0 7

segmentów łącznikowych — J (junction) i segmentów stałych C (constant). W trakcie rozwoju pierwotnych komórek pnia do stanu w pełni dojrzałych limfocytów B następuje stopniowe przebudowywanie genomu tych komórek, oparte na specyficznych mechanizmach rearanżacyjnych. Ostatecznie procesy te doprowadzają do wytworzenia ciągłej struktury aktywnych genów immunoglobulinowych, z sekwencją regionów V-J-C. Przypadkowość wyboru określonych segmentów (z poszczególnych zbiorów) w trakcie rearanżacji gwarantuje niewiarygodną różnorodność (I0ⁿ-10¹⁸) ostatecznych form genowych, odpowiedzialną za unikatowość białek immunoglobulinowych syntetyzowanych przez różne limfocyty B.

Analiza DNA poprzez mapowanie metodą Southcrna wykrywa geny immuno-globulinowe o strukturze typowej dla komórek linii zarodkowych jedynie w tkance niclimfoidalnej. W obrębie poliklonalnej populacji limfocytów, które normalnie krążą we krwi obwodowej, geny te są już przebudowane, ale ich szczegółowa identyfikacja jest niemożliwa z powodu olbrzymiej różnorodności form porcaran-żacyjnych (zamiast obrazu prążkowego widoczne jest smużenie — smear). Dopiero kiedy w populacji limfocytów wystąpi duża liczba komórek o identycznym obrazie rearanżacyjnym, staje się możliwe uwidocznienie tego charakterystycznego wzoru. Praktycznie jest tak w przypadku monoklonalnej proliferacji komórek, typowej dla dtłoniaków i białaczek. A więc wykrycie w badanym materiale określonej rearan-żacji genów immunoglobulinowych (najczęściej dla łańcucha ciężkiego p lub dla łańcuchów lekkich k i ż) wskazuje na B-pochodny rozrost nowotworowy.

Materiał: DNA wyizolowany z prawidłowych limfocytów ludzkich oraz / komórek chłoniaka H-komórkowcgo (po ok. 20 pi roz.tworu wodnego o stężeniu 1 pg/pl) (patrz. ćw. 10.1).

Odczynniki:

1)    Enzym restrykcyjny //iru/III (10 U/p.1).

2)    Odpowiedni 10 x bufor do trawienia (firmy Promcga).

3)    Sonda J„ (joining segment of hcavy chain) sonda molekularna komplementarna do segmentów łącznikowych genu kodującego ciężki łańcuch immunoglobulinowy dwuniciowa, o długości 3300 pz, wyznakowana za pomocą ³²P do radioaktywności właściwej > 10® cpm/pg (firma Oncor, USA).

•t) Roztwór Denhardta: 10 g 100 x Picoll 400; 10 g poliwinylopirolidon; 10 g BSA; H,0 do 500 ml.

5)    10 x bufor TBK: 242 g Tris; 55 g H,BO,; 40 ml 0.5 M EDTA (pH 8.0 ). HjO do 1000 ml.

6)    Roztwór do denaturacji: 1,5 M NaĆl - 6,5 M NaOH.

7| Roztwór do neutralizacji: 1 M Tris/HCI (pH 8,0) - 1,5 M NaCł.

8)    Mieszanina hybrydyzacyjna: 50% formamid - 4 x SSC' - 1% SDS - 1 mM EDTA (pH 8,0) -10 x roztwór Denhardta - 10% siarczanu dekstranu - czynnik blokujący (firmy Amcrsham).

9)    Roztwór do płukania: 2xSSC - 0,1% SDS.

Wykonanie:

1.    Trawienie enzymem restrykcyjnym genomowego DNA (ćw. 10.36). W tym celu pobrać po 20 ul obu rodzajów DNA, dodać po 3 p.1 10 x buforu do trawienia, po 3 pl enzymu restrykcyjnego Hindlll i uzupełnić wodą do 30 \i\. Trawienie prowadzić w temp. 37°C przez 5 godz.

2.    Elektroforeza rozdzielcza fragmentów restrykcyjnych (ćw. 10.37). Na 0,9% żel agarozowy (o długości min. 20 cm) przygotowany w buforze TBE z dodatkiem bromku etydyny — nanieść po 20 ul próbek strawionego DNA, zmieszanego

457