8851686595

20 Inżynieria genetyczna i terapia genowa. Zagadnienia podstawowe i aspekty praktyczne

sowane to Trizol® (Gibco BRL) i Tri-Reagent (Sigma). Polska firma A&A Biotechnology produkuje odczynnik o nazwie Fenozol.

Należy podkreślić, iż ani klasyczna metoda fenolowo-chloroformowa, ani żadna jej modyfikacja nie zapewniają stuprocentowej czystości ekstraktu od zanieczyszczeń domieszkami DNA genomowego. Wynika to z faktu przechodzenia części DNA do fazy wodnej. Dodatkowo, przenoszenie nadsączu w wielu przypadkach jest trudne manualnie i może spowodować zaaspirowanie części międzywarstwy, a tym samym zanieczyszczenie ekstraktu DNA genomowym. Istnieją dostępne komercyjnie odczynniki, tzw. phase lockgels np. (firmy Eppendorf), ułatwiające fizyczne oddzielenie obu warstw — wodnej i organicznej — w czasie ekstrakcji i zmniejszenie do minimum ryzyka kontaminacji genomowym DNA. Najbardziej wiarygodne uniknięcie zanieczyszczenia ekstraktu genomowym DNA zapewnia jednak trawienie ekstraktu RNA deoksyrybonukleazami (DNazami). Strategia taka powinna być stosowana zawsze przy ekstrakcji całkowitego RNA.

Oczyszczanie ekstraktu przeprowadzane jest zwykle poprzez precypitację izopropa-nolem i przemywanie 70—75% etanolem. Rzadko stosowaną strategią oczyszczania jest różnicowe wytrącanie RNA za pomocą chlorku litu, co pozwala na uwolnienie ekstraktu od domieszek genomowego DNA. Można także stosować oczyszczanie metodą chromatografu na kolumienkach wypełnionych złożem krzemionkowym. Jest to metoda gwarantująca znacznie wyższą czystość RNA, co odbywa się jednak kosztem zmniejszonej wydajności ekstrakcji.

Przechowywanie ekstraktów RNA w postaci suchego osadu jest metodą zabezpieczającą integralność RNA na dłuższy czas pod warunkiem przechowywania w niskiej temperaturze (rzędu -70°C). Przechowywanie rozpuszczonego ekstraktu niesie już ryzyko degradacji, nawet jeżeli jest umieszczony w niskiej temperaturze. Największe straty powoduje kilkukrotne zamrażanie i rozmrażanie ekstraktów. Dodatkowym czynnikiem zabezpieczającym przed degradacją jest dodawanie do rozpuszczonego ekstraktu RNA enzymatycznych inhibitorów RNaz dostępnych komercyjnie.

Najczęstszym celem izolacji RNA jest następcza analiza frakcji mRNA. Jej olbrzymia heterogenność sprawia, że nie ma możliwości łatwego izolowania mRNA za pomocą elektroforezy, czy też innymi metodami opierającymi się na różnicach mas molekularnych. Skutecznym sposobem izolacji czystej frakcji mRNA jest technika chromatografii powinowactwa. Ekstrakt całkowitego RNA jest nanoszony na kolumnę wypełnioną złożem oligo(dT)-celulozowym lub oligo(dU)-sefarozą. Końce 3’ większości trans krypto w mRNA są poliadenylowane, co pozwala na ich selektywne związanie z oligonukleotydami polity-midynowymi lub poliurydynowymi.

Kolejną, często analizowaną frakcją, zwłaszcza u bakterii, jest frakcja rybosomalne-go RNA. W tym przypadku, ze względu na charakterystyczne masy cząsteczkowe, istnieje ewentualna możliwość izolacji rRNA z populacji całkowitego RNA po przeprowadzeniu jego wcześniejszego rozdziału elektroforetycznego. Tego typu procedura jest jednak stosunkowo rzadko przeprowadzana.

Ocena jakościowa i ilościowa ekstraktów RNA dokonywana jest spektrofotome-trycznie oraz elektroforetycznie. Elektroforezę ekstraktów RNA przeprowadza się w 0,5— 1% żelach agarozowych z dodatkiem czynnika denaturującego (mieszanina 50% formamidu z glioksalem lub formaldehyd). Zadaniem czynnika denaturującego jest eliminacja struktur drugorzędowych RNA wynikających z tworzenia struktur pseudodwuniciowych