PCR (7)

temperaturze amplifikuje się „właściwy” produkt w małej liczbie kopii, ponieważ jest to temperatura najbardziej „wymagająca”. W pozostałych cyklach przy obniżonej temperaturze startery łatwiej przyłączają sic do powstałego produktu. Wydajność takiej reakcji jest niższa niż reakcji standardowej, ale pozwala otrzymać żądany produkt.

4.5. Oczyszczanie produktów PCR

Jeśli produkt PCR ma być poddany trawieniu enzymami restrykcyjnymi lub gdy chcemy stwierdzić obecność mutacji punktowych metodą SSCP lub HD, to musimy się upewnić, żc jest on całkowicie homogenny. W przypadku niespecyficznej amplifikacji możemy otrzymać więcej niż jeden produkt. Rzadko jest to wynikiem zanieczyszczenia (kontaminacji) matrycy użytej w reakcji PCR. Częściej jest spowodowane źle dobranymi warunkami reakcji (zbyt niska temperatura hybrydyzacji starterów lub nadmiar chlorku magnezu) lub niespecyficznych starterów. Jeśli analizie wykrywania mutacji punktu wych poddany zostanie nie tylko właściwy fragment, ale również amplifikowany wraz z nim fragment niespecyficzny, to wyniki mogą być nieczytelne lub błędnie interpretowane.

Oczyszczanie produktu amplifikacji bezpośrednio z mieszaniny reakcyjnej pozwala na usunięcie nadmiaru starterów i innych pozostałych po reakcji substratów, ale nie spowoduje to usunięcia produktów niespecyficznych. Chcąc przeprowadzić selektywne oczyszczanie produktów amplifikacji. należy je wcześniej poddać elektroforezie, tak żeby można było zdecydować, który z dwóch lub większej liczby uzyskanych fragmentów jest właściwym produktem. Jeśli długość amplifikowanych fragmentów jest większa niż 100 pz, to elektroforezę przeprowadza się w żelach agarozowych, jeśli amplifikowane ..właściwe" fragmenty są krótsze bądź istnieje podcjr/.cnie, że amplifikowane niespecyficzne fragmenty mają długość zbliżoną do „właściwych", to elektroforezę należy przeprowadzić w żelu poliakryloamidowym. Po przeprowadzonej elektroforezie i wizualizacji fragmentów „właściwy" fragment można wyciąć / żelu i pozyskać go na drodze elucji metodą enzymatyczną z wykorzystaniem złóż selektywnie przepuszczalnych. Metoda taka daje gwarancję otrzymania zamplifikowanego fragmentu o wysokiej czystości (rys. 7).

Wykorzystanie podczas ekstrakcji enzymów rozpuszczających agarozę przyspiesza proces oczyszczania. Wadą oczyszczania produktu PCR z żelu jest zmniejszenie jego stężenia, należy więc pamiętać aby przed ekstrakcją umieścić w żelu jak największą objętość produktu.

Rysunek 7. Klektroforegramy produktów PCR przed cliicją i po elucji.

(nałożenie 25 pl produktu + 3 pi buforu), b - produkt amplifikacji po wymyciu - elucji (nałożenie 5 ul ' I pl bufoni). W obu przypadkach zastosowano standard masy (SM) pUCMIX 8 (Fermentas), długość fragmentów w kolejności od góry: 1110, S83. 692. 501 - 498.404. 331.242. 190. 147 pz (fot. Z. Nowak)

— 33 —