowadził badania nad biodegradacją zanieczyszczonej chlorofenolami ziemi, pochodzącej z tartaku. Wskazały one na biodegradowalność, ruchliwość i reakcje transformacji organicznych związków halogenowych w zanieczyszczanej ziemi z tartaku podczas bioremediacji na skutek kompostowania. Jako inokulum użyto suchego kompostu (słomy) i próbek ziemi, zanieczyszczonej chlorofenolami. Podczas skali pilotażowej kompostowania na polu, ponad 90% chlorofenoli zostało usuniętych. Rozkład biologiczny chlorofenoli był skuteczny, szybki i niezależny od inoculum. Częste mieszanie i kontrola poziomu składników odżywczych wzmagała aktywność degradacji chlorofenoli oraz działalność mikroorganizmów w zanieczyszczonej próbce ziemi. W równoległym eksperymencie zaszła 60% mineralizacja pentachlorofenoli znakowanych radioaktywnie. Badany materiał otrzymano w ciągu czterech tygodni z 1 kg stosu kompostu z /bez inoculum. Wynik ten świadczy o tym, że większa część chlorofenoli uległa całkowitej mineralizacji [32].

American Water Works Association Research Foundation sporządziło raport w roku 1999, dotyczący biodegradacji związków toksycznych, występujących w wodzie w rezultacie m.in. jej dezynfekcji. Konsumenci nieustannie żądają, aby woda do picia była wolna od mikrobiologicznych czynników chorobotwórczych. Środkiem dezynfekującym w przeszłości był chlor, aż do odkrycia w 1974 roku, że dodatek chloru do wody do picia prowadzi do tworzenia trihalometanów (THMs). Dodatkowo, inne potencjalne niebezpieczne produkty uboczne (DBPs) mogą wynikać z reakcji chloru z naturalną organiczną materią (NOM), na przykład kwasy halooctowe (haloacetic) (HAAs) [33].

Według innego raportu Research Triangle Institue (RTI) w wielu miejscach Stanów Zjednoczonych woda gruntowa zawiera zanieczyszczenia z rozpuszczalników halogenowych. Obecnie metody oczyszczania są często kosztowne i nieskuteczne. Nowe technologie mają na celu przyśpieszenie procesu in situ w warunkach beztlenowych. Naukowcy są świadomi, że beztlenowa biodegradacja może usuwać organiczne pochodne chlorowe np. rozpuszczone w wodzie gruntowej. W procesie dehalogenacji, beztlenowe drobnoustroje usuwają atomy halogenowców (chlor, fluor, brom, jod i astat) z zanieczyszczeń takich jak trichloroetan (TCE) poprzez proces oddychania halogenowego. Kiedy wiązanie halogen-węgiel ulega rozszczepieniu, wodór ogólnie będzie działał jak akceptor elektronu dla atomu węgla. Beztlenowa redukcyjna dehalogenacja często jest ograniczona przez brak wodoru w fazie podpowierzchniowej. Dodatek substancji powodujących uwolnienie wodoru pozwala drobnoustrojom reagować z rozpuszczalnikiem. W innych zastosowaniach in situ, biodegradacja środków zanieczyszczających jest ograniczona przez brak wystarczającej liczby odpowiednich mikroorganizmów albo przez skład pożywki próbki ziemi. W tych przykładach, mikroby albo pożywka mogą być dodawane we wzrastających stosunkach. In situ redukcyjna dehalogenacja jest najbardziej efektywna w przypadku wody gruntowej, zanieczyszczonej tetrachloroetanem (PCE) i TCE. Bioremediacja w warunkach beztlenowych może być stosowana do dehalogenacji trichloroetanu (TCA), dichloroetanu (DCE) i chlorku winylu. Redukcyjna dehalogenacja była demonstrowana przez DOD's Point Mugu (Morsko - Powietrzną Stację Wojskowa), DOE Idaho (Narodowego Prowadzącego Inżyniera) i Pracownię Środowiskową (INEEL). Proces ten był również demonstrowany przez Agencję Ochrony Środowiska (EPA) pod nazwą Superfund Innovative Technology Evaluation (SITE) Demonstration Program [34].

5. Wybrane szlaki degradacji halogenowych związków organicznych

5.1. Wybrane szlaki biodegradacji związków alifatycznych

Czterochlorek węgla (chloroform)

Roczna produkcja chloroformu wynosi około 100 000 t. Emisja w wyniku produkcji i stosowania jest oceniana na 10 000 t, dodatkowo 10 000 t rocznie pochodzi z procesu chlorowania wody do picia. Chloroform jako czterochlorek węgla jest wszechobecny. Jest używany jako składnik substancji chłodzących, w aerozolach, jako rozpuszczalnik i składnik w produkcji kosmetyków. Udowodniono, że w zwierzęcych próbach chloroform powoduje raka. W organizmach szczurów płci żeńskiej guzy tarczycy, w męskich guzy wątroby i nerek.

Dla czterochlorku węgla są opisane dwa szlaki degradacji. Redukcyjna dehalogenacja prowadzi przez chloroform, dichlorometan, chlorek metylu aż do metanu. Jest to proces zachodzący tylko w warunkach beztlenowych. Drugi szlak to kompletna hydroliza i kończy się utworzeniem CO₂. Zakłada się, że proces substytucji wodą jest chemiczną reakcją, która powoduje powstawanie metaloporfiryn. Interesujące jest to, że organizmy mogą wykorzystywać oba szlaki równolegle.

Rys. 13. Abiotyczny szlak degradacji chloroformu

Rys. 14. Biologiczny szlak degradacji chloroformu [35,36]

Tetrachloroetylen

Tetrachloroetylen jest również nazywany perchloroetylenem (PCE). Roczna produkcja tego związku wynosi 600 000 t, z czego 80% jest wydalane do otoczenia. Jest on jednym z pięciu najczęściej spotykanych lotnych związków organicznych w miejskich rezerwuarach wody gruntowej. Związek jest używany w procesie chemicznego czyszczenia, odtłuszczania w przemyśle metalurgicznym, jako rozpuszczalnik w chemicznym przemyśle oraz pośredni produkt w kilku syntezach.

Jedynym znanym szlakiem degradacji perchloroetylenu jest redukcyjna dehalogenacja. PCE jest degradowany w warunkach beztlenowych do mniej chlorowanych etenów trójchloroetylenu: (TCE), trans-1,2-dichloroetylenu (trans-DCE), cis-1,2-dichloroetylenu (cis-DCE), 1,1-dichloroetylenu (1,1 DCE), chlorku winylu (VC), etylenu i w końcu etenu. Odchlorowanie PCE często jest niekompletne.

Warunki panujące w glebie powodują gromadzenie się cis-dichloroetanu i chlorku winylu. Przy zachowaniu odpowiednich warunków możliwe jest takie pokierowanie reakcją, żeby etan był jedynym produktem.

Rys. 16. Mikrobiologiczny szlak dehalogenacji redukcyjnej PCE

Trichloroetylen (TCE)

Na skalę techniczną trichloroetylen otrzymuje się z acetylenu i chloru (poprzez tetrachloroetan). Roczna produkcja trójchloroetylenu wynosi około 500 000 t, emisja w procesie produkcji i stosowania utrzymuje się na poziomie 60%. Ma zastosowanie jako rozpuszczalnik oraz półprodukt w technologii organicznej. W stanie pary szybko przenika do ośrodkowego układu nerwowego człowieka, działając znieczulająco i przeciwbólowo, jednak ze względu na skutki toksyczne jest rzadko stosowane jako środek znieczulający. Jest składnikiem kosmetyków, farb, środków. Udowodniono jego rakotwórcze działanie.

Rys. 15. Kometaboliczne utlenianie trichloroetylenu

Szlak degradacji TCE (trichloroetylenu) może być opisany w następujący sposób:

1. TCE może podlegać redukcyjnej dehalogenacji, tj. usuwaniu jednego atomu chloru (Cl) i zastępowaniu go jednym atomem wodoru (H). Formowane są następujące produkty reakcji: 1,1-dichloroethylene (1,1-DCE), cis-1,2-dichloroetylen (c-1,2-DCE) i/lub trans 1,2- dichloroetylen (t 1,2- DCE)

2. 1,1-DCE może pod wpływem redukcyjnej dehalogenacji kształtować chlorek winylu lub jego podwójne wiązanie węgla-węgiel może ulegać redukcji do 1,1-dichloroetanu (1,1-DCA).

3. dwa składniki dichloroetylenu c-1,2-DCE i t-1,2-DCE mogą podlegać redukcyjnej dehalogenacji i przekształtceniu do chlorku winylu. Ich podwójne wiązania węgla-węgiel mogą zostać zredukowane do 1,2-dichloroetanu (1,2-DCA).

4. 1,1-DCA i 1,2-DCA mogą pod wpływem dehalogenacji ulegać transformacji do chlorku winylu. Te dwa związki mogą też przechodzić na drodze redukcyjnej dehalogenacji do chloroetanu. Szlak degradacji pojedynczego związku TCE może prowadzić do produkcji sześciu lotnych chlorowanych węglowodorów. Degradacja PCE może prowadzić do produkcji siedmiu chlorowanych. Podczas, gdy degradacja 1,1,1-TCA może prowadzić do produkcji czterech chlorowanych węglowodorów. Dwa produkty metabolizmu: chlorek winylu i 1,1-DCA, zostały sklasyfikowane jako czynniki rakotwórcze.

Rys. 17. Degradacja trichloroetylenu (TCE)

Enzymy z aktywnością w stosunku do TCE: 2,3-dioksygenaza toluenowa z P. putida (EC 1.14.12.11), 2-monooksygenaza toluenowa (EC 1.14.13), 4-monooksygenaza toluenowa, hydroksylaza fenolowa, ale żadna z nich nie aktywuje tetrachlorometanu lub tetrachloroetenu.

Chlorek winylu

Światowa produkcja chlorku winylu wynosi około 10 mln t, z czego emisja do otoczenia utrzymuje się na poziomie 200 000 - 300 000 t rocznie. Używany jest tylko do syntezy PCV.

Polichlorek winylu znajduje zastosowanie jako materiał elektroizolacyjny, surowiec do wyrobu płytek podłogowych, taśm magnetofonowych, opakowań, rur, elementów armatury, przedmiotów codziennego użytku, drobnego sprzętu medycznego (cewników, drenów, sond) oraz do impregnacji tkanin i papieru. Miękki polichlorek winylu jest stosowany do wykładania zbiorników. Rurowe membrany z polichlorku winylu służą do ultrafiltracyjnego oczyszczania wody i ścieków.

Polichlorek winylu jest tworzywem o dobrych właściwościach mechanicznych (wytrzymałość na rozciąganie 50 MPa, na ściskanie 60­-100 MPa). Wyroby z polichlorku winylu można używać w temperaturze od +20 do +70ºC.

Związek ten jest wysoce toksyczny, najniższe śmiertelne dawki dla szczurów wynoszą 250 ppm, a dla ludzi 20 ppm wchłanianych poprzez wdychanie. Chlorek winylu jest rakotwórczy, najniższa koncentracja, powodująca raka u szczurów wynosi 50 ppm.

Rys. 18. Wewnątrzkomórkowy szlak degradacji chlorku winylu

Rys. 19. Kometaboliczny szlak degradacji chlorku winylu

Dichlorometan

Roczna produkcja dichlorometanu wynosi 500 000 t. Jest on głównie używany jako rozpuszczalnik. Najniższe śmiertelne dawki dla ludzi wynoszą 500 ppm w ciągu 8 godzin. Jak dotąd nie udowodniono działania rakotwórczego dichlorometanu. Okres półtrwania w środowisku wynosi około 16 tygodni.

Rys. 20. Degradacja dichlorometanu z Methylobacterium sp.DM4

Dla dichlorometanu został odkryty specjalny mechanizm dehalogenacji. Chlorek jest zastępowany przez atom siarki, pochodzący od glutationu, który ponownie jest zastępowany przez wodę. W warunkach beztlenowych bakterie Dehalobacterium formicoaceticus są zdolne do przekształcania dichlorometanu w kwas mrówkowy i octan.

Trichloroetan

Roczna produkcja trichloroetanu wynosi około 600 000 t, z czego 50-70% jest wydalane do otoczenia. Stosuje się go głównie jako rozpuszczalniki i substancje czyszczące, był dawniej używany w aerozolach. Może mieć działanie rakotwórcze. Na temat jego biodegradacji w literaturze nie natrafiono.

1,2-dichloroetan

Produkcja 1,2-dichloroetanu utrzymuje się na bardzo niskim poziomie. Roczna produkcja wynosi do 13 mln t, emisja do otoczenia około 1 mln t rocznie. Używany jest głównie do produkcji innych chlorków węgla (tri-, per-, VC). Od 1989 roku zostało udowodnione działanie rakotwórcze, najniższa śmiertelna dawka dla ludzi wynosi 850 mg/kg masy ciała.

Rys. 21. Degradacja 1,2-dichloroetanu przez Xantobacter autotrophicus GJ10

1,3-dichloro-2-propanol

1,3-dichloro-2-propanol jest składnikiem pestycydów. Ma działanie rakotwórcze i genotoksyczne.

Rys. 22. Degradacja 1,3-dichloro-2-propanol z użyciem Agrobacterium radiobacter AD1 [9]

Tetrachloroetan

Produkcję tetrachlorometanu, zwanego również czterochlorkiem węgla, szacuje się na około 1 mln ton rocznie. Emisja do atmosfery w wyniku produkcji i stosowania wynosi około 50 000 t. Związek ten jest stosowany jako rozpuszczalnik i substancja czyszcząca, w ochronie przeciwpożarowej oraz jako dezynfekująca i jak podstawowa substancja w procesie syntezy. Tetrachlorometan jest wszechobecny, w atmosferze, wodzie i ziemi. Okres półtrwania w atmosferze jest oszacowany na 13 lat, w ziemi około 20 lat. Próby na szczurach i myszach udowodniły, że związek ten prowadzi do nowotworu wątroby. Ostra toksyfikacja kończy się zakłóceniami błon śluzowych, euforii, paraliżu oddechu, niewydolności serca i uszkodzeń wątroby i nerek. Na temat jego biodegradacji w literaturze przedmiotu brak danych.

Fluorowe związki alifatyczne

Geny dehalogenazy izolowane były dotychczas przeważnie z drobnoustrojów, zdolnych do metabolizowania chlorowanych lub bromowych związków. Dehalogenaza fluorooctanowa (EC 3.8.1.3) została wyizolowana, ale nie jest do końca poznana. W przeciwieństwie do chloro- i bromooctanu, które były używane z powodzeniem przy wzbogacaniu podłoży dla odpowiednich degradujących bakterii, fluorooctan jest dużo bardziej toksyczny dla większości mikroorganizmów. Może to być spowodowane stabilnością wiązania węgiel-fluor oraz wysoką elektroujemnością jonu fluoru [38].

5.2. Wybrane szlaki degradacji związków aromatycznych

Chlorobenzen

Roczna produkcja chlorobenzenu jest oceniana na 900 000 t, z czego 400 000 t są wydalane do otoczenia. Około 140 000 t całości stanowi monochlorobenzen. W USA produkuje się 50 000 t 1,2-dichlorobenzenu i 1,4-dichlorobenzenu. Żadne dane dotyczące produkcji wyższych chlorowanych benzenów nie są dostępne [23]. Chlorobenzeny mają zastosowanie jako rozpuszczalniki, w procesie syntezy fenoli, aniliny, DDT, środków chwastobójczych, farb.

W chemicznej przemianie chlorobenzenu do fenolu stapia się w ciągu 4 godzin w temp. 400°C wodorotlenek potasu z chlorobenzenem.

Rys. 23. Szlak degradacji chlorobenzenu [39]

Chlorowane benzeny są biodegradowane w taki sposób, jak gdyby podstawniki chlorowe nie były obecne. Dihydrodiol jest przekształcany do chlorokatecholu. Chlor jest usuwany podczas reakcji izomeryzacji albo cyklizacji. Degradacja tri- i tetrachlorobenzenu przebiega podobnie. Dioksygenaza dihydrodiolowa powoduje przekształcenie do katecholu.

Heksachlorobenzen (HCB)

HCB (heksachlorobenzen )jest środkiem grzybobójczym, używanym do ochrony nasion zbóż. Zaproponowano dwa szlaki odchlorowania: (1) główny szlak, w którym 1,3,5-trichlorobenzen (1,3,5-TCB) jest formowany przez pentachlorobenzen i 1,2,3,5-tetrachlorobenzen (1,2,3,5-TTCB) i (2) szlak poboczny, w którym dwuchlorobenzen jest formowany przez 1,2,4,5-TTCB i 1,2,4-TCB.

Rys. 24. Proponowany szlak degradacji HCB z zastosowaniem bakterii tlenowych [40]

Chlorobenzoesany

Chlorobenzoesany nie są produkowane i używane handlowo. Powstają jako półprodukty w kilku szlakach degradacji.

2-chlorobenzoesan

Pierwsza reakcja w degradacji 2-chlorobenzoesanu polega na eliminacji chloru. W tym samym czasie grupa karboksylowa zostaje usunięta i powstaje katechol bez podstawników.

Rys. 25. Tlenowa dehalogenacja 2-chlorobenzoesanu [29]

Reakcja wymaga tlenu i NADH oraz kationów Fe²⁺. Są to kluczowe dane dla dioksygenazy. Enzym jest niespecyficzny, przekształca 2-chlorobenzoesan oraz kilka innych związków [29].

3-chlorobenzoesan

W warunkach tlenowych biodegradacja 3-chlorobenzoesanu przebiega poprzez 3-chlorokatechol, a biochemiczny mechanizm jest porównywany do degradacji katecholu szlakiem orto. W procesie degradacji chlorek jest usuwany podczas izomeryzacji laktonowej. Enzymy dla degradacji chlorokatecholu nie są identyczne z tymi, które są używane przez drobnoustroje przy degradacji katecholu. Niektóre halogenowe związki są degradowane głównie tą drogą.

Rys. 26. Schemat szlaku metabolicznego degradacji 3-chlorobenzoesanu u bakterii

4-chlorobenzoesan

Pierwszym krokiem w biodegradacji 4-chlorobenzoesanu jest dehalogenacja. Enzym katalizujący tę reakcję jest aktywny przy neutralnym pH i temperaturze pokojowej. Enzym wymaga ATP do reakcji i CoASH. Reakcja ta jest hydrolityczną dehalogenacją aromatycznego pierścienia.

Rys. 27. Dehalogenacja 4-chlorobenzoesanu [29]

γ-heksachlorocykloheksan

Rys. 28. Degradacja γ-heksachlorocykloheksanu z zastosowaniem Sphingomonas paucimobilis UT26

PCB - polichlorowane bifenyle

Polichlorowane bifenyle, określane w skrócie jako PCB lub PCBs, to związki syntetyczne [1]. Związki te powstają podczas bezpośredniej reakcji chlorowania bifenyli, w wyniku której tworzy się mieszanina kongenerów, o składzie zależnym od proporcji użytego chloru i bifenylu oraz warunków reakcji [41]. PCB mogą występować w formie 209 kongenerów różniących się liczbą atomów i położeniem chloru w cząsteczce bifenylu.

Polichlorowane bifenyle, jako niepalne ciecze o bardzo dobrych właściwościach dielektrycznych i odporności chemicznej, były masowo produkowane w latach 1950-70 (w latach 60-tych około 100 ton rocznie [42]) i szeroko stosowane jako: podstawowe składniki cieczy izolacyjnych do napełniania transformatorów i kondensatorów, płyny hydrauliczne, dodatki do farb i lakierów, plastyfikatory do tworzyw sztucznych, a także jako środki konserwujące i impregnujące.

Do mikroorganizmów, które wykorzystują PCB i ich produkty pośrednie, należą przede wszystkim bakterie z rodzaju Pseudomonas, Alcaligenes, Comamonas oraz Rhodococcus [43].

Zagadnienie biologicznej degradacji polichlorowanych bifenyli jest tematem licznych publikacji naukowych [43,44,45,46]. Badacze Abramowicz i Olson przeanalizowali szczegółowo możliwości biologicznej degradacji PCB w warunkach tlenowych i beztlenowych.

W warunkach beztlenowych [47] dominuje redukcyjny rozpad wiązań C-Cl. Preferencyjnie usuwane są atomy chloru w pozycjach meta i para powodując, że z wysoko schlorowanych kongenerów PCB powstają kongenery o mniejszej zawartości atomów chloru w przewadze orto-podstawione [48]. Badania amerykańskich naukowców - Abramowicza i Fisha z próbkami szlamu z okolic rzeki Hudson wykazały, że bakterie beztlenowe mogą degradować PCB w dużych stężeniach (około tysiąca ppm). Ta sama grupa naukowców prowadziła również badania porównawcze dotyczące bakterii tlenowych. W warunkach laboratoryjnych otrzymano degradację PCB w stężeniu kilku tysięcy ppm.

W warunkach tlenowej biodegradacji mikroorganizmy włączają cząsteczki PCB w swoje szlaki metaboliczne, przekształcając je w odpowiednie kwasy chlorobenzoesowe, które poprzez reakcję w centralnym szlaku metabolicznym prowadzą do powstawania dwutlenku węgla, wody i chlorków.

O odchlorowaniu danego kongeneru decydują następujące czynniki:

• obecna mikrobowa populacja

• pozycja chloru względem przeciwległego pierścienia fenylu

• otoczenie konfiguracji chloru

• konfiguracja chloru na przeciwległym pierścieniu

• warunki inkubacji [29].

Ogólne reguły dla biodegradacji PCBs:

• stopień degradacji zmniejsza się, gdy obszar chlorowania wzrasta,

• PCBs z jednym nie podstawionym pierścieniem chętniej ulegają rozkładowi niż kongenery z tą samą ilością chlorów na obu pierścieniach fenylowych,

• chlor w pozycji 4' jest w rezultacie bardziej stabilny (i/lub toksyczny) niż produkty uzyskane w rozszczepieniu typu meta.

Rys. 29. Tlenowy kometabolizm PCBs jako przykład biodegradacji w warunkach tlenowych

Dioksyny

Dioksynami nazywa się grupę chloroorganicznych, aromatycznych związków chemicznych, których cząsteczki wykazują wyjątkowo dużą stabilność termiczną i odporność chemiczną na utlenianie oraz procesy degradacji biologicznej. Pełna nazwa tych związków to polichlorowane dibenzoparadioksyny. W skrócie oznaczane są jako PCDDs. Substancje te, co zostało już udowodnione w wielu badaniach toksykologicznych i farmakologicznych należą do silnie toksycznie działających związków chemicznych, które zostały sztucznie wytworzone przez człowieka. Toksyczne działanie dioksyn polega na powolnym, ale skutecznym uszkadzaniu rozmnażających się komórek w organizmach żywych. Substancje te naruszają strukturę dzielącego się DNA. Są więc mutagenami. Udowodniono również ich silne działanie teratogenne (uszkadzają płód) oraz alergiczne.

Za podstawowe źródła emisji PCDFs/PCDDs do środowiska uważa się wszelkie, niekontrolowane procesy spalania odpadów i śmieci, zawierających w swoim składzie chlor związany w jakiejkolwiek formie organicznej lub nieorganicznej. Wszelkie procesy niekontrolowanego spalania odpadów, a w szczególności coraz powszechniej występujące zjawisko spalania śmieci z indywidualnych gospodarstw domowych w piecach węglowych czy po prostu w stosach przed domem, stwarza idealne warunki fizyczne i chemiczne do powstawania dioksyn. Niezwykle intensywnie prowadzone w ostatnich latach badania naukowe nad ograniczeniem emisji dioksyn z procesów spalania doprowadziły do opracowania takich technologii termicznej utylizacji odpadów, że konstruowane obecnie urządzenia - spalarnie emitują dioksyny na poziomie poniżej 0,1 nanograma na 1 normalny metr sześcienny gazów spalinowych (w odniesieniu do tzw. współczynnika toksyczności ), co spełnia już bardzo wygórowane wymagania niskiego poziomu emisji dioksyn, postawione instalacjom do spalania odpadów [49,50]

Rys. 30. Struktura „dioksynopochodnych” kongenerów PCB

Przez długi czas tetrachlorodibenzodioksyny uważano za związek nieulegający rozkładowi. Mimo wielu prac badawczych nie znaleziono bakterii zdolnych do metabolizmu tego związku. Jedynie grzyby z gatunku Phanerochaete chrysosporium były zdolne do jego przekształcania. W ostatnich latach na Uniwersytecie Hamburga (dział Prof. Fortnagela) badano degradację substancji modelowych. Tetrachlorobenzen jak również dibenzendioksyny były degradowane. Atak dioksygenazy kończy się destabilizacją wiązań pomiędzy mostkiem tlenowym i pierścieniem węgla. Teoretycznie taka reakcja mogłaby być możliwa z TCDD, ale wszystkie bakterie izolowane dotychczas, nie mogą przekształcać tych związków.

Dr Rast (Bayer) informował, że w grudniu 1991 wyizolował bakterie, zdolne do redukującej dehalogenacji TCDD. Izolacja tego gatunku została przeprowadzona z użyciem pentabromodibenzendioksyn, nietoksycznego związku, który jest używany jak środek przeciwpożarowy. Jako węgla źródła został zastosowany octan. Wyniki nie zostały dotychczas opublikowane.

Pentachlorofenol

Jego odchlorowanie zachodzi zarówno w warunkach tlenowych i beztlenowych. Prawdopodobnie szlak z wykorzystaniem Flavobacterium sp. zachodzi w warunkach beztlenowych. Często tri-i tetrachlorofenole gromadzą się w środowisku beztlenowym, ale kompletna redukcja do fenolu jest wspólna. Przy wysokiej koncentracji jednakże, PCP jest inhibitorem do metanogenezy (prawdopodobnie z powodu utleniającej reakcji fosforylacji). Typowy proces odchlorowania zachodzi najpierw w pozycji para i orto, a na końcu w pozycji meta wg schematu para >orto > meta.

Rys. 31. Przykład mechanizmu degradacji 2,4,6-trichlorofenolu (R=H) i penatchlorofenolu (R=Cl)w procesie utleniania (oksydacji) przez peroksydazy i lakkazy

Badania pokazały, że pierwszy enzym, który zamienia PCP do tetrachlorohydrochinonu, wymaga NADPH i tlenu (jest to prawdopodobnie oksygenaza).

Rys. 32. Reakcja dehalogenazy PCP [29]

W warunkach beztlenowych został odkryty inny szlak degradacji. Atomy chloru są rozszczepiane jeden po drugim i końcowym produktem jest fenol. Metabolity tego procesu były znajdowane na polach ryżowych. Nie znaleziono do tej pory odpowiedzialnych za ten proces bakterii i enzymów.

Halogenopochodne aniliny

Halogenopochodne aniliny pod wpływem czynników środowiska naturalnego i przy udziale mikroorganizmów głównie mogą być transformowane na drodze kondensacji, N-acylacji lub hydroksylacji z jednoczesną eliminacją NH₃ [51,52,53].

Rys.33. Główne reakcje biotransformacji halogenopochodnych aniliny:

a - kondensacja; b - N-acylacja; c - hydroksylacja

Mimo, że chlorowcopochodne aniliny są zazwyczaj odporne na działanie mikroorganizmów, opisano kilka szczepów zdolnych do ich mineralizacji [51,54,55,56,57]. Z wyjątkiem Phanerochaete chrysosporium, we wszystkich opisywanych przypadkach inicjacja procesu biodegradacji związana jest z utworzeniem odpowiednich chlorokatecholi, w wyniku dioksygenacji substratu z jednoczesną eliminacją grupy aminowej. Reakcję prawdopodobnie katalizuje 1,2-dioksygenaza. Dalsze losy utworzonych chlorokatecholi mogą być różne i zależą od ich chemicznej budowy i od rodzaju mikroorganizmu, które je dalej degraduje.

Rys. 34. Inicjacja biodegradacji halogenopochodnych aniliny

Na przykład wykazano, że szczep Moraxella sp. wykorzystuje 4-chloroanilinę (ale także 4-bromo i 4-fluoroanilinę) jako jedyne źródło węgla, azotu i energii [57]. Oksygenaza pochodząca z tego szczepu, wykazująca szeroką specyficzność substratową, katalizuje m.in. przemianę 4-chloroaniliny do 4-chlorokatecholu, który dalej jest degradowany zmodyfikowanym intradiolowym szlakiem katecholowym (orto-rozszczepienie pierścienia aromatycznego) [58]. Kolejne reakcje i enzymy występujące w tym szlaku wydają się być analogiczne do tych, które zostały ustalone dla mineralizacji benzenu poprzez katechol u tych bakterii [59] i są podobne do przedstawionych na rys 35.

Rys. 35. Biodegradacja 3,4-dichloroaniliny intradiolowym szlakiem katecholowym u Pseudomonas putida

Również u innych szczepów bakterii z rodzaju Pseudomonas inicjacja mineralizacji chloropochodnych aniliny przebiega przez powstanie odpowiednich chlorokatecholi i ich dalszej biodegradacji przez intradiolowe rozszczepienie pierścienia aromatycznego pod działaniem 1,2-dioksygenazy katecholowej. Jednakże znaleziono u nich odmienną, od opisanej powyżej, drogę dalszych przemian chloromukonianu, charakterystyczną dla Pseudomonas sp. B13 znanego z biodegradacji chloropochodnych katecholu (rys.20) [60,61,62,63].

Rys. 36. Biodegradacja 4-chloroaniliny intradiolowym szlakiem katecholowym charakterystycznym dla Pseudomonas sp. B13

Fluorowe związki aromatyczne

Tlenowy rozkład biologiczny halogenowych związków aromatycznych jest dobrze poznany w przypadku florobenzoesanów [1,2]. Generalna zasada biodegradacji polega na tym, że siła oporu na enzymatyczne rozszczepienie wiązania węgiel-halogen wzrasta z elektroujemnością podstawnika, wg reguły F-C > Cl-C > Br-C > I-C [6]. Wyjątkowa biologiczna aktywność fluorowych związków aromatycznych może być wyjaśniona przez chemiczne zachowanie fluoru i wodorem, będące podobnego rozmiaru [7].

Są dwa szlaki biodegradacji. Jeden obejmuje degradację kwasów fluorobenzoesowych do odpowiedniego fluorokatecholu [2,7], w drugim szlaku kwas fluorobenzoesowy jest przekształcany do kwasu hydroksybenzoesowego [2]. Poniżej (rys. 37) została pokazana biotransformacja kwasu 4-fluorocynamonowego (4-FCA) do kwasu 4-fluorobenzoesowego (4-FBA). Proces ten zachodzi w warunkach tlenowych [10,11].

Rys. 37. Szlak biodegradacji 4-FCA [64]

7. Podsumowanie

W pracy zostały przedstawione mechanizmy biodegradacji i biotransformacji halogenowych związków organicznych, zarówno alifatycznych jak i aromatycznych. Są to związki trudne do utylizacji, o długim okresie półtrwania i często o działaniu toksycznym dla człowieka i środowiska.

Zdarza się, że toksyczny produkt, np. DDT w wyniku biodegradacji, rozpada się na półprodukty o wiele bardziej toksyczne od związku wyjściowego. Dlatego właśnie tak ważne jest znalezienie odpowiednich sposobów degradacji.

Najlepiej zbadaną grupą halogenowych związków stanowią chlorowcopochodne, zwłaszcza PCB traktowane jako modelowy przykład degradacji halogenopochodnych.

Polichlorowane bifenyle i pokrewne im związki są substancjami szczególnymi, którym poświęcono odrębną dyrektywę Unii Europejskiej. Zgodnie z nią musi spełniać wszelkie wymogi dyrektyw Unii Europejskiej w sprawie odpadów (75/442/EEC), odpadów niebezpiecznych (91/689/EEC) i spalania odpadów niebezpiecznych ( 94/67/EC ).

W Europie najważniejszą i najdalej idącą regulacją prawną o PCBs i pokrewnych im związkach jest dyrektywa 96/59/EC z 16 września 1996 r. Jej celem jest stworzenie i wyegzekwowanie jednolitej legislacji zapewniającej skuteczną metodę kontroli zaprzestania stosowania oraz bezpiecznego dla przyrody składowania PCBs i pokrewnych im związków.

Polichlorowane bifenyle oraz urządzenia i produkty zawierające te substancje są w krajach UE obiektem skrupulatnej inwentaryzacji i muszą być zniszczone w sposób bezpieczny dla środowiska do końca 2010 roku [65].

Według Niemieckiego Ministerstwa Zdrowia (BGA) oraz Niemieckiego Federalnego Biura ds. Środowiska (UBA): "...ponieważ halogenowane plastiki (przede wszystkim PCW oraz tworzywa zawierające bromopochodne substancje przeciwzapalające) mogą prowadzić do emisji dioksyn w przypadku pożaru, podczas recyklingu i składowania, zaleca się, aby w miejscach narażonych na pożary całkowicie wyeliminować stosowanie tworzyw sztucznych zawierających chlor i brom, na ile to jest możliwe. UBA oraz BGA proponują zakaz stosowania chloru i bromu w przyrządach narażonych na działanie ognia oraz w produkcji płyt wiórowych, a także znakowanie tworzyw zawierających związki chloru, a jeżeli to okaże się niezbędne - zakaz stosowania PCW do produkcji opakowań." [66]

Podobnie wygląda sytuacja z fluoropochodnymi, dotyczy to danych niemieckich (publikacje uniwersyteckie, raporty Greenpeace).

8. Literatura

[1] Nowa Encyklopedia Powszechna PWN http://encyklopedia.pwn.pl/22134_1.html

[2] Report on Greenpeace e.V. Hamburg

Authors: Dr. Winfried Schwarz; Dr. André Leisewitz `No "all-clear" for ozone and climate. 1995 German consumption forecast for CFCs, HCFCs and HFCs

[3] http://www.ub.rug.nl/eldoc/dis/science/g.j.poelarends/c1.pdf

[4] http://iatms10.iatm.tuwien.ac.at/~etca/events/Darmstadt/papers/hylckama.doc Microbial Adaptation to Degradation of Natural and Synthetic Organohalogens: Effects on Ecosystem Ac­climation and Natural Bioremediation of Polluted Sites, Project ENV4-CT95-0086

[5] http://water.usgs.gov/wrri/00grants/NMaquifers.pdf

[6] http://www.ub.rug.nl/eldoc/dis/science/g.h.krooshof/c1.pdf

[7] http://www.frtr.gov/matrix2/section2/2_4.html

[8] http://strony.wp.pl/wp/ekoprobl/ozon.htm

[9] http://www.ub.rug.nl/eldoc/dis/science/g.j.poelarends/c1.pdf

[10] „Źródła związków chloroorganicznych zanieczyszczających środowisko”, M. Chudzik, A. Żarczyński, 4-Aura 1/2002

[11] http://water.usgs.gov/wrri/00grants/NMaquifers.pdf

[12] Appl Microbiol Biotechnol (1996) 45: 710-718

F. J. M. Verhagen á H. J. Swarts á T. W. Kuyper

J. B. P. A. Wijnberg á J. A. Field

The ubiquity of natural adsorbable organic halogen production

among basidiomycetes

[13] http://www.frtr.gov/matrix2/section2/2_4.html

[14] Latorre J., Reineke W., Knackmuss H.J., (1984), Arch. Microbiol. 140, 159-165

[15] You J-S., Bartha R., (1982), J. Agric. Food Chem. 30, 274-277

[16] Bernes C.: Persistent Organic Pollutants. A Swedish View of an International Problem. Swedish Environmental Protection Agency, Monitor 16, 1998

[17] Vallack H.W., Bakker D.J., Brandt I., Broström-Lundén E., Brouwer A., Bull K.R., Gough C., Guardans R., Holoubek I., Jansson B., Koch R., Kuylenstierna J., Lecloux A., Mackay D., McCutcheon P., Mocarelli P., Taalman R.D.F.: Controlling persistent organic pollutants - what next ? Environ. Toxicol. Pharmacol. 1998, 6, 143-175

[18] Andersen M.E., Conolly R.B., Faustman E.M., Kavlock R.J., Portier C.J., Sheenan D.M., Wier P.J., Ziese L.: Quantitative mechanistically based dose-response modelling with endocrine-active compounds. Environ. Health Perspect. 1999, 107, Suppl. 4, 631-638

[19] Ashby J., Houthoff E., Kennedy S.J., Stevens J., Bars R., Jekat F.W., Campbell P., Van Miller J., Carpanini F.M., Randall L.P.: The challenge posed by endocrine-disrupting chemicals, Environ. Health Perspect., 1997, 105, 164-169

[20] Bigsby R., Chapin R.E., Daston G.P., Davis B.J., Gorski J., Grey E.L., Howdeshell K.L., Zoeller R.T., vom Saal F.S.: Evaluating the effects of endocrine disruptors on endocrine function during development. Environ. Health Perspect. 1999, 107, Suppl. 4, 613-618.

[21] Struciński P., Góralczyk K., Ludwicki J.K.: Abiotyczne i biotyczne przemiany persystentnych związków chloroorganicznych w środowisku. Roczn. PZH 1995, 46, 279-292

[22] APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY,Jan. 1998, p. 112-118 Vol. 64, No. 1 Rhizoremediation of Trichloroethylene by a Recombinant, Root-Colonizing Pseudomonas fluorescens Strain Expressing, Toluene ortho-Monooxygenase Constitutively

[23] http://www.igo.katowice.pl/bazy/techzag/tz0025.html

[24] http://www.igo.katowice.pl/bazy/techzag/tz0028.html

[25] http://www.igo.katowice.pl/bazy/techzag/tzTE0B.html

[26] Shegel H.G. ”Mikrobiologia ogólna”, Warszawa, PWN, 1996, 527-531

[27] http://www.wiley-vch.de/books/biotech/pdf/v11b_aero.pdf

[28] ] http://www.mrw2.interscience.wiley.com/

[29] http://www.engr.uconn.edu/

[30] Ecobichon, D. J. Toxic effects of pesticides. In Casarett and Doull's Toxicology, Fourth Edition. Amdur, M. O., Doull, J. and Klaassen, C. D., Eds. Pergamon Press, New York, NY, 1991.7-4

[31] http://134.67.99.14/ncer/final/grants/94/bio/haggblom.html

[32] http://www.vyh.fi/eng/orginfo/publica/ber/monogr/berm9.htm

[33] http://www.egr.uh.edu/CIVE/symons/Research3.html

[34] http://www.mrw2.interscience.wiley.com/enviroglobe/etech/2000technologies.htm

[35] http://www.cfr.washington.edu/Classes.ESC.518/Lectures/MicroMOs.pdf

[36] http://www.nwmp.sandia.gov/itrd/ftp/dnapl_model_poster.pdf

[37] http://www.clu-in.org/PRODUCTS/Phytotce.htm

[38]http://www.hku.hk/botany/staff/tsang.html#R2

[39] http://cisat.isciii.es/bt/atsdr/profiles/Chlorobe.pdf

CHLOROBENZENE ATSDR Toxicological Profiles, Copyright 1999, CRC Press LLC

[40] http://es.epa.gov/ncer/final/grants/94/bio/haggblom.html

[41] M. Rutkowski, E. Beran, International Coonference on Analysis and Utilization of Oily Wastes, AUZO `96

[42] S. Srinivas, L. Lakshmi, N. Lingaiah, P. Prasad, P. Kanta Rao, Appl. Catal.A-Gen.,1996, 135, 201

[43] D. Abramowicz, D. Olson, Chem. Tech., July 1995, 36

[44] R. Sokol , C. Bethoney, G. Rhee, Water. Res., 1995, 29, 45

[45] A. Bokvajova, J. Burkhard, K. Demnerowa, J. Pazlarova, Environ. Health Persp., 1994, 102, 552

[46] P. Larsson, K. Lemkemeier, Water. Res. 1989, 23, 1081

[47] A. Rosińska,. W. Sułkowski, Instytut Inżynierii Środowiska, Politechnika Częstochowska, „Źródła występowania i metody identyfikacji polichlorowanych bifenyli w środowisku”, Chemik,7-8 (1996 )

[48] St. Grylewicz, “Degradacja polichlorowanych difenyli”, Wiadomości Chemiczne, 54 (2000), 5-6

[49] Karasek F.W., Naikwadi K.P. "Dioxin Inhibition Test at Swiss Waste to Energy Incinerator" 14th International Symposium on Chlorinated Dioxins and Related Compounds, Kyoto, Japan, November 1994 Precidings Vol 19, pp315-320.

[50] Lindbauer R.L., Wurst F., Pry Th. "PCDD/F emission Control For MSWI By SO3 Addition" FTU and Technical University, Viena, Austria. "Dioxin'94" 14th International Symposium on Chlorinated Dioxins and Related Compounds, Kyoto, Japan, November 1994 Precidings Vol 19, pp355-360

[51] You J-S., Bartha R., (1982), J. Agric. Food Chem. 30, 274-277

[52] Andreoni V., Baggi G., Bernasoni S., (1995), Progress in industrial microbiology vol.32, 1-35

[53] Bollog J-M., (1974), Adv. Appl. Microbilol. 18, 75-114

[54] Latorre J., Reineke W., Knackmuss H.J., (1984), Arch. Microbiol. 140, 159-165

[55] Surovtseva E.G., Vasileva G.K., Volnova A.I., Baskunov B.P., (1980), Dokl. Akad. Nauk SSSR 254, 226-230

[56] Surovtseva E.G., Volnova A.I., (1980), Microbiologiya 49, 351-354

[57] Zeyer J., Kearney P.C., (1982), Pest. Biochem. Physiol. 17, 215- 223

[58] Zeyer J., Vasserfallen A., Timmis K.N., (1985), Appl. Environ. Microbiol. 50, 447-458

[59]. Högn T., Jaenicke L., (1972), Eur. J. Biochem. 30, 369-375

[60] Kaufman D.D., Plimmer J.R., Iwan J., Klingebiel U.I., (1972), J. Agric. Food Chem. 20, 916-919

[61] Schmidt E., Knackmuss H.-J., (1980), Biochem. J. 192, 331-337

[62] Schmidt E., Knackmuss H.-J., (1980), Biochem. J. 192, 339-347

[63] Reineke W., Knackmuss H.-J., (1980), J. Bacteriol. 142, 467-473

[64] Analytica Chimica Acta 454 (2002) 137-145 Biodegradation studies of 4-fluorobenzoic acid and 4-fluorocinnamic acid: an evaluation of membrane inlet mass spectrometry as an alternative to high performance liquid chromatography and ion chromatography

[65] W. Gurgacz, „Polichlorowane bifenyle a oleje przepracowane”, Chemik 2 (1997)

[66] W. Bachmann, H. Clarke, J. Am. Chem. Soc., 1927, 49, 2089, 8

1

56

1,1-DCA

1,1-DCE

TCE

PCE

1,1,1-TCA

c-1,2-DCE

t-1,2-DCE

1,2-DCE

chloroetan

chlorek winylu

---