95

2.    Dwie osoby badają wpływ stężenia enzymu na szybkość reakcji i wyznaczają stałą K_m (4godz.>

3.    Dwie osoby wyznaczają stałąK_m i każda z nich oznacza aktywność enzymu (4 godz.)

Odczynniki

1.    Wyciąg enzymu: do 150 mg kiełków pszenicy dodać 100 ml wody i homogenizować przez 5 min (przy wydawaniu prób do kolbek miarowych odpowiednio zwiększyć ilość kiełków). Homogenat przesączyć przez sączek z waty i przechowywać w chłodziarce.

2.    0,0075-molowy 4-nitrofenylofosforan disodowy.

3.    0,1-molowy bufor octanowy o pH 5,3 (przygotowanie p. str. 133).

4.    10-proc. w^lan sodowy.

Szkło i inne pomoce

Do wykonania części a ćwiczenia w' układzie 2 lub 3 na 1 studenta przypada: 16 probówek, 1 pipeta chemiczna na 1 ml, 1 pipeta chemiczna na 5 ml, po 1 pipecie serologicznej na 1,2 i 5 ml, 1 zlewka na 400 ml (lub łaźnia wodna), termometr.

Uwaga! Wyciąg enzymu dla studentów' wykonujących część a ćwiczenia w układach 1 lub 2 przygotowany jest w' butelkach na stole. Natomiast studenci wykonujący tę część ćwiczenia w układzie 3 otrzymują wyciąg enzymu w^r kolbie miarowej na 25 ml, którą należy uzupełnić wodą do kreski i dokładnie wymieszać.

Wykonanie

~ 1. Wyznaczanie stałej Michaełisa-Menten. Do 6 ponumerowanych probówek odmierzyć kolejno 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 i 1,0 ml 4-nitrofenylofosforsnu (2 ), dodać po 1,5 ml buforu octanowego (3) i uzupełnić w^rodą do objętości 4 ml, a do próby kontrolnej odmierzyć 1.5 ml buforu (3 ) i 2^ ml wody.

Wszystkie probówki wstawić do łaźni wodnej o temp. 38°C i po ok. 5 min dodać kolejno do każdej probówki po 1 ml wyciągu enzymu, wymieszać, zanotować czas, wstawić do łaźni wodnej na 10 min.

Po 10 min przerwać działanie enzymu, dodając kolejno do probówek po 5 ml węglanu sodowego (4 ), wymieszać i oznaczyć absorbancję w' fotometrze przy 420 nm, ustawionym na zero wobec próby kontrolnej.

2. Badanie wpływu stężenia enzymu. Do 5 ponumerowanych probówek odmierzyć kolejno: 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 i 2,5 ml wyciągu enzymu (i ), dodać po 1 ml buforu octanowego (3) i uzupełnić wodą do objętości 3,5 ml, a do próby kontrolnej odmierzyć 1 ml buforu (3)12,5 ml wody.

Probówki wstawić do łaźni wodnej o temp. 38°C i po ok. 5 min dodać kolejno do wszystkich po 1 ml 4-nitrofenylofosforanu (2 ), wymieszać i wstawić do łaźni wodnej dokładnie na 10 min. Czynność tę najlepiej jest wykonywać w odstępach czasu, np. co 0,5 min, notując czas do każdej probówki. Dalej postępować tak jak w punkcie 1.