8857685799

4.    Po zabarwieniu żel inkubować w roztworze odbarwiającym do uzyskania prawie przezroczystego tła i wyraźnych prążków białek- od kilku do kilkudziesięciu minut. Żel po odbarwieniu może być długo przechowywany w roztworze 7% kwasu octowego.

5.    Oszacować ilości białka w żelu tak, aby w badanych próbach mieć zbliżone ilości histonów rdzeniowych. Ilości można oszacować „na oko”, co bywa zawodne lub zeskanować wybarwiony żel białkowy i oszacować ilości za pomocą programu komputerowego np. ImageJ

Należy pamiętać o tym, że jakość rozdziału w SDS-PAGE zależy od poprawnego i solidnego wykonania szeregu prostych czynności. Dlatego też, mimo iż technika nie jest skomplikowana, może zajmować sporo czasu, kilkakrotnie więcej niż elektroforeza agarozowa służąca do rozdziału preparatów DNA.

Ew. dodatkowa elektroforeza (lub kilka)

-    do ustawienia ilości białka, może okazać się niezbędna.

Dzień 4. Western biot

Technika western biot wykorzystywana jest do detekcji i identyfikacji białek. Procedura składa się z kilku części. Pierwszym etapem jest rozdzielenie mieszaniny białek w żelu poliakrylamidowym. Następnie białka przenoszone są na membranę (w naszym przypadku jest do transfer pół-suchy), która niespecyficznie wiążą wszystkie białka. Po transferze wolne miejsca na membranie są blokowane, aby zapobiec niespecyficznej adsorpcji przeciwciał. Antygeny będące przedmiotem badań identyfikuje się przy użyciu wyznakowanych przeciwciał, bądź przeciwciał niewyznakowanych a identyfikowanych poprzez wyznakowane przeciwciała drugorzędowe specyficzne dla pierwszorzędowych. W końcu następuje detekcja, której sposób zależy od rodzaju użytych przeciwciał. W trakcie ćwiczeń wykorzystamy niewyznakowane przeciwciała pierwszorzędowe rozpoznające histon H3 z ufosforylowaną seryną 10 i drugorzędowe sprzężone z alkaliczną fosfatazą.

Materiały:

-    nie barwiony żel poliakrylamidowy z rozdzielonymi białkami

-    membrana Westran

-    bibuła Whatman

-    transblotter

-    zasilacz

-    kołyska laboratoryjna

Odczynniki:

-    bufor TGM:

M/i 25 mM Tris \j? 192 mM glicyna

20% metanol

-    TBST:

^ 20 mM TrisHCl pH 8.0 V }? 165 mMNaCl

0.2 % Tween

odtłuszczone mleko w proszku

mysie przeciwciała pierwszorzędowe (anty-

fosfo (ser 10)- histon H3)

przeciwciała drugorzędowe (anty-mysie

sprzężone z alkaliczna fosfatazą)

PDS - phosphatase developing solution 0,1 MNaCl,

0,01 M MgSOj 0,1 M Tris-HCl pH9.5 100 mg/ml NBT (Nitro-Blue Tetrazolium Chloride)

50 mg/ml BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3’-Indolyphosphate p-Toluidine Salt) woda destylowana

Przygotowanie membran do transferu.

W technice western-blot wykorzystuje się różne membrany. W trakcie ćwiczeń wykorzystujemy membranę Westran, która jest membraną hydrofobową PVDF.

Wykonanie:

1.    Wyciąć membrany nieco większe (ok.2-5 mm) od wielkości żelu (uwaga: nie dotykać membrany palcami, używać pęset).

2.    Umieścić na 15 sekund w metanolu, przepłukać dobrze wodądestylowanąi umieścić wbuforzedo transferu TGM na ok. 10-15 minut. Przygotować 8 kawałków (wielkości membrany) bibuły Whatman.

Układanie transferu

3. Ułożyć na blacie aparatu do transferu: 4 kawałki bibuły Whatman nasączonej buforem TGM, następnie membranę, żel i kolejne 4 bibuły przygotowane jak powyżej. Przy układaniu transferu należy uważać, aby nie tworzyły się pęcherze powietrza pomiędzy kolejnymi warstwami. Na koniec całość można „przerolować” (np. falkonem) i delikatnie wycisnąć spomiędzy warstw ewentualne pęcherze.