68799 P1180615 [1600x1200]

5. Lipidy

Lipidy stanowią grupę związków organicznych o znacznie zróżnicowanej strukturze. Ich wspólną cechą jest to, Ze są nierozpuszczalne w wodzie, natomiast dobrze rozpuszczają się w rozpuszczalnikach ogranicznych. Z tego tez względu izoluje się je najczęściej z odwodnionych tkanek na drodze ekstrakcji odpowiednimi rozpuszczalnikami. Niejednakowa rozpuszczalność lipidów w różnych rozpuszczalnikach organicznych może stanowić podstawę ich rozdziału; np. fosfolipidy dobrze rozpuszczają się w eterze, a nie rozpuszczają się w acetonie. W celu rozdzielenia tłuszczów stosuje się najczęściej chromatografię gazowo-cieczową lub cienkowarstwową. Pierwsza z nich polega na rozdzieleniu metylowych pochodnych lipidów pomiędzy gazową fazę ruchomą (np: hel) i lipofllną fazę płynną ( np: poliester kwasów dikarboksylowych z alkoholami). Chromatografię cienkowarstwową lipidów przeprowadza się najczęściej na Żelu krzemowym lub tlenku glinu, a do identyfikacji rozdzielanych związków wykorzystuje się reakcje, w których powstają barwne kompleksy. Lipidy dzielimy na tłuszcze proste wśród ktotych wyróżniamy tłuszcze właściwe (estry glicerolu i wyższych kwasów tłuszczowych) i woski (estry wyższych jednowodorotlenowych alkoholi i wyższych kwasów tłuszczowych), oraz tłuszcze złożone, do których zaliczamy fosfolipidy i glikolipidy. Inną grupę lipidów stanowią pochodne izoprenu. Zaliczane tu sąm.in. sterydy, karotenoidy, dolichole, fitol. Lipidy są podstawowym składnikiem błon biologicznych. Pełnią również w organizmie funkcję zapasowego materiału energetycznego. Obejmują również prekursoiy niektórych witamin oraz szereg hormonów.

1. Chromatografia cienkowarstwowa lipidów liścia na żelu krzemionkowym

Zasada.Chromatografia cienkowarstwowa pozwala na prowadzenie rozdziału zarówno w środowisku polarnym jak i apolamym. Rozdział substancji zachodzi na zasadzie odwracalnej, fizycznej adsorpcji, podziału substancji między dwie fazy ciekłe (fazą stacjonarną jest ciecz zaadsorbowana na ziarnach żelu), a także na zasadzie wymiany jonowej (np. żel krzemionkowy ma odczyn słabo kwasowy). Najczęściej ma miejsce kombinacja wszystkich trzech opisywanych mechanizmów | przewagą jednego z nich. Do rozdzielania mieszaniny lipidów wykorzystywana jest metoda chromatografii na żelu krzemionkowym. Stosując różne układy

rozpuszczalników można tą metodą rozdzielać różne grupy lipidów. Lipidy są związkami bezbarwnymi i aby je zidentyfikować, płytkę po rozdziale poddaje się wybawianiu przy użyciu różnych reakcji charakterystycznych.

Wykonanie:

Esktrakcja lipidów:

Ok. 2 g świeżych liści pszenicy pociąć drobno i ucierać w moździerzu z niewielką ilością piasku lub tłuczonego szkła. Dodać 10 ml mieszaniny chloroform:metano!

1:2 (v/v). Całość ucierać jeszcze przez kilka minut, wymieszać i odczekać, aż fragmenty tkanki opadną na dno moździerza. Nadsącz metanolowy zebrać i przesączyć przez sączek do probówki.

Rozdział:

Na gotowej płytkę z naniesioną warstwą żelu krzemionkowego o wymiarach ok. 20x5 cm narysować ołówkiem linię startu w odległości ok. 0.5 cm od krótszego brzegu i zaznaczyć na niej 5 miejsc do nanoszenia próbek (3 wzorce (monogalaktozyodiacyloglicerol (M), digalaktozylodiacyloglicerol (D), sulfolipid (S)) i 2 różne ilości próbki (np. 20 i 50 pl ekstraktu (PI i P2)). Podpisać miejsca nanoszenia próbek i wzorców. Na odpowiednie pola za pomocą mikrostrzykawki nanieść po 5 pl wzorców i odpowiednie ilości ekstraktu, starając się, by powstająca plama była jak najmniejsza. Po każdym roztworze płukać mikrostrzykawkę chloroformem. Można przyspieszyć parowanie rozpuszczalnika, dmuchając na płytkę strumieniem zimnego powietrza z suszarki. Po naniesieniu próbek włożyć płytkę do komory chromatograficznej z mieszaniną aceton:benzen:woda 81:30:4 (v/v/v) i rozwijać do momentu osiągnięcia przez czoło rozpuszczalnika odległości ok. 1 cm od górnego końca płytki. Płytkę wyjąć i suszyć pod dlgestorlum.

Baranienie:

Płytkę włożyć na 20 min do komory wypełnionej parami jodu. Następnie odbarwiać przez kilka minut na powietrzu (pod digestorium). Jod uwidacznia lipidy, tworząc z nimi barwny kompleks.

2. Chromatografia bibułowa barwników liścia

Powszechnie stosowanym typem chromatografii podziałowej jest chromatografia z zastosowaniem bibuły Jako nośnika fazy nieruchomej (zwykle rozpuszczalnika bardziej polarnego). Podczas wędrówki fazy ruchomej (rozpuszczalnika mniej