geny
1

stratów, polimerazy i tak zwanych ulepszaczy) umożliwiających analizę sekwencji jednego fragmentu długości prawie 1000 zasad.

_r 120

T A A A G A T A A A G A T A A A G A

2050

f 130

ATGCNCTATGTTCTATT C •«*»»«*» *■*•«» ATGC CTAT GTTCTATT A >**»« «>•*«•> ATGGGCTATGTTCTATT G»«v«n5jtw»««w* t_ 2060    t_ 2070

potćwnanie sekwencji badanej • fiagmect eksonu 18 genu MLH1 do sekwencji wzorcowej z bary danych ■ U0734) Oiw Bank

h — o" o w n t ioi n ~ rrri

sensu

A *A f G C N C T ATGT TC f A T

por6v/nanie chr«tnat«gram6w cekwencyjiych sensu i antysensu sekwencji badanej

- fragment eksorn 18 gem MLE1

Ryc. 3. Wstępna analiza sekwencji z wykrytą zmianą w obrębie eksonu 18 genu MLH1.

obi aa idu odjiDwistUJusy btćistj jekwMjtjł

chioił.#togt«*\

enlysensu

Oferowane są też nowe aparaty GSFLX machinę 2007 oparte o równoczesne sekwen-cjonowanie w czasie rzeczywistym przez syntezę równoczesną bardzo wielu stosunkowo krótkich fragmentów DNA (około 200 zasad). Wykorzystują one pirosekwencjonowanie z detekcją łuminescencji powstającej z rozkładu ATP. Aparaty te pozwalają na analizę 100 min zasad jednego dnia. Pirosekwencjonowanie (14) jako matrycę wykorzystuje jednoniciowy fragment DNA, na którym przeprowadzana jest synteza nici komplementarnej poprzez dodawanie kolejno czterech różnych trifosforanów deoksynukleotydów (dNTP). Przyłączeniu każdej zasady towarzyszy uwalnianie pirofosforanu, który zostaje przekształcony w ATP przy udziale sulfurylazy i obecnego w mieszaninie adenozyno-5.fosfosiarczanu. Powstały ATP wykorzystywany jest pr2ez lucyferazę do przekształcenia łucyferyny w oksylucyferynę. W reakcji tej powstaje światło w ilości odpowiadającej wyprodukowanemu we wcześniej-

szyin etapie pirofosforanowi. Światło to jest rejestrowane przez kamerę CCD i przekształcane do postaci piku na wykresie. Ten sam schemat reakcji przeprowadzany jest również dla kolejno dodawanych różnych dNTPów. Jeżeli dodawany nukleotyd nie jest komplementarny do matrycy nie następuje włączenie go do nowo syntetyzowanej nici i nie powstaje pirofosforan. Tylko obecność sygnału świetlnego stanowi podstawę do zapisu w sekwencji kolejnego dodawanego nukleotydu,

Mutacje w DNA obejmujące miejsca przyłączania starterów lub inne odcinki poza regionami amplifikowanymi nie są wykrywane za pomocą testów DNA opartych o analizy omówione powyżej. Część takich zmian to duże przemieszczenia.

Bca 1

BeeMI

Cfbl

Hhal

HinPlI

Ubal282

mapa restaykcyna i sekwencyjna aminokwasów kodowana przez fragment niezmiennego eksonu 18 MLHI

AAAGAATG C	1	A T G T
1
1
f

mapa restrykcyjna i sekwencja aminokwasów kodowana precz zmutowany fragment eksonu 18 MLHI

EsaMI    1

CivRI    1

Ubal382 1    ₁

\AAGAATGC		A T 3
, - . 1
_ 1

Ryc. 4. Zmiany mapy restrykcyjnej i sekwencji aminokwasów w białku spowodowane mutacją w eksonie 18 genu MLHI. Mutacja prowadzi do utraty miejsc restrykcyjnych dla Bca I, Cfo I, Hha 1, HinP I oraz pojawienia się miejsca restrykcyjnego dla Cvi R I, co tatwo można wykorzystać do jej wykrywania.

Metoda Southema i zależna od ligacji multipleksowa ampliftkacjasond

Jedną z technik, kiedyś powszechnie używaną do wykrywanie dużych przemieszczeń opartą o hybrydyzację jest opisana po raz pierwszy przez E.M. Southema w 1975 r. i odtąd zwana metodą Southema (Southern błoting).

Współcześnie metodą godną polecenia, która niemal całkowicie zastąpiła metodę Southema w wykrywania rearanżacji w genach jest zależna od ligacji multipleksowa amplifi-kacja sond (MLPA - muliiplex ligationdependent probe amplificatioti) (15). Technika ta w oparciu o reakcję ligacji specyficznych sond i reakcję amplifikacji pozwala na ocenę liczby kopii eksonów. Na jej podstawie można wnioskować o delecjach bądź duplikacjach fragmen-