3870137225

STRATEGIE NMR WYZNACZANIA STRUKTUR BIAŁEK W ROZTWORZE 31

nów amidowych H_N jest szeroki i oprócz tego znajdują się w nim jedynie protony aromatyczne fenyłoalaniny, tyrozyny, his ty dyny i tryptofanu, które nie są sprzężone spinowo z pozostałymi protonami w resztach tych aminokwasów. Dlatego protony H_n znajdujące się na początku układów spinowych, które w aminokwasach są liniowe lub słabo rozgałęzione, stanowią dogodny punkt wyjściowy wielu procedur wykorzystywanych przy wyznaczaniu więzów strukturalnych. Drugą ważną cechą przesunięć chemicznych w białkach jest bardzo duża różnica pomiędzy przesunięciami chemicznymi szkieletowych węgli karbonylowych C’ oraz węgli C_a i alifatycznych węgli łańcuchów bocznych. Dzięki temu możliwe jest niezależne, semiselektywne wzbudzenie jednego z tych przedziałów, co odgrywa ważną rolę w wielu technikach heterojądrowych stosowanych przy pomiarach białek znakowanych izotopem ^,3C.

STRATEGIE WYZNACZANIA STRUKTUR BIAŁEK

Postępowanie zmierzające do wyznaczenia konformacji cząsteczki, niezależnie od jej wielkości, zawsze musi składać się z trzech kroków:

1.    przypisanie sygnałów,

2.    identyfikacja więzów strukturalnych,

3.    generowanie struktur, w których spełnione są więzy doświadczalne.

Postępowanie w pierwszych dwóch krokach zależy od wielkości badanego białka. Natomiast postępowanie w' trzecim kroku jest określone przez rodzaj i liczbę dostępnych więzów' [19,20],

Do badania małych białek, o masach cząsteczkowych M_cz < 10 kDa, wystarczające jest wykorzystanie przesunięć chemicznych i ich korelacji w dwuwymiarowej (2D) spektroskopii NMR [5, 19-21]. W białkach, których masy cząsteczkowe przekraczają 10 kDa nasilają się dwa efekty: rośnie liczba sygnałów, których szerokości zwiększają się, co jest konsekwencją coraz szybszej poprzecznej magnetycznej relaksacji jądrowej wynikającej z coraz wolniejszej dyfuzji rotacyjnej. Rosnąca liczba coraz szerszych sygnałów zwiększa ich nakładanie się, co uniemożliwia identyfikację sygnałów oraz wyznaczenie sprzężeń spinowych.

Metodami, które pozwalają pokonać te trudności jest znakowanie izotopowe. Omówienie obszernej problematyki znakowania izotopowego białek, wykraczającej poza zakres tej pracy, można znaleźć w odrębnych publikacjach [22-24], Należy jednak wspomnieć, żc białka można znakować jednorodnie, segmentowo lub selektywnie. Białka o masach cząsteczkowych M_cz < 30 kDa znakuje się jednorodnie izotopami ^I5N i ^I3C. Przestaje to jednak być wystarczające dla białek cięższych, które wymagaj ą również częściowego deuterowania i selektywnego znakowania ^,3C grup metylowych. Do badania białek znakowanych izotopowo wykorzystuje się szereg heterojądrowych technik 3D i 4D [20, 25-27],