8851686590

16 Inżynieria genetyczna i terapia genowa. Zagadnienia podstawowe i aspekty praktyczne

techniką PGR stosowane są właśnie czasami metody szybkiej i prostej izolacji DNA, oparte na lizie komórek i oddzielaniu poprzez wirowanie składników lizatu od DNA. Czasami sam lizat jest bezpośrednio wykorzystany jako matryca w PCR. Takie procedury mogą być stosowane do celów szybkiej diagnostyki molekularnej, jednak jakość matrycy jest w tym przypadku niezadowalająca i nie nadaje się do bardziej wymagających odmian amplifikacji — np. reakcji typu Long-PCR czy Real-Time PCR.

W sytuacji, kiedy celem jest izolacja długich, niezdegradowanych cząsteczek geno-mowego DNA korzysta się ze specyficznej procedury izolacji DNA z materiału komórkowego zatapianego wstępnie w bloczkach agarozowych. Tak przygotowany materiał poddaje się działaniu proteaz, ewentualnie innych dodatkowych enzymów (np. lizozymu) w celu dezintegracji białek komórkowych czy składników ścian komórkowych. Uwolniony z komórek genomowy DNA pozostaje „zamknięty” w strukturze bloczka agarozowe-go, który następnie można zatopić w żelu rozdzielającym i stosując elektroforezę pulsacyjną — PFEG (Pulsed Field Gel Electrophoresis) rozseparować w zmiennym polu elektrycznym. Stosując napięcie prądu elektrycznego rzędu 6V/cm oraz zmianę impulsów w interwale 90 sekundowym można przeciętnie rozdzielić DNA o wielkości powyżej 2000 kpz, przy czym czas rozdziału to 1—2 dni, (np. chromosomy S. cererisiae o wielkości 1,6 i 2,2 Alpz można rozdzielić stosując napięcie 5,4 V/cm i zmianę impulsu elektrycznego co 90 s).

Izolacja genomowego DNA może być prowadzona zarówno ze świeżego materiału biologicznego, jak i różnego rodzaju materiałów archiwalnych, np. szczątków kopalnych czy też materiałów śladowych, co ma miejsce w przypadku próbek kryminalistycznych (np. włosy, fragmenty tkanek, plamy krwi). Jakość izolowanego DNA z takich próbek jest jednak zadowalająca tylko wtedy, gdy materiał tkankowy bądź komórkowy został odpowiednio zabezpieczony i przechowany do czasu analizy. Zabezpieczenie materiału biologicznego stanowi punkt krytyczny, decydujący o wydajności izolacji i jakości wyizolowanego materiału. Należy pamiętać, że czynniki konserwujące, takie jak formalina, zabezpie-czają/konserwują tkankę, ale wpływają degradująco na materiał genetyczny, stąd archiwalny materiał biologiczny w postaci bloczków parafinowych lub skrawków formalino-wych, tak popularny w histopatologii, jest materiałem łatwo dostępnym, ale trudnym do izolacji wysokiej jakości DNA. W celu uzyskania jak najwyższej jakości materiału genetycznego fragmenty pobranych świeżych tkanek bądź materiał hodowlany powinien być jak najszybciej zabezpieczony przez zamrożenie w niskiej temperaturze — jest to najlepsza forma przechowywania materiału do badań molekularnych. Tak zwane głębokie zamrożenie w temperaturze ciekłego azotu stanowi najlepszą strategię zabezpieczenia materiału do badań.

Analiza jakości i ilości otrzymanych izolatów kwasów nukleinowych przeprowadzana jest dwiema technikami: elektroforezy w żelu agarozowym oraz pomiaru spektralnego, gdzie mierzonym parametrem jest absorbancja z zastosowaniem do pomiarów promieniowania z zakresu UV. Do wyznaczenia stężenia (ilości) DNA w otrzymanym izolacie stosuje się wartość absorbancji przy długości fali 260 nm. Wyznaczony molowy współczynnik absorbancji dla dwuniciowego DNA przy tej długości fali wynosi 50, a więc stężenie DNA w izolacie, który wykazuje absorbancję na poziomie 1 jednostki absorbancji przy k=260 nm wynosi 50 pg/ml. Odpowiednio dla dsRNA współczynnik ten wynosi 40, dla oligoDNA 36, a oligoRNA 33.