W8

3. LAKTONY

4. KWAS MASŁOWY:

- niskie stężenie uzupełnia zapach maślany w serowarstwie,

- naturalne 2% masła,

- obligatoryjne anaeroby Clostridium, Eubacterium, Fusarium, wrażliwe na pH, w fermentorze pH ≈ 5 (CaCO₃),

- toksyczny dla produktu:

1. maślan pentylowy = zapach owoców brzoskwini, ananasa, moreli;

2. maślan izobutylowy = gruszka, ananas, brzoskwinia

5. KWAS IZOWALERIANOWY: najsilniejszy zapach, zapach brudnych stóp

• izowalerian etylu = zapach jabłkowy (cukierki, gumy do żucia)

• izowalerian izopentylowy = zapach jabłek, malinowy (przemysł spożywczy)

• izowalerian izobutylu = zapach jabłkowo-malinowy (przemysł perfumeryjny)

6. TERPENY i produkty ich transformacji:

• olejki eteryczne,

• różnorodność zapachów: owocowe, różane, geranium pachnący, trawiasty, migdałowy, grzybowy, kamforowy

7. JONONY:

• produkty enzymatycznej hydrolizy karotenoidów

• zapach tabaki

8. GEOSMIN: algi, baterie, grzyby, perfumy, olejki eteryczne.

Mikroorganizmy mogą syntezować kompleksowe mieszaniny związków, które uzupełniają się:

• zapachy nabiałowe - zapachy serowe (chipsy, sosy, wypieki), jogurtowe, śmietankowe

• zapachy chlebowe: zapach białego chleba - składniki, produkty fermentacji drożdżowej i bakteryjnej, degradacji, produkty reakcji termicznej, 2 kierunki :

• zapachy prefermentacyjne (mieszanina drożdży, wody, cukru, soli, odtłuszczonego mleka, pożywki drożdżowej; 6h fermentacji bezpośrednio do ciasta lub podczas wyrabiania)

• preparaty enzymatyczne: amylazy, proteazy mikrobiologiczne

• zapachy grzybowe: 1-octan-3-ol, kwas glutaminowy, 5'-guanylan; poszukiwanie zapachów grzybowych nie koncentruje się na poszukiwaniu producentów; hodowla wgłębna, suszenie

• zapachy i smaki z tkanek roślinnych: wanilia i mięta pieprzowa, koszt i dostępność;

metoda pozyskiwania: bezpośrednia ekstrakcja z materiału, podłoża, biotransformacja, synteza enzymatyczna,

wszystkie techniki z fermentacji mikrobiologicznej używa się w produkcji związków smakowych i zapachowych z roślin: selekcja komórek nadprodukujących prekursory, manipulacje położenia, hormony.

W8

AROMATY IDENTYCZNE Z NATURALNYMI

WANILINA = 4-hydroksy-3-metoksybenzaldehyd (aromat identyczny z naturalnym)

• odpowiedzialna za zapach wanilii;

• w materiale roślinnym znajduje się 2% suchej masy wanilii; izolowana w postaci proszku o słodkim smaku i intensywnym zapachu;

• zastosowanie: przemysł spożywczy, cukiernictwo, produkcja napojów, perfumy, kosmetyki;

• produkcja: 6000ton/rok;

• synteza chemiczna: gwajakol i ligniny, tanio 12$/kg związku (ludziom nie podoba się ten związek - jest syntetykiem, więc rozpoczęto poszukiwania metod do produkcji tych związków, tzn. identycznych z naturalnymi: biotransformacje, synteza de novo przez specjalne szczepy).

Aromaty identyczne z naturalnymi: związki produkowane przy udziale mikroorganizmów.

1. PRODUKCJA WANILINY PRZEZ BIOTRANSFORMACJĘ:

- biotransformacja lignin: utlenianie „white rot fungi”; peroksydaza ligninowa z grzybów z rodzaju hub

- biotransformacja kwasu ferulowego:

pochodna kwasu cynamonowego, enzymatyczne uwalnianie z lignin: esteraza ferulowa i hydrolaza estrów cynamonowych

• dekarboksylacja: grzyby i drożdże

• redukcja: Burkolderia cepacia, Lactobacillus plantarum, Saccharomyces cervisiae

• deacetylacja niezależna od CoA: Pseudomonas, Bacillus subtilis, Escherichia coli

• deacetylacja zależna od CoA: P. putida, Rhodotorula rubra

- biotransformacja kwasu wanilinowego: Pseudomonas fluorescens, 95% wydajności;

- biotransformacja eugenolu i izoeugenolu: składniki olejków eterycznych z drzewa goździkowego: Corynobacterium, Pseudomonas;

W8

- biotransformacje Phe;

2. Produkcja waniliny de novo (toksyczna dla organizmów, które ją produkują i nie jest możliwa jej konwersja) mutant Escherichia coli; nadprodukcja aminokwasów aromatycznych (Trp); konwersja glukozy w kwas wanilinowy, odzyskiwany i redukowany enzymatycznie do waniliny (dehydrogenaza alkoholu arylowego z

Nocardia crassa)

BIOTECHNOLOGICZNA PRODUKCJA AMINOKWASÓW

PRODUKCJA AMINOKWASÓW JEST MOŻLIWA:

• na drodze syntezy chemicznej (D,L - Met)

• na drodze syntezy enzymatycznej (L-Asp, L-Trp)

• w procesie jedno- lub wielostopniowej biosyntezy

• zastosowanie aminokwasów: przemysł spożywczy, paszowy, medycyna, przemysł farmaceutyczny, chemiczny

aminokwasy	produkcja [t/rok]	mat. produkcji	zastosowanie
glutaminian sodu (sól jednosodowa)	370 000	biosynteza	poprawia smak potraw
L-Lys	70 000	biosynteza	wzbogacenie pasz białkowych (podawana krowom w dawkach 10mg/dziennie zwiększa ilość białka w mleku o 10%, ekonomicznie opłacalne)
L-Asp, L-Phe	7 000	synteza enzymatyczna, biosynteza	aspartam (produkt spożywczy jako słodzik)
L-Cys	7 000	biosynteza	antyoksydant, dodatek do chleba
D,L-Met	70 000	synteza chemiczna	wzbogacenie pasz białkowych (podawana krowom w dawkach 10mg/dziennie zwiększa ilość białka w mleku o 10%, ekonomicznie opłacalne)

DO MIKROBIOLOGICZNEJ PRODUKCJI AMINOKWASÓW WYKORZYSTUJE SIĘ:

• 
  
  Corynobacterium glutamicum

• Bravibacterium flavum

W8

• G(+), katalazododatnie,

• morfologicznie zmienne: tlenowce lub względne beztlenowce w warunkach tlenowych: substrat → CO₂ + H₂O;w warunkach beztlenowych: fermentacja mlekowa

• mezofile

• niskie wymagania pokarmowe (źródło N - nieorganiczne, C - mono-, disacharydy, kwasy tłuszczowe, alkany),

• brak aktywności proteolitycznej (bardzo niskie)

• naturalne auksotrofy w stosunku do biotyny bądź tiaminy,

Wspólne cechy tych bakterii: w sprzyjających warunkach produkują i wydzielają poza komórkę kwas glutaminowy (duże ilości); bardzo prosty materiał pierwotny: manipulacje dają zmodyfikowane ścieżki metaboliczne, tak aby była możliwość nadprodukcji materiału pierwotnego.

1. KWAS GLUTAMINOWY

Kiedyś → synteza metodą kwaśnej, ciśnieniowej hydrolizy bogatych w ten aa białek pszenicy

Obecnie → jednostopniowa fermentacja

glukoza

Skład pożywki hodowlanej:

• 5 μg/l biotyna (stężenie nie może być większe, hamuje wzrost)

• melasa buraczana (uboga w biotynę

• (NH₄)₂SO₄

• kreda (środek zobojętniający)

efektywna hodowla: napowietrzana, 30⁰C, 40 - 72 h → wydajność 50%

W8

Bakterie wykorzystujące inny cukier niż glukoza, np. Corynebacterium sp. R7. Wykorzystują heksadekan i penicylinę lub Tween 80 ( wydajność 75 g/l), małe stężenie tiaminy.

2. KWAS ASPARAGINOWY

Kiedyś → produkowany z soku asparagusa

Teraz → metody fermentacyjne, enzymatyczne

Zastosowanie:

• medycyna: sól K, Mg (leczenie znużenia, chorób serca, wątroby, skurczów nóg u diabetyków), sól Fe (anemia)

• kosmetyka: związki powierzchniowo czynne L-Asp + B₆ (kremy rewitalizujące)

• przemysł spożywczy (soki pomarańczowe, aspartam)

Metoda fermentacyjna:

• 
  
  glukoza: Brevibacterium flavum

• kwas fumarowy: Bacillus, mutanty F. fluorescens, E. coli

Metoda enzymatyczna: wykorzystanie liaz do produkcji (L-Asp całkowicie nie rozpuszczalny w wodzie, łatwy do wydzielenia)

CH - COOH

 kwas fumarowy

CH - COOH

aspartaza ↑↓ amoniak

CH - COONH₄ CH₂ - COOH

 

CH - COONH₄ CH₂(NH₂)COO^-

fumaran amonu L-Asp

(zw. nierozpuszczalny w wodzie)

Stosuje się do tego celu specjalne kolumny wypełnione immobilizowanymi komórkami

Escherichia coli, jako nośnika używa się roztworu fumaranu amonu.

kolumna z immobilizowanymi komórkami E. coli

odciek

kryształy L-Asp

W8

BIOTECHNOLOGIA PRODUKCJI KWASÓW ORGANICZNYCH

1. KWAS CYTRYNOWY

- otrzymywany na drodze biologicznej

Zastosowanie:

• przemysł spożywczy (80%):

• składnik konserw - obniża pH

• inaktywacja oksydaz (oksydazy odpowiedzialne za ciemnienie owoców)

• kompleksuje Me powodujące jełczenie tłuszczów

• przemysł metalurgiczny: czyszczenie powierzchni metali przed spawaniem

• przemysł farmaceutyczny:

• dodatek do tabletek musujących

• cytrynian sodu wykorzystywany jest jako preparat zapobiegający krzepnięciu krwi w stacjach krwiodawstwa

• przemysł chemiczny:

• detergenty (wyparł biodegradowalne fosforany)

• plastyfikatory, stosowane w mleczarniach do usuwania „kamienia mlecznego”;

Producenci:

• Aspergillus niger

• Aspergillus wenti

• Candida sp.

Otrzymywanie kwasu cytrynowego (300.000 t/rok)

a) metoda powierzchniowa: dwie fazy w systemie jednostopniowym

1 faza - rozwój grzybni (72h)

2 faza - koniec rozwoju grzybni, właściwa produkcja kwasu cytrynowego

Surowiec: melasa buraczana (pozostałość po produkcji cukru) rozcieńczona do 16% zawartości sacharozy + sole mineralne (KH₂PO₄, ZnSO₄x7H₂O, K₄Fe(CN)₆)

• rozlanie sterylnej pożywki na system tac

• zaszczepienie zawiesiną konidiów w węglu aktywnym

• wzrost grzybni (dojrzała grzybnia 2-3cm)

• produkcja kwasu cytrynowego (za produkcję odpowiedzialna jest część grzybni stykającej się z powierzchnią pożywki)

• wydzielenie produktu (metoda cytrynianowa i bezcytrynianowa)

• wydajność 70%, proces trwa ok. 200h

• istnieje zagrożenie zarażeniem mikrobiologicznym

b) metoda wgłębna:

• opiera się na wykorzystaniu bioreaktorów (50 -100m³)

• warunkiem wydajności procesu jest surowiec o dużej masie i wyższej klasie czystości (cukier handlowy, soki cukrownicze, mączki cukrowe, hydrolizaty skrobiowe)

• zaszczepienie: konidia lub grzybnia indukcyjna

W8

• warunki: zamknięty reaktor, dozowanie po wysterylizowaniu, niskie pH 2,5 - 3

( nie sprzyja zakażeniom)

• czas 120 -168 h, temperatura 30 -32 ⁰C

• pożywka mineralna (sole) → wydajność 80%

• normy spożywczego kw. cytrynowego muszą być spełnione (cukier handlowy, soki cukrownicze, mączki cukrowe, hydrolizat skrobiowy)

• problemy bioinżynieryjne:

• wzrost w stałej objętości,

• zmiana środowiska zewnętrznego,

• zmiana gęstości,

• specjalne bioreaktory;

• problem z melasą buraczaną (mało wydajna)

2. KWAS MLEKOWY = kwas 2-hydroksypropionowy

COOH



HO - C - H



CH₃

• zależy od tego czemu ma służyć kwas mlekowy, ceny i dostępności surowca

• surowce: melasa buraczana, trzcinowa, serwatka, ługi posiarczynowe

• przedsiębiorstwo „Akwawit”: sacharoza + kiełki lub ekstrakt drożdżowy; Lactobacillus delbrueckii; temp. 50 -55 ⁰C, 2-8 dni, neutralizacja Ca(OH)₂ → 95%

• pleśnie: Rhizopus oryzae; mogą wykorzystywać te same szlaki metaboliczne co bakterie mlekowe, te które są zdolne do wytwarzania pojedynczych enancjomerów

• hodowla wgłębna

Zastosowanie:

• zakwaszanie i konserwacja przetworów i konserwantów owocowo-warzywnych

• produkcja napojów chłodzących

• przemysł garbarski, farbiarski, chemicznych

• przemysł kosmetyczny, farmaceutyczny

3. KWAS GLUKONOWY = kwas pentahydroksykapronowy

• otrzymywany metodami chemicznymi lub biologicznymi

• oksydaza glukozowa: Aspergillus niger, Gluconobacter sp., Pseudomonas sp.

• źródłem węgla jest glukoza

W8

Zastosowanie:

• przemysł spożywczy: zakwaszacze produktów, sztuczny miód, kiełbasy, sery, napoje gazowane, proszek do pieczenia

• glukonian wapnia: związek łatwo przyswajalny przez zwierzęta

• rozpuszczalnik skrzepów krwi

• dodatek do antybiotyków: stabilność, rozpuszczalność, poziom we krwi

• przemysł tekstylny: wybielanie i nabłyszczanie tkanin

• przemysł metalurgiczny: jak kwas cytrynowy

• glukonian sodu: automatyczne mycie butelek

• glukonian potasu: ochrona instalacji przemysłowych

• produkcja 50 000 ton/rok

α-D-glukoza

β-D-glukoza

D-glukozo-δ-lakton

D-glukozo-γ-laktan kwas glukonowy

Aspergillus niger:

• proces wgłębny

• pożywka: 30% roztwór glukozy, P i N

• pH 5,5 - 5,6

• ważny jest poziom napowietrzenia

• proces trwa 60 - 70 h

• wydajność 90%

Kwas glukonowy otrzymuje się jako roztwór 50% i wykorzystuje się go w przemyśle. Po zakończeniu procesu kwas jest neutralizowany; otrzymaną sól neutralizuje się i oczyszcza.

5. KWAS OCTOWY

Surowiec: etanol, alkohole, wino, sfermentowany sok jabłkowy.

Metody otrzymywania:

1. powierzchniowa (orleańska)

• Acetobacter aceti

• temperatura 25 - 28⁰C

• najstarsza metoda

• samorzutna fermentacja wina w beczkach

• objętość 1/3 beczki zaszczepiona bakteriami

W8

• czterokrotnie odciąganie części zawartości

• otrzymujemy ocet winny

• metoda ociekowa (wiązana): dwie odmiany

• metoda stojakowa (przestarzała): mała wydajność 60 -80 % , trudna kontrola

• metoda generatorowa: unieruchamianie bakterii octowej na nośniku np. pumeks, kolby kukurydzy, wióry bukowe, koks;

• zacier = brzeczka: dzieli się ją na 3 partie:

1. 50% zacieru w kolumnie: stężenia alkoholu ok. 4%

2. 25% : stężenie alkoholu ok.. 3%

3. 25%: stężenie alkoholu poniżej 3%

• proces prowadzi się do momentu aż stężenie alkoholu wyniesie ok. 0,03%

• 14% EtOH (maksymalne stężenie alkoholu)

• pożywka hodowlana 1 - 3% CH₃COOH

• stymulowany wzrost bakterii octowych (ekstrakt sodowy, drożdżowy, glukoza, sole mineralne - N,P)

• metoda fermentacyjna (metoda wgłębna):

1. fermentatory wyposażone w wężownice (utrzymują stałą temperaturę 30⁰C) i system napowietrzający;

2. proces jest szybki, okresowy, wysoce efektywny

3. jedyna wada: produkt zanieczyszczony komórkami bakterii

4. zacier: 10 -14% EtOH, 1- 3% kwas octowy, stymulatory wzrostu bakterii octowych (glukoza, ekstrakt drożdżowy, sole mineralne)

5. materiał biologiczny - ocet spożywczy

6. materiał chemiczny - kwas octowy dla celów technicznych

OCET BALSAMICZNY:

• winogrona umieszczane są w beczce z drzewa kasztanowego o pojemności 100 l

• po ich tłoczeniu otrzymuje się 70 l. świeżego moszczu., stężonych cukrów 16 -18%

• zachodzi tu fermentacja alkoholowa i octowa

• gotowanie na wolnym ogniu pod gołym niebem; 30 l koncentratu o stężeniu cukrów 30 -36%

• chłodzenie w okresie zimowym, dekantacja w gąsiorkach

1

WANILINA

KWAS FERULOWY

KWAS WANILINOWY

tzw. bakterie kwasu glutaminowego

metody mało wydajne; trudne do kontroli

CH₂ - COONH₄⁺



CH₂(NH₂)COOH

sól amonowa L-Asp

roztwór 1,2 M fumaranu amonu + 1mM Mg²⁺

pH 8,5

37⁰C

powolny przepływ

zmiana pH 2,8, 60% H₂SO₄

ochłodzenie do 15⁰C

odwirowanie

przemycie wodą




związek optycznie czynny (L,D, racemat)

w roztworze wodnym ustala się między nimi równowaga

oksydaza glukozowa: zawsze towarzyszą jej katalazy,

odszczepia 1C, dwa H, tworzy się lakton

---