medsadowa0

11.2.2.3. Ustalaniu przynależności grupowej

Podczas określania cech grupowych śladów krwi zeschniętej lub zhemolizowanej nie można stosować metod, które są używane podczas badania świeżej krwi płynnej. Na przeszkodzie stoi przede wszystkim brak nie zmienionych krwinek czerwonych. Ponadto do badania nadają się tylko takie cechy, które są oznaczalne mimo wyschnięcia krwi i jej starzenia się. Do powszechnie stosowanych metod oznaczania antygenów czerwonokrwinkowych układu ABO należą: a) metoda absorpcji (próba Holzera), b) metoda absorpcji-elucji.

{A    Wjnetodzie absorpcji posługujemy się próbkami śladu krwawego w stanie

MJ/ wysuszonym, do którego dodaj emy oddzielnie surowice wzorcowe anty-A, anty- B, anty-H. Użyte surowice powinno cechować małe jniano aglutynacyjne (1 ^lfijub 1:32), aby obecne w surowicach^- przeciwciała zostały wyabsorbowane przez właściwy antygen obecny w śladzie krwi, nawet w przypadku jego nikłej ilości. Po wielogodzinnej inkubacji pobiera się z każdej probówki płyn, do którego—po jego 1 rozcieńczeniu wjjostępleg^ometrycznym — dodaje się homologicznych krwinek wzorcowych (np. A, B lub 0). Stwierdzenie spadku miana aglutynacyjnego o 3 stopnie, czyli o 3 kolejne rozcieńczenia, traktuje się jako wynik pozytywny. Metoda ta jest prosta, wymaga jednak sporej ilości substancji śladowej 12—10 mg suchej krwi).

Odmianą metody absorpcji jest próba zahamowania aglutynacji w surowicy wzorcowej przez dodanie do niej wyciągu z plamy, sporządzonego w fizjologicznym roztworze soli kuchennej. — ••>•?: i '    ¹    '■ ((t&-

Metoda absorpcji-elucji jest znacznie czulsza od wyżej opisanej metody absorp-cji. Już jedno włókno o długości 1 cm przepojone krwią wystarczy do oznaczania przynależności grupowej. W metodzie tej wykorzystuje się wpływ określonej temperatury na przebieg reakcji łączenia się antygenów i przeciwciał. Tak np. podczas wykazywania cech grupowych układu ABO inkubację śladu z poszczególnymi surowicami przeprowadza się w temperaturze 4°C, co ułatwia absorpcję swoistych przeciwciał, a przeciwciała nie związane z antygenami obecnymi w śladzie krwi zostają dokładnie wypłukane wjodowatym roztworze NaCl. Z kolei w temperaturze 56°C, niekorzystnej dla reakcji antygen-przeciwciało, aglutyniny uprzednio związane z antygenami ulegają odłączeniu (dochodzi do elucji przeciwciał) i przechodzą do roztworu fizjologicznego dodanego do badanej próby śladu. Obecność przeciwciał w roztworze stwierdza się za pomocą homologicznych krwinek wzorcowych. W metodzie tej niezbędne jest stosowanie^nroyfic o dużym mianie aglntynacyjnym (co najmniej 1:128).

Obie opisane metody wymagają równoczesnego przeprowadzenia badania materiału kontrolnego, którym jest nie zaplamione podłoże, najlepiej z miejsc . sąsiadujących z badaną plamą krwi.

7 Wykrywanie izoaglutynin metodą Lattesa przeprowadza się tylko w przypadku stosunkowo świeżych śladów krwi, ponieważ w odróżnieniu od aglutynogenów są one ciepłochwiejne i ulegają szybko zniszczeniu pod wpływem czynników zewnętrznych. Czas ich w pełni poprawnej oznaczalności nie przekracza z reguły tygodnia. Badanie polega na obserwacji aglutynacji wzorcowych krwinek A i B (w celu kontroli używa się także krwinek 0) wokół cząsteczek zeskrobanego śladu krwi lub fragmentu zaplamionego krwią materiału, umieszczonego na szkiełku podstawowym. Aglutynację ogląda się pod mikroskopem. •)

Techniki badawcze wykorzystywane w celu określania przynależności grupowej śladów krwi w zakresie innych układów grupowych nie różnią się w zasadzie od tych, które stosuje się w badaniu świeżej, płynnej krwi (opisano je w rozdziale 10.5), aczkolwiek wymagają zastosowania wielu modyfikacji, ułatwiających badanie znikomej ilości śladu krwi. Są to: elektroforeza (często na bardzo cienkiej

warstwie żelu), lztMil«>ktruo<|tilnkiiWflhii> odiatttoWAiiin surowicy aniyglohulli woj. Wykorzystuje się również niihiwIi o moookluiinlno, a także nltrocoluli wykazującą właściwość wiązania białek. Surowica monoklnnalna charaktery/! się dużą swoistością zawartych w nioj przeciwciał, nitroceluloza natomiast siu Jako matryca czynna (w przypadku bezpośredniemu unkroplenia badanego um i latu) lub bierna (np. w kontakcie z żelem zawierającym już rozdzielone subsl atu białkowe), na której można oznaczyć obecność wielu antygenów i frakcji białe stosując różne metody o bardzo dużej czułości.

11.2.2.4. Oznaczalność poszczególnych cech grupowych

Do markerów grupowych z reguły oznaczanych w śladach krwi oprócz cech ukla< ABO należą układy Glm i PGM,, rzadziej Km, Gc, Hp, AK, a zupełnie wyjąlkov niektóre dalsze polimorfizmy białkowe i enzymatyczne, a także MN I I (ograniczające się do cechy D). O ile oznaczalność antygenów układu Al w wyschniętej krwi w sprzyjających warunkach jest możliwa przez wiele lat, o l y po upływie kilku dni nie udaje się oznaczyć w śladach krwi innych antygmió czerwonokrwinkowych (np. MN i Rh) wskutek szybkiego ich rozkładu (tali II

Tabela 11.1

Trwałość najczęściej oznaczanych cech grupowych w śladach krwi

Układ	Trwałość
ABO	ponad rok
Gm, Km	ponad rok
AK	ponad rok
Gc^-	ponad 6 miesięcy
PGM,	2—3 miesiące
Hp	1—2 miesiące
ADA	2—12 tygodni
GLO	2—12 tygodni
EsD	2—10 tygodni

CA

96 KM

AK

Z cech grupowych białek surowicy szczególną stabilnością cechują się czynnik Glm, co czyni je wyjątkowo przydatnymi w identyfikacji nawet bardzo starogi śladu krwi. Przydatność tę podnosi duży polimorfizm Glm oraz fakt, że wymagniu ilość substancji niezbędna do badania jest w tym przypadku wyjątkowo niewlHk a Ustalenie typu Hp za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym udaje «lq do 4 tygodni od powstania plamy krwi, natomiast fenotypy układu Gc można oznaczyć nieraz po upływie wielu miesięcy. Wśród grupowych układów on zymatycznych najbardziej przydatny jest układ PGM, (oznaczalny przez wolu tygodni) i AK (przeszło rok), przy czym układ PGM, wskutek zastosowania metody izoelektroogniskowania, zwiększającej polimorfizm tego układu, daje sz< /ogólno duże możliwości identyfikacyjne.    "

11.2.2.5. Oznaczanie innych cech krwi

Niejednokrotnie zachodzi konieczność ustalenia płci i wieku osoby, od k!óio| pochodzi ślad krwi, określenia przybliżonego czasu powstania danej plamy, a lakżo źródła krwawinnin