8851686592

18 Inżynieria genetyczna i terapia genowa. Zagadnienia podstawowe i aspekty praktyczne

RNaz powinno być głównym celem już w pierwszym etapie izolacji RN A. Podstawową zasadą jest znacznie większa ostrożność i czystość w pracy z RNA w porównaniu z izolacją i analizą DNA. Należy używać jednorazowego sterylnego sprzętu i odczynników, a w przypadku szklą laboratoryjnego i innych utensyliów wielokrotnego użytku należy przeprowadzać ich sterylizację oraz usuwanie RNaz - np. przez sterylizację gorącym suchym powietrzem w temperaturze 200— 240°C przez kilka godzin lub/i przepłukiwanie 0,1 M roztworem wodorotlenku sodu. Woda i odczynniki używane do pracy z RNA powinny być unieczynniane 0,1% roztworem pirowęglanu dietylu (DEPC), który jest silnym inhibitorem RNaz. Izolacja dobrej jakości RNA z komórek bakterii jest jeszcze trudniejsza niż w przypadku komórek eukariotycznych. Wynika to z ekstremalnie krótkiego czasu póltrwania mRNA prokariotycznego (nawet około 3 minut). Prokariotyczne transkrypty nie są chronione na końcach 3’ i 5’, najczęściej mają charakter policistronowy, a degradacja mRNA przez wewnątrzkomórkowe rybonukleazy rozpoczyna się często jeszcze przed zakończeniem procesu translacji.

Izolacja czystego, niezdegradowanego RNA wymaga także odpowiedniego przechowywania próbek w przypadku, gdy izolacja i pobór próbek są rozdzielonymi czasowo etapami. Proces degradacji RNA rozpoczyna się praktycznie tuż po pobraniu próbki do badań. Jedyną skuteczną formą zabezpieczenia RNA w przechowywanych próbkach jest jak najszybsze ich zamrożenie w ciekłym azocie lub temperaturze rzędu -70°C, -80°C. Dostępne są komercyjnie roztwory o specjalnie przygotowanym składzie jonowym (np. RNA-Later® dla bioptatów tkankowych, puli komórkowych roślinnych, zwierzęcych, bakteryjnych oraz dla ochrony całych organizmów, jak na przykład Drosophila. Inne dostępne komercyjne protektanty to: PAXgene dla próbek krwi pełnej, czy RNAprotect Bacteria Reagent dla hodowli bakteryjnych); roztwory te dodatkowo ułatwiają zabezpieczenie przechowywanego materiału w niskiej temperaturze oraz umożliwiają przechowywanie materiału również w temperaturach rzędu 4°C, hamując degradację RNA.

Z uwagi na ogromną podatność RNA na degradację zalecanym sposobem homogenizacji i dezintegracji tkanek do ekstrakcji RNA jest rozdrabnianie w ciekłym azocie. Jest to metoda gwarantująca pomyślną homogenizację tkanki przy jednoczesnym zachowaniu niezdegradowanego RNA do kolejnych etapów izolacji. Nie zawsze jednak jest ona konieczna. Częstą techniką jest mechaniczne rozdrobnienie fragmentów tkanek za pomocą jałowych narzędzi (np. skalpela) lub użycie homogenizatorów. W tym przypadku zaleca się jednak przeprowadzenie homogenizacji w roztworze do lizy komórek zawierającym inhibitory RNaz — zazwyczaj przeprowadza się homogenizację w tym samym roztworze, który używany jest w danej procedurze do lizy komórek i ekstrakcji RNA. Użycie homogenizatorów nie tylko skraca radykalnie czas przygotowania próbki do izolacji RNA (kil-kanaście-kilkadziesiąt sekund), lecz także jest metodą rozbijania komórek, a więc prowadzi do uwolnienia z nich RNA. Izolacja RNA z bioptatów o wysokiej zawartości zrębu lącz-notkankowego (np. mięśnie szkieletowe, mięsień sercowy, skóra) wymaga częściowego nadtrawienia tkanki łącznej przez proteazy (np. proteinazę K). Jest to etap, który w istotny sposób może wpłynąć na jakość i wydajność ekstrakcji RNA. Trawienie powinno być przeprowadzone w możliwie jak najkrótszym czasie i w łagodnych warunkach. W przypadku izolacji RNA z bakterii, drożdży oraz komórek roślinnych można zastosować homogenizację i dezintegrację komórek z użyciem szklanych kuleczek (glass beads). Powinny