CCF20130405008

3 #

‘CZĘŚĆ PRAKTYCZNA

3. WYKRYWANIE CUKRÓW

3.1. Wykrywanie rybozy - próba Biała

W próbie Biała stosuje się odczynnik Biała, czyli 0,5 % roztwór orcyny w stężonym (37 %) kwasie solnym (HCI). Pentozy i fosfopentozy występujące w nukleotydach purynowych, lecz nie pirymidynowych, podczas ogrzewania z odczynnikiem Biała tworzą furfural. Próba opiera się zatem na reakcji odpowiedniej pochodnej furfuralowej z orcyną. Z kolei orcyna w roztworze zawierającym FeCl3 tworzy produkt kondensacji o barwie niebiesko-zielonej (w przypadku pentoz) lub żołtobrązowej (w przypadku heksoz). W tych warunkach deoksyryboza reaguje 10-krotnie słabiej niż ryboza, dlatego odczyn barwny dla DNA nie występuje. Odczyn Biała może zatem stanowić podstawę oznaczeń ilościowych rybozy w materiale biologicznym np. rybozy powstałej w wyniku hydrolizy kwasów nukleinowych. Służy także do odróżniania pentoz od heksoz..

HO    ⁰    O

HO

CH

o 7

KWASY NUKLEINOWE

O C H

+ 2

OH

CH,

CH,

h₃c

furfural

orcyna    niebiesko-ziefony produkt kondensacji

Rys. 7.6 Schemat kondensacji związku furfuralowego z orcyną

ODCZYNNIKI: hydrolizat RNA, odczynnik Biała (0,5 % roztwór orcyny w stężonym (37 %) HCI)

WYKONANIE:

1.    Do probówki zawierającej 1 ml odczynnika Biała dodać kilka kropel FeCI₃ i 0,5 ml hydrolizatu RNA a następnie ogrzać do wrzenia.

2.    Obserwujemy njebiesko-zielone zabarwienie, charakterystyczne dla pentoz.

3.2. Wykrywanie deoksyrybozy - metoda Dischego

Podstawa teoretyczna: Deoksyryboza ogrzana w środowisku stężonego kwasu siarkowego oraz octowego tworzy aldehyd hydroksylewulinowy, który reagując z difenyloaminą tworzy kompleks barwy niebieskiej. Metoda Dischego pozwala odróżnić kwas DNA od RNA, ponieważ RNA nie tworzy kompleksu barwnego w tych warunkach, podobnie jak deoksyryboza związana z zasadami pirymidynowymi.

CH.OH ' 0 OH h^h hh OH H	H,$0* CH.COOH	H 0 C CH, CH, + C 0	H N	kompleks barwy niebieskiej
		CH2OH n
deoksyryboza	aldehyd oj-bydroksylewulinowy		difenyloamina

Rys. 7.7 Schemat reakcji Dischego

169]