8851686584

10 Inżynieria genetyczna i terapia genowa. Zagadnienia podstawowe i aspekty praktyczne

za lub litykaza. Środkami ułatwiającymi liżę są także wykorzystywane powszechnie w różnych metodach izolacji DNA chelatory jonów metali dwuwartościowych — przede wszystkim EDTA w postaci soli dwusodowej (sól dwusodowa kwasu etylenodiaminote-traoctowego), rzadziej CDTA (sól sodowa kwasu cykloheksanodiaminotetraoctowego).

Już na etapie homogenizacji i lizy komórek należy zapewnić takie warunki izolacji, aby zminimalizować prawdopodobieństwo degradacji DNA przez obecne w środowisku komórkowym DNazy. W odróżnieniu od RNaz (enzymów degradujących RN A), dezo-ksyrybonukleazy to enzymy zależne od jonów metali. Fakt ten umożliwia łatwą inhibicję DNaz poprzez zastosowanie w buforach lizujących odpowiedniego stężenia chelatorów, np. EDTA, wiążących niezbędne do pracy enzymów jony metali, głównie metali dwuwartościowych. Wpływ egzogennych DNaz na wydajność izolacji można natomiast znacząco obniżyć dzięki stosowaniu odpowiednio przygotowanego do izolacji sprzętu i roztworów (autoklawowanie, praca w rękawiczkach i odzieży ochronnej, wolny od DNaz sprzęt jednorazowy).

Po uzyskaniu homogenatu tkankowo-komórkowego kolejnym etapem w pozyskiwaniu DNA jest właściwa izolacja, czyli oddzielenie DNA od pozostałych składników lizatu komórkowego, zwłaszcza białek, oraz od RNA. Białka są częściowo degradowane już na etapie lizy komórek w przypadku zastosowania odpowiednich proteaz — najczęściej proteinazy K (enzym izolowany z trzustek zwierzęcych lub pozyskiwany techniką rekombinacji DNA), rzadziej pronazy (enzym wyizolowany m.in. ze szczepu promieniowców Streptomycesgriseus). Istnieje wiele procedur izolacji genomowego oraz plazmidowego DNA opartych na różnych technikach. Powszechnie stosowaną metodą izolacji DNA jest ekstrakcja fenolowo-chloroformowa lub ekstrakcja samym chloroformem, zapewniająca przede wszystkim dokładne odbialczenie ekstraktów DNA. Najczęściej wykorzystuje się metodę z użyciem mieszaniny fenolu (nasyconego buforem o pH około 8) z chloroformem i alkoholem izoamylowym w stosunku 25:24:1 lub 50:49:1. Fenol zasadowy powoduje przejście DNA do fazy wodnej, podczas gdy fenol kwaśny (nasycony wodą) stosowany do ekstrakcji RNA powoduje zatrzymanie DNA w fazie organicznej oraz w tzw. międzyfazie tworzącej się na granicy środowiska organicznego i nieorganicznego. Oczyszczanie DNA z resztek RNA najczęściej prowadzone jest przez enzymatyczną degradację z zastosowaniem RNaz. RNA można także selektywnie precypitować z warstwy wodnej za pomocą chlorku litu. Należy pamiętać, że zastosowanie RNaz wymaga następczego ponownego odbialczania próbek, co prowadzi się zwykle stosując ponowną ekstrakcję fenolowo-chloroformową próbki.

Denaturowane białka usuwa się najczęściej przez wirowanie, natomiast oczyszczony DNA w ostatnim etapie procedury zostaje wytrącony z roztworu zwykle przez precypita-cję roztworami etanolu lub izopropanolu. Wytrącenie DNA w tym wypadku jest niczym innym, jak odwodnieniem cząsteczki DNA przez bezwodny roztwór odpowiedniego alkoholu. Precypitacja DNA zawsze musi być przeprowadzana w obecności odpowiednio dobranych koprecypitantów: octanu sodu, octanu potasu, octanu amonu lub chlorku sodu. Sole te zwiększają wydajność precypitacji, ich nadmiar zaś z wytrąconego osadu jest usuwany poprzez zastosowanie tzw. przepłukania osadu etanolem, zwykle 70%. Zawartość wody w roztworze etanolu rozpuszcza wspólwytrącone z DNA sole, oczyszczając tym samym wyizolowany DNA. Oczyszczanie tego kwasu można także przeprowadzić na specjalnych kolumnach, stosując do tego celu metodę chromatograficzną. Często wyko-