8851686586

12 Inżynieria genetyczna i terapia genowa. Zagadnienia podstawowe i aspekty praktyczne

•    na miniskalę, tzw. miniprep (izolacja z niewielkich objętości 1—2 ml hodowli),

•    na średnią skalę, tzw. midiprep (umiarkowane ilości hodowli rzędu 10 ml),

•    na dużą skalę, tzw. maksiprep (izolacja plazmidów preparatywna — minimum pól litra hodowli bakteryjnej).

Izolację plazmidowego DNA należy prowadzić ze świeżych hodowli po dokładnym usunięciu medium hodowlanego. W przypadku, gdy nie jest możliwe przeprowadzenie izolacji bezpośrednio po zakończeniu hodowli, odwirowane komórki należy przechowywać w postaci suchego, oddzielonego od medium osadu w niskiej temperaturze (-80°C). Nie należy wydłużać czasu przechowywania materiału, grozi to degradacją i spadkiem wydajności izolacji plazmidowego DNA.

Wybór metody izolacji plazmidowego DNA zależy głównie od wielkości plazmidu, istotne znaczenie ma jednak także szczep bakterii i dalsze przeznaczenie izolatu (np. se-kwencjonowanie, klonowanie, transformacja itp.). Izolacja dużych plazmidów (około 15 kpz) musi być prowadzona stosunkowo ostrożnie, gdyż - podobnie jak w przypadku genomo-wego DNA - może łatwo dojść do mechanicznego uszkodzenia i ffagmentacji plazmidowego DNA. W tym przypadku komórki poddawane lizie powinny być zabezpieczane w buforze izoosmotycznym (dodatek cukrów, takich jak: sacharoza, glukoza), a następnie trawione lizozymem w obecności EDTA. Właściwą liżę przeprowadza się zazwyczaj za pomocą SDS lub innego detergentu. Stosowanie łagodnych detergentów niejonowych (np. Tritonu X-100) i EDTA do lizy komórek w odpowiednich warunkach powoduje rozerwanie błon komórkowych bakterii, przy czym genomowy DNA pozostaje połączony fizycznie z błoną, co jest podstawą separacji frakcji plazmidowego i genomowego DNA bakteryjnego. W takich warunkach powstały lizat można wirować przy wysokich obrotach (ok. 40 000 x g), uzyskując w nadsączu plazmidowy DNA oddzielony od reszty składników komórkowych oraz genomowego DNA bakterii, który — wraz z fragmentami komórek — osadzany jest na dnie probówek podczas wirowania. W kolejnym etapie można dodatkowo oczyścić izolat poprzez ultrawirowanie w gradiencie chlorku cezu. W przypadku izolacji mniejszych plazmidów można stosować bardziej radykalne metody lizy, gdyż nie wpływają one znacząco na integralność izolowanego DNA. Stosowane zwykle protokoły opierają się na lizie alkalicznej lub termicznej wraz z użyciem detergentów.

W przypadku izolacji tych samych plazmidów z różnych szczepów bakteryjnych zauważono różnice w wydajności i czystości izolatu. Najprawdopodobniej ich przyczyną są odmienne pod względem budowy strukturalnej ściany komórkowe bakterii różniące się czasami w subtelny sposób składem cukrowców występujących w tych strukturach komórkowych. Zdecydowanie łatwiej i o większej czystości izoluje się plazmidy ze szczepów E. coli C600, DH1, czy LE392, niż ze szczepów E. coli HB101, czy JM100. W przypadku izolacji plazmidów ze szczepu HB101 nierzadko uzyskuje się ekstrakt w znacznym stopniu zanieczyszczony polisacharydami, co utrudnia między innymi trawienie restryktazami takiego izolatu; dodatkowo szczep HB101 charakteryzuje się wysoką aktywnością endo-nukleazy A. W przypadku nieskutecznej inaktywacji tego enzymu, może dojść do strawienia plazmidu w trakcie procedury izolacji.

Metody izolacji plazmidowego DNA zwykle opierają się na wykorzystaniu charakterystycznych właściwości konformacji plazmidowego DNA. Forma kolistych superskręco-nych cząsteczek (CCC), w jakiej występuje plazmidowy DNA, znacząco wpływa na właściwości fizyczne tego kwasu, a tym samym umożliwia wykorzystanie praktyczne konfor-