2906543829

126

126

przesączame

i

kultura protoplastów

maga użycia enzymów takich, jak pektynazy i celu-lazy. Tylko w wyjątkowo sprzyjających warunkach enzymy jednej grupy wystarczą do izolacji protoplastów. Wymienione enzymy mogą być stosowane po kolei albo równocześnie. Ryc. 1 przedstawia obydwa sposoby izolacji. Najpierw pektynaza rozpuszcza blaszki środkowe między komórkami i tak tworzy się zawiesina pojedynczych komórek. Stosowana po niej ce-

»

nagie protoplasty

Ł

przemycie i osadzenie

wysiewanie

Ryc. 1. Izolacja i kultura protoplastów (schemat) lulaza i towarzyszące jej inne enzymy uwalniają protoplasty ze ścian. Kiedy jednak izolacja komórek przez pektynazy jest utrudniona przy pewnych typach tkanek roślinnych, wtedy stosuje się mieszaninę pektynazy i celulazy.

Przez cały czas działania enzymów, także przy wszystkich manipulacjach z izolowanymi protoplastami, musi być dokładnie ustalona wartość osmotyczna roztworów. Nie wolno używać roztworów inkubacyj-nych o stężeniu niższym niż stężenie osmotyczne soku komórkowego protoplastów, ponieważ po ich oswobodzeniu ściana komórkowa nie przeciwstawi się wzrastającemu turgorowi i protoplasty ostatecznie pękną. Wartość osmotyczna roztworów nie może być też za wysoka, ponieważ protoplasty wskutek odwodnienia kurczą się a nawet zamierają. W wyniku prawidłowo przeprowadzonych manipulacji i przy odpowiednio dobranych stężeniach roztworów inkubacyjnych (enzymy 4“ czynniki równoważące wartość osmotyczną, którymi najczęściej są mannitol lub sorbitol, a nawet pewne sole mineralne) otrzymujemy zawiesinę izolowanych protoplastów przybierających w płynnym środowisku postać kulistą. Ryc. 2 i 3 przedstawiają uwolnione protoplasty w mikroskopie świetlnym.

Oprócz powyższych waTunków izolacji należy dokładnie przestrzegać stężenia enzymów i czasu inkubacji, aby możliwie jak najbardziej zmniejszyć szkodliwy wpływ preparatów enzymatycznych na izolowane protoplasty. Oczywiście, zachowanie przy tym stałego pH, temperatury i sterylnych warunków izolacji enzymatycznej jest zrozumiałe. Bardzo często roztwory in-kubacyjne zawierają jeszcze jeden składnik, a miano

wicie źródło jonów Ca++, które podnoszą stabilność błon protoplastów. Nie jest to bez znaczenia dla trwałości i przeżywalności protoplastów stosowanych do dalszych badań.

Należy jednak pamiętać, że nie ma standardowej metody dla uzyskiwania wolnych protoplastów i dla każdego typu tkanki trzeba ustalić optymalne warunki ich izolacji.

Na udaną izolację protoplastów mają wpływ także fizjologiczne warunki wzrostu tkanki. Istnieją zasadnicze różnice w łatwości otrzymywania wolnych protoplastów zależnie od wieku, miejsca pobrania próby i warunków hodowli użytych organów i komórek. Zaleca się używanie do badań odpowiednio jednolitego materiału, nie tylko ze względu na wydajność izolacji, ale i na żywotność protoplastów. Zdolne do życia protoplasty charakteryzują: cykloza (krążenie cytoplaz-my), regeneracja ściany i podziały. Niewłaściwe warunki izolacji i hodowli przyczyniają się do zwiększenia objętości protoplastów, ich pękania lub tworzenia zbitych skupisk.

Otrzymanie izolowanych protoplastów z liści czy kultur komórkowych jest w zasadzie proste, ale jakie może mieć zastosowanie tak otrzymana zawiesina w badaniach naukowych? Posługując się nagimi protoplastami zamiast komórkami czy tkankami możemy łatwiej badać metodami biochemicznymi procesy fotosyntezy, oddychania, syntezy białek i RNA, tworzenia materiałów zapasowych, działania fitohormonów, reakcje na środki ochrony roślin. W mikroskopie elektronowym można obserwować przeobrażenia plazma-lemmy i resyntezę mikrofibryll celulozowych w czasie budowy ściany komórkowej (ryc. 4).

Wymienione wyżej przykłady nie obrazują jednakże w pełni możliwości użycia nagich protoplastów w badaniach biochemicznych, bowiem szczególną zaletą nagich protoplastów jest możliwość użycia ich jako obiektów dla genetycznych manipulacji. Pobieranym przez protoplasty materiałem genetycznym mogą być makromolekuły takie jak izolowany czysty DNA, lub nadrzędne struktury zawierające ten DNA np. wirusy, plastydy. Z reguły ściana komórkowa tworzy dla tego materiału barierę nie do przezwyciężenia i właśnie ta przeszkoda jest w czasie izolacji usunięta, a wolne protoplasty mogą być odpowiednim receptorem dla pobrania obcego materiału genetycznego. Z teoretycznego punktu widzenia interesujące jest, jak zostanie ten materiał wniesiony, i zbadanie, co się z nim dalej stanie. Praktycy niewątpliwie chcieliby widzieć od razu końcowy efekt tych manipulacji — całe rośliny, zregenerowane z przekształconych komórek.

Czy można z izolowanych protoplastów wyhodować całe rośliny? Nie jest to niemożliwe. Bowiem już od dawna było wiadome, że z izolowanych komórek roślin wyższych można ponownie całe rośliny zregenerować.

Z izolowanych protoplastów jago pierwsze zostały w 1971 r. zregenerowane rośliny tytoniu, w 1972 r. marchew i petunia, następnie szparag, bieluń, rzepak i wątrobowiec Sphaerocarpus. Lista zregenerowanych w ten sposób roślin ciągle się wydłuża.

Otrzymanie zregenerowanych z protoplastów roślin wymaga szeregu skomplikowanych zabiegów. Nagie protoplasty po oczyszczeniu z roztworu enzymatycznego umieszcza się na pożywce płynnej lub agarowej zawierającej substancje stymulujące podziały komór-

%