scan0154

246

Wielu autorów podkreśla duże perspektywy dla hodowli komórek zwierzęcych. Może być ona efektywna, metodą uzyskiwania wielu cennych substancji, zwłaszcza o znaczeniu medycznym.

Inną techniką prowadzącą do otrzymywania tych produktów jest wykorzystanie informacji genetycznej z rosnących komórek zwierzęcych i przeniesienie jej do komórek mikroorganizmów, których hodowla jest znacznie łatwiejsza.

19,2. Hodowle komórek roślinnych

Hodowle komórek roślinnych mają bardzo duże znaczenie dla agrotechniki i badań biologicznych. Ich praktyczne zastosowanie dla produkcji preparatów chemicznych lub biologicznych praktycznie nie wyszło poza badania laboratoryjne. Możliwe jest w przyszłości znaczne szersze wykorzystanie hodowli komórek roślinnych do otrzymywania różnorodnych produktów metabolizmu roślin. W Japonii już obecnie tą metodą produkuje się farmaceutyki.

W odróżnieniu od zwierząt, rośliny stanowią organizmy o znacznie mniejszym stopniu skoordynowania różnych organów i tkanek, dzięki czemu można stosunkowo łatwo otrzymywać hodowlę tkanek roślinnych in yitro, a także otrzymywać z hodowli tkankowych, jak i pojedynczych komórek rośliny.

Zdolność komórek roślinnych do dzielenia się i odtwarzania całego organizmu określa się mianem totipotencji. Stanowi ona o głównych sukcesach i zastosowaniach hodowli komórek roślinnych.

Materiałem zapoczątkowującym hodowlę komórek roślinnych jest eksplant czyli kawałek tkania roślinnej otrzymany z żywej rośliny. Eksplant może być pobrany z dowolnej części rośliny. Najlepsze efekty uzyskuje się stosując komórki szybko rosnące. Eksplant jest przemywany tak, aby uzyskać komórki wolne od infekcji. Po przeniesieniu na odpowiednie stałe podłoże hodowlane, uzyskuje się po ok. 1-2 tygodniach utworzenie tzw. kalusa - narośli niezróż-nicowanych komórek. Kolejnym etapem jest oddzielenie tkanki kalusowej od macierzystego eksplantu i przeniesienie jej do świeżego podłoża.

Pożywki stosowane do hodowli komórek roślinnych są prostsze od tych stosowanych do hodowli komórek zwierzęcych. Zawierają sole nieorganiczne, źródła węgla i azotu oraz różne hormony roślinne. Skład pożywek ma duży wpływ na rozwój tkanki kalusowej oraz hodowlę komórek w zawiesinie.

Zmieniając skład pożywki hodowlanej można uzyskać zróżnicowanie tkanki kalusowej i odtworzenie macierzystej rośliny. Technika ta jest często stosowana w badaniach biologicznych oraz w doskonaleniu odmian roślin hodowlanych. Duże korzyści przynosi zastosowanie fuzji protoplastów, tzn. komórek pozbawionych ścian komórkowych. Jest to bardzo efektywna metoda uzyskiwania nowych odmian roślin o pożądanych cechach.

Kalus rośnie wolno. Szybszy przyrost komórek można uzyskać prowadząc hodowlę w zawiesinie. Uzyskuje się ją przez przeniesienie kalusa do roztworu pożywki i mechaniczne rozdrobnienie, np. w wyniku mieszania płynu.

Hodowle prowadzone są w skali laboratoryjnej, np. we wstrząsarkach. W większej skali stosuje się typowe fermcntory z mieszaniem mechanicznym. Szybkości obrotów mieszadła są mniejsze niż dla hodowli mikroorganizmów. Również natężenia przepływu powietrza są mniejsze. Podejmowano także próby wykorzystania fermentorów z mieszaniem powietrzem typu air-lift. Temperatury hodowli wynoszą zwykle 25-27°C.

Stężenie komórek jest istotnym czynnikiem wpływającym na wzrost w hodowlach komórek roślinnych. Istnieje pojęcie minimalnego efektywnego stężenia komórek (lub minimalnej efektywnej gęstości od angielskiego MED -minimal effcctive density), poniżej którego wzrost jest zahamowany. Wartość ta waha się w zakresie 10³— 10⁵ komórek na cm³ i zależy od typu komórek i svarunków hodowli. Przy niskim stężeniu następuje zaburzenie równowagi między metabolitami syntetyzowanymi i wydzielanymi do środowiska.

Techniki stosowane do hodowli komórek roślinnych w zawiesinie są zbliżone do technik stosowanych w hodowli drobnoustrojów. Występują jednak pewne zasadnicze różnice między tymi dwoma typami hodowli:

-    komórki roślinne rosną bardzo wolno, czas generacji wynosi 20-40 godzin, podczas gdy czas generacji dla bakterii około pół godziny;

-    zapotrzebowanie tlenu dla komórek roślinnych jest znacznie mniejsze niż dla mikroorganizmów. Z tego względu dostarczanie tlenu nie jest procesem krytycznym decydującym o szybkości wzrostu. Wręcz mogą wystąpić niekorzystne efekty związane z nadmiernym napowietrzaniem i nadmiernym stężeniem rozpuszczonego tlenu;

-    komórki roślinne są znacznie większe niż mikroorganizmy -100 pm;

-    występuje znaczne zróżnicowanie populacji. Starsze konąórki mogą mieć wakuole zawierające substancje toksyczne;

-    ścianki komórek mają inną strukturę niż dla mikroorganizmów i są bardzo wrażliwe na naprężenia ścinające. Są za to odporne na rozciąganie. Biosynteza wielu związków wymaga zróżnicowanych i wyspecjalizowanych

komórek, których nie można wyhodować w kulturach zawiesinowych. Można za to wykorzystać kultury tkankowe, głównie korzeni transformowanych.

Korzenie transformowane, zwane włośnikowatymi, uzyskuje się w wyniku zakażenia całych roślin lub ich części, a także roślinnych kultur in vitro (kalus, hodowle w zawiesinie) bakteriami glebowymi Agrobacterium rhizogenes. Po połączeniu bakterii z komórkami roślinnymi następuje wbudowanie do genomu komórki roślinnej odpowiedniego fragmentu DNA z bakteryjnego plazmidu (plazmid Ri - Root inducing). W efekcie, komórki zmieniają swój metabolizm i wytwarzają w miejscach zranień liczne korzenie przybyszowe. Utworzone w wyniku infekcji korzenie, po oddzieleniu od eksplantu i wyeliminowaniu bakterii, mogą rosnąć w płynnych podłożach nie zawierających