02

zlokalizowany na chromosomie 3, locus D3S1283. Do tego celu użyć pary starterów o sekwencji: 5'-GGC AGT ACC ACC TGT AGA AAT G-3' i 5'-GAG TAA CAG AGG CAT CGT GTA TTC-3'. Reakcję prowadzić w sposób standardowy w objętości 20 pi, biorąc jako matrycę 50 ng genomowego DNA limfocytów ludzkich, stosując temperaturę asocjacji starterów 60°C i powtarzając proces 25 razy.

Odczynniki:

1)    Roztwór 0,35 M NaCl - 5 mM EDTA - 1 mM DTT - 10 mM bufor HEPES (kwas N-2-hydroksy-etylo-l-pipcrazyno-2-etanosulfonowy, pH 7,5) zawierający PMSF (0,2 mM) i antypainę (10 gg/gl).

2)    Roztwór 20 mM Tris/HCl (pH 7,5) - 2 mM DTT - 2 mM EDTA - 10% glicerol.

Wykonanie:

1.    Wiązanie specyficznych białek ekstraktu jądrowego z unikatową sekwencją fragmentu wybranego mikrosatelitamego DNA. Proces wytworzenia kompleksu DNA-białko należy przeprowadzić w końcowej objętości 25 pl, biorąc 10 pl produktu PCR (materiał 2), 2,5 pi białkowego ekstraktu jąder komórkowych (materiał 1) i 12,5 pl odczynnika 2. Mieszaninę inkubować (w temp. pokojowej przez 30 min).

2.    Rozdział elektroforetyczny. Elektroforezę w 2,5% żelu agarozowym należy przeprowadzić w standardowych warunkach (ćw. 10.36). Próbki do elektroforezy

—    o końcowej objętości 15 pl — przygotować w taki sposób, aby w pierwszej znalazło się 5 pl produktu PCR (wolny fragment mokrosatelitarnego DNA), w drugiej — 12 pl roztworu po utworzeniu kompleksu DNA-białko, a w trzeciej

—    wzorzec długości fragmentów DNA (rys. 10.1). Po zakończonym rozdziale żel wybarwić roztworem bromku etydyny i obejrzeć na transluminatorze UV (ultraviolet).

1    2    W

Rys. 10.1. Schemat rozdziału elektroforety-cznego: 1 — DNA oraz 2 — swoistego kompleksu DNA-białko. W — wzorzec wielkości cząsteczek polideoksyrybonukleo-tydów

392