40

•: ii_3 zzsaćadi opiera się rozdział substancji w metodach chromatografii: adsor-rey-ar oec*»~ rueniiej i podziałowej?

2.    Co to sa ■ cnir- ? Jaki jest mechanizm działania kationitu, a jaki anionitu?

3.    Którą z metod chromatograficznych można zastosować do rozdziału mieszaniny aminokwasów? Uzasadnić odpowiedź.

4.    Jakie techniki stosuje się w chromatografii podziałowej? Na czym one polegają?

5.    Co to jest współczynnik Rf? Od czego zależy jego zawartość?

6.    Co to jest współczynnik podziału a?

7.    W jaki sposób można wykryć aminokwasy na chromatogramie otrzymanym techniką podziałową?

8.    Czy cukry proste można podzielić metodą chromatografii jonowymiennej? Uzasadnić odpowiedź.

9.    Uzasadnić, dlaczego w metodzie chromatografii adsorpcyjnej do rozwijania stosuje się rozpuszczalniki o niskiej polamości, a przy jonowymiennej — roztwory' wodne.

Wprowadzenie

Chromatografia sita molekularnego znalazła zastosowanie m.in. przy odsalaniu substan-

cji wysokocząsteczkowych, np. białek, od związków niskocząsteczkowych. Proces ten zastę-i puje długotrwałą i często kłopotliwą dializę, podczas której składniki niskocząsteczkowe przenikają przez błonę półprzepuszczalną.

Odsalanie przeprowadza się na kolumnie sporządzonej z żelu Sephadex G-25. Rozdział taki można przyrównać do chromatografii podziałowej, przyjmując, że na objętość całkowitą żelu w kolumnie V_c przypada objętość rozpuszczalnika nie związanego z żelem objętość rozpuszczalnika związanego z żelem — V■ i objętość samego żelu — V_g:

Rozpuszczalnik nie związany z żelem można więc traktować jako fazę ruchomą, a związany z żelem —jako fazę stacjonarną. Objętość rozpuszczalnika nie związanego z żelem

V₀ wyznacza się najczęściej stosując błękit dekstranowy —związek barwny o wysokiej masie

cząsteczkowej, wędrujący w kolumnie z czołem rozpuszczalnika.

W w^rypadku sączenia molekularnego fazę ruchomą i stacjonarną stanowi zwykle ten sam roztwór. Przy określonej szybkości przepływu rozpuszczalnika przez kolumnę substancje przesuwają się tym wolniej, im łatwiej wnikają do wnętrza żelu, a więc przy podobnej rozpuszczalności rozdzielanych składników w cieczy elucyjnej — im mniejszą mają masę cząsteczkową.

Przy zastosowaniu kolumny z żelu Sephadex G-25 do odsalania białka od siarczanu amonowego jako rozpuszczalnik używana jest woda. Stanowi ona zarówno fazę stacjonarną, jak i ruchomą. W takich warunkach duże cząsteczki białka, niezdolne do wnikania do wnętrza żelu, w'ędrują z czołem rozpuszczalnika. Pojawienie się białka w' eluacie (czyli objętość elucyjna UJ odpowiada równocześnie objętości zerowej kolumny (UJ