Bez tytułu3 2

Mimo wielu zalet, klasyczne sferoidy komórkowe nie są modelem idealnym. W celu udoskonalenia tego układu hodowlanego wykonuje się sferoidy złożone z conajmniej dwóch różnych rodzajów komórek. Ponadto, przeszczepia się je zwierzętom laboratoryjnym, aby określić zależności in vitro - in vivo lub wykonuje się kokultury sferoidów rosnących na jednolitych warstwach (monoiayer) innych komórek, np. komórek śródbłonka w badaniach mechanizmów przerzutu nowotworowego lub funkcji mikrokapilar naczyniowych w guzach

Materiały:

Hodowla komórkowa w butelce Falcon PBS bez jonów Ca¹* i Mg^2H

Komora Thoma-Zeiss ze szkiełkiem nakrywkowym 10% MEM

0,25% roztwór trypsyna-EDTA Płytka 96-dołkowa I % roztwór agarózy w 0,85% NaCI Płytki Petriego (3,5 cm)

Wytrząsarka obrotowa Butelki Parkera (100 ml)

rie i automatyczne pipety

Wykonanie:

Metoda 1

Itłuszczenia komory Thoma Ttóbówki

Łlfobi. 0,2 cm³) nasączone płynem hodowlanym i Zakładanie sfefói^QwJ^i^^l._

Strypsynować    ^w 10 ml 10% płynu MEM Policzyć

na komorze Thoma ilość komórek^i przenieść po $ ml zawiesiny do szalek Petriego Szalki umieścić w inkubatorze (37°C, 5%C02)'na wytrząsarce. Hodowlę prowadzić przez 4 dni w trakcie, których utworzone zostają sferoidy.

Metoda 2:

Rozpuścić 1% agar podgrzewając go Przenieść ogrzaną pipetą (2 ml) po 2 krople agaru do każdego dołka płytki 96-dołkowej. Strypsynować hodowlę komórkową i zawiesić ją w 5 ml 10% MEM. Policzyć na komorze Thoma ilość komórek. Rozcieńczyć policzoną zawiesinę do gęstości IkIO⁴ kom./ml. W doświadczeniu wykorzystane zostanie 20 ml przygotowanego rozcieńczenia. Przenieść po 200 pi zawiesiny do dołków płytki 96-dołkowej, pokrytych agarem. Po 4 dniach hodowli w inkubatorze (37^aC, 5%C02) utworzone zostaną sferoidy o średnicy, ok. 500 pm.

1

Zakładanie hodowli komórkowej na dyskach Spongostanu®