8851686588

14 Inżynieria genetyczna i terapia genowa. Zagadnienia podstawowe i aspekty praktyczne

CTAB (bromek cetylotrimetyloamoniowy), który w zależności od zastosowanej siły jonowej służy do selektywnego otrzymywania bądź izolatów DNA genomowego (wysoka siła jonowa), bądź DNA plazmidowego i fagowego (niska siła jonowa). Eliminacja RNA z izolatów dokonywana jest zwykle poprzez ich trawienie RNazą. Czasami wykorzystuje się także selektywne strącanie RNA za pomocą chlorku litu. Dla mutagenizowanych szczepów E. coli KI 2 opracowano specyficzną metodę uzyskiwania tzw. minikomórek. Są to struktury subkomórkowe, które nie zawierają chromosomu bakteryjnego, a jedynie plazmidy. Ich wielkość stanowi około 10% typowej komórki E. coli.

Wszystkie opisane wcześniej metody izolacji plazmidowego DNA prowadzą do otrzymania preparatów znacznie zanieczyszczonych zarówno genomowym DNA, RNA, jak i resztkami lizatu komórkowego. Oczyszczanie izolatów, wymagane do większości aplikacji plazmidowego DNA, można przeprowadzić różnymi metodami. Najwyższą czystość można oczywiście osiągnąć przez ultrawirowanie w gradiencie chlorku cezu z bromkiem etydyny. Jednakże obecnie większość laboratoriów rezygnuje z tej metody ze względu na wysoki koszt aparatury i odczynników oraz długi czas przygotowania takich preparatów (nawet 3—5 dni). Obecnie stosowane metody oczyszczania bazują na selektywnej precypitacji, chromatografii jonowymiennej lub filtracji żelowej. Istnieje także wiele dostępnych komercyjnie gotowych zestawów do izolacji i oczyszczania plazmidowego DNA. Zestawy minikolumn do oczyszczania plazmidów wypełnione są najczęściej anionowymi żywicami typu DEAE (dietyloaminoetyloceluloza), ziemią okrzemkową albo krzemionką. Kolumny chromatograficzne wykorzystuje się zazwyczaj do celów minipreparatywnych, natomiast do izolacji plazmidów na większą skalę stosowane jest oczyszczanie metodą selektywnej precypitacji - najczęściej za pomocą PEG-8000 lub CTAB.

Metodą pozwalającą na najdokładniejszy rozdział genomowego i plazmidowego DNA od zanieczyszczeń RNA i białkami jest ultrawirowanie w gradiencie chlorku cezu w obecności bromku etydyny. W metodzie tej wykorzystywana jest różnica w wielkości i konformacji kwasów nukleinowych: plazmidowy DNA, występujący przede wszystkim w zamkniętej kowalencyjnie postaci kolistej (CCC — coralently closed circles) tworzy wyraźny prążek położony poniżej prążka zawierającego frakcję liniowego DNA i formy zrelaksowanej plazmidów (OC - open circles). Białka tworzą kożuch przy powierzchni, natomiast RNA ulega sedymentacji i opada na dno probówki. Rozdział frakcji DNA można także uzyskać dzięki ultrawirowaniu lizatów komórkowych w gradiencie alkalicznej sacharozy. Wadą tej metody jest duża pracochłonność, długi czas rozdziału (kilkanaście godzin wirowania), a przede wszystkim wysoki koszt specjalistycznej aparatury (ultrawirówka). Bromek etydyny musi zostać usunięty po zakończeniu rozdziału. Można do tego celu zastosować bądź ekstrakcję fenolowo-chloroformową, bądź też oczyszczanie na kolumnach chromatograficznych (np. z żywicą jonowymienną Dowex). Obecność trzech podstawowych konformacji przestrzennych plazmidów ma swoje odzwierciedlenie również w obrazach elektroforetycznych rozdzielanych ekstraktów plazmidowego DNA. Formą najszybciej migrującą w żelu jest forma superskręcona, za nią migruje forma liniowa plazmidowego DNA, najwolniej zaś wędrującą w polu elektrycznym frakcją jest forma zrelaksowana OC plazmidu (yc. 1). Pojawienie się między nimi dodatkowych prążków często jest wynikiem wysokiej zawartości soli w izolacie i spotęgowaniem superskręceń cząsteczek plazmidów, natomiast dodatkowe prążki znajdujące się w pobliżu formy liniowej plazmidu świadczą o jego częściowej degradacji lub pęknięciach cząsteczek.