SYNAPSA IMMUNOLOGICZNA

Synapsa (gr. synapsis = połączenie)- styk, złącze między komórkami, gdzie następuje przekazywanie sygnału z jednej komórki do drugiej

XIXw. - słowo użyte do opisu połączenia między dwoma chromosomami, a następnie zastosowane w opisie połączeń neuronów

Synapsa immunologiczna - termin zastosowany w opisie interakcji komórek T z komórkami APC

Norcross, M. A. A synaptic basis for T-lymphocyte activation. Ann. Immunol. (Paris)135D, 113-134 (1984).

 Paul, W. E. et al. Regulation of B-lymphocyte activation, proliferation, and differentiation. Ann. NY Acad. Sci. 505, 82-89 (1987).

Wykrycie obecności SMACs (supramolecular activation clusters) w immunologicznej synapsie

Monks, C. R., Freiberg, B. A., Kupfer, H., Sciaky, N. & Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature 395, 82-86 (1998).

Synapsa immunologiczna (IS) to strefa styku błon komórek (np. limfocyty T i APC) w której przekazywane są informacje warunkujące wzajemną odpowiedź.

Obecna definicja IS bazuje na polaryzacji komórek, segregacji cząsteczek adhezyjnych i receptorów TCR limfocytów T w strefie styku między komórkami T i APC.

Dustin ML, Colman DR (2002) Neural and immunological synaptic relations. Science 298:785-789

Techniki stosowane w badaniach synapsy immunologicznej

Wide-field epi-illumination fluorescence microscopy

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) - ok. 80μm

Spinning (Nipkow) disk confocal microscopy. CHARGE COUPLED DEVICE (CCD)

Two-photon and multi-photon laser scanning microscopy - ok. 450 μm, fala wzb. - 900nm

Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) FLUORSCENCE RESONANCE ENERGY TRANSFER (FRET) - wykorzystuje przeniesienie energii między parami fluorochromów.

Interference-reflection microscopy (IRM), TOTAL INTERNAL REFLECTION MICROSCOPY (TIRFM)

Modele doświadczalne

Komórki Jurkat T i Raji B plus superantygen

Hybrydy komórek T

Stabilne klony i linie kom. T

Pierwotne linie kom.T stymulowane in vitro

Obrazowanie in vivo

Lipidowe układy dwuwarstwowe (sztuczne błony) - techniki IRM i TIRM

Tworzenie synapsy

Wzajemny kontakt dwóch komórek i następnie przesunięcie centrosomu w kierunku synapsy

Transport wewnątrzkomórkowych pęcherzyków i powierzchniowych receptorów (TCR, kostymulatory) doprowadzącego lamellipodium

IS może trwać od kilku minut do kilkunastu godzin

Rodzaj i ilość przekazanych informacji zależy od stanu komórek i czynników środowiska

Czynniki decydujące o IS

Czas i dynamika interakcji

Rodzaj zaangażowanych receptorów cząsteczek sygnałowych

Siła przekazywanego sygnału

Obecność sekrecji

Limfocyt T i APC - fazy interakcji

FAZA I - inicjacja kontaktu

Po adhezji do APC limfocyt T ulega zaokrągleniu (zanik uropodium)

Boczna ruchliwość limf. T w stosunku do błony APC jest mniejsza niż 1 μm/min, co pozwala na redystrybucję receptorów

FAZA II - formowanie płaszczyzny interakcji

Polaryzacja w kierunku APC i powolny rozwój przebudowy cytoszkieletu w strefie kontaktu obu komórek

Boczna ruchliwość 1 do 2 μm/min

Wzajemne przemieszczanie się ułatwia wejście i wyjście receptorów z i do obszaru synapsy

FAZA III - odłączanie się limfocytu T i jego dalsza migracja

Zwiększenie aktywności ruchowej

Polaryzacja komórki i ruch postępowy 1 do 10 μm/min prowadzący do odczepienia się komórki

APC a typ synapsy

Stabilność i czas trwania interakcji jest odwrotnie skorelowana z morfologiczną złożonością i aktywnością cytoszkieletu APC

Limfocyt T a synapsa

Typ limfocytu (T CD4+, T CD8+)

Stan aktywacji (limfocyty T bardziej zaktywowane tworzą kontakty bardziej dynamiczne i krócej trwające)

Rola gęstości kompleksów MHC - peptyd

Gęstość powierzchniowa kompleksów MHC - peptyd agonistyczny jest wprost proporcjonalna do czasu trwania i intensywności indukowanego sygnału zależnego od kationów wapnia

Podwyższony poziom kationów wapnia wyzwala przejściowy sygnał stop, co powoduje silniejsze związanie

Znaczenie gęstości kompleksów MHC - peptyd

Około 1-400 specyficznych kompleksów MHC - peptyd na APC może całkowicie zaktywować co najmniej kilka limfocytów T

Można monitorować konsekwencję interakcji limf. T - APC, badając wzrost wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia i zachowanie się białek przyczepionych do GFP

Wykazano w ten sposób, że niektóre limf. T CD4+ mogą odpowiadać nawet na jeden ligand, słabo wpływając na ciągle zmiany stężenia wapnia

Limfocyt T może wytworzyć sygnał po reakcji z nawet tylko jednym ligandem, ale co najmniej 10 jest potrzebnych aby zwiększyć i podtrzymać poziom wapnia wewnątrz komórki.

Jeśli cząsteczki CD4 będą zablokowane, to do otrzymania odpowiedniego efektu potrzeba 25-30 kompleksów MHC - peptyd.

To wskazuje na fakt, iż CD4 są wymagane przy rozpoznawaniu antygenów o małej gęstości powierzchniowej.

Zależności indukowanego sygnału wapniowego od ilości kompleksów peptyd - MHC na APC, przy obecności/braku CD4

Wzrost poziomu wapnia jest kluczowy do aktywacji limfocytu T, ponieważ indukuje obecność w jądrze komórkowym czynnika transkrypcyjnego NF-AT odpowiedzialnego za wiele zmian
w ekspresji genów związanych z aktywowanymi limf. T

Być może połączenie jednego liganda, wraz z dostarczeniem kinazy LCK przez cząsteczki CD4 i CD8, wystarcza do inicjacji kaskady sygnału.

W reakcji z rozpuszczalnym kompleksem MHC - peptyd wymagane są dimery lub wielomery TCR do aktywacji limfocytu T.

W reakcji kompleksu MHC - peptyd z limfocytem Tc CD8+ wystarczają monomeryczne TCR, pod warunkiem współdziałania fibronektyny lub CD18/CD11.

Sugeruje się istnienie modelu pseudodimeru - CD4 wiąże krzyżowo 2 TCR, z których jeden wiąże kompleks: agonistyczny peptyd-MHC, a drugi wiąże się słabo z endogennym kompleksem peptyd - MHC, którego duże ilości ulegają wiązaniu z TCR i są rekrutowane do synapsy.

Rola siły agonistycznej peptydu

Swoistość łączenia limf. T z APC jest dodatnio skorelowana z powinowactwem lub awidnością TCR do kompleksu MHC-peptyd

faworyzacja stabilnej i wydłużonej interakcji, jeśli peptyd jest agonistą

Rola środowiska

Środowisko o wysokiej złożoności (np. narządy miąższowe, strefa grasiczozależna węzłów chłonnych) → dynamiczny kontakt limf. T i APC

Środowisko o niskiej złożoności (np. zatoka brzeżna węzłów chłonnych) → stabilna agregacja

RODZAJE SYNAPS

Podział synaps pod względem rodzaju molekularnej struktury płaszczyzn kontaktujących się

1.Synapsa stabilna (monocentryczna)

2.Synapsa wydzielnicza (efektorowa)

3.Synapsa częściowo posegregowana (multicentryczna)

4.Synapsa nieposegregowana

5.Synapsa dynamiczna

Synapsy immunologiczne różnią się:

Właściwościami fizycznymi

Czasami istnienia

Wykazują zmienność, różnorodność oraz niejednorodność rozwoju

1. SYNAPSA MONOCENTRYCZNA

Spolaryzowana interakcja limf. T i APC

Trwa 30' albo dłużej

Powstaje dzięki rekrutacji i segregacji receptorów powierzchniowych i białek adaptorowych

Powoduje ciągłą transmisję sygnałów wewnątrzkomórkowych

Fazy istnienia synapsy monocentrycznej

I.Skanowanie powierzchni, kontakt, areszt adhezyjny

II.Wczesne gromadzenie molekuł i przekazywanie sygnału

III.Dojrzewanie i segregacja receptorów

IV.Internalizacja TCR

V.Rozpad

Faza I

1.Limf. T rozpoznaje kompleks MHC-peptyd oraz intracellular adhesion molecule (ICAM-1)

2.Przejściowy areszt (sygnał stop)

3.CD4 zbliża się do łańcucha ξ CD3

Faza II

1.Rekrutacja CD3ξ, LCK, ZAP70 (ξ-chain associated protein kinase of 70kDa), kinaza 3-fosfatydyloinozytolu (PI3K)

2.Fosforylacja LCK, ZAP70

3.Uruchomienie sygnałów zależnych od wapnia

4.ZAP70 → Pi+LAT (linker for activation of T cells); LAT zawiera immunoreceptor tyrosine-based activation motifs (ITAMs), po ich fosforylacji mogą się do nich przyłączać Src homology 2 domains kinaz oraz białek adaptorowych

5.PI3K przyłącza się do LAT → wzrost stęż. trójfosforanu inozytolu → jego zgrupowanie → rekrutacja białek zawierających pleckstrin homology domain czyli WAVE i AKT = PKB

6.TCR, CD4, CD28 i inne - migracja do obszaru kontaktu (transport - cytoszkielet, mikrotubule)

7.Organizacja platformy sygnałowej TCR (PI3K, PLC, homologiczna do RAS rodzina GTP-az)

8.Małe GTP-azy RAC1 i RHO-A → wzrost dynamiki de- i polimeryzacji aktyny

9.Kostymulacja => aktywacja kofiliny → rozpad F-aktyny (warunek remodelingu sieci) → wspomożenie RAC1

Wpływ wielkości cząstek powierzchniowych na ich segregację

W aktywnym procesie cząsteczki powierzchniowe są transportowane z całego limfocytu T do synapsy.

Aby cząsteczki powierzchniowe mogły się przemieszczać potrzebne są sygnały z TCR i CD28/LFA-1

Następuje również przegrupowanie mikrodomen (LIPID RAFTS) (glikolipidy, cholesterol)

Mniejsze, stabilne połączenia receptorów z ligandami wykluczają ze swego sąsiedztwa większe białka błonowe

Większe molekuły chronią mniejsze białka błonowe przed kontaktem z adekwatnym receptorem

Sąsiadujące ligandy po połączeniu z receptorami spowodują pofałdowanie błony komórkowej (termodynamicznie niekorzystne)

Powiększenie rozmiaru CD48, łączącej się z CD2, hamuje aktywację limfocytu T.

Duże rozmiary pary ICAM-1 - LFA-1 powodują że mieści się ona w pSMAC,
a CD45 jest z podobnych przyczyn wyrzucana poza obwód pSMAC, daleko od centralnie położonej, dużo mniejszej pary peptyd-MHC - TCR. Później wraca do pSMAC.

Wpływ innych czynników na segregację cząsteczek powierzchniowych

Agryna - (glikoproteina, normalnie występuje w złączu nerwowo - mięśniowym, gdzie pomaga w kontroli rec. Ach) indukuje polaryzację TCR, CD28 i mikrodomen w spoczynkowych limfocytach T

MGAT5 - enzym szlaku N-glikozylacji - w skrócie: powoduje podwyższenie progu aktywacji limf. T

Faza III

Okres trwania 5 - 30 minut interakcji

Dochodzi do molekularnej segregacji

cSMAC (central supramolecular activation cluster) - TCR, CD3, PKC, CD28, CD2, CTLA4, (CD4, CD45)

pSMAC (peripheral) - LFA1 (lymphocyte function -associated antigen 1)

dSMAC (distal) - CD45

•IFN-γR, IL-4R => pomoc w kostymulacji

Warstwy SMAC

cSMAC - część środkowa SMAC (TCR, efektory przekazujące sygnał w dół - kinaza proteinowa C-Θ → PKC-Θ)

pSMAC - cześć peryferyjna SMAC (cząsteczki adhezyjne, np. LFA1)

dSMAC - obszar poza pSMAC (tu duże cząsteczki, takie jak CD43, CD45)

Po kontakcie z APC TCR-CD3 i CD4 znajdują się w centrum synapsy, ale później tylko TCR-CD3 dalej tam pozostaje, natomiast CD4 przemieszcza się na obwód.

Rekrutacja ZAP70 do TCR-CD3 jest procesem dynamicznym (szybkie łączenie się
i rozłączanie)

LCK najpierw lokalizuje się w cSMAC, potem przechodzi do pSMAC

Faza IV

Internalizacja TCR stanowi ujemne sprzężenie zwrotne regulujące pobudzenie i prowadzi do rozpadu synapsy

Faza V

Na początku pewne fragmenty błon pozostają ogniskowo w kontakcie

Możliwe dalsze reakcje:

Hamowanie ekspresji TCR i cząsteczek adhezyjnych

Stymulacja ekspresji inhibitorów przesyłania sygnału (np. CTLA4)

Indukcja ekspresji chemokin i ich receptorów → wzrost ruchliwości

Redystrybucja współzawodniczących cząsteczek adhezyjnych (np. CD43) do strefy kontaktu

2. SYNAPSA WYDZIELNICZA

Wariant synapsy stabilnej tworzony przez Tc, Th, NK i komórkę docelową, która ma zostać uszkodzona bądź wystawiona na wpływ cytokin (np. aktywacja limf. B przez limf. Th)

Przekazuje stały sygnał

Podobne fazy jak w synapsie stabilnej

Do cSMAC przylega domena wydzielnicza, która zawiera centrosom (MTOC), spolimeryzowaną tubulinę i nowo zrekrutowane granule; ten region odpowiada za ogniskową egzocytozę zawartości pęcherzyków

Zewnętrzny pierścień adhezji stabilizuje połączenie i redukuje wyciek uwalnianych czynników, co pozwala na zogniskowanie wydzielania

Zawartość granul komórek Tc i Th

Tc: granzymy, perforyna, proteoglikany, białka lizosomalne

Th: IL-2, IL-4, IL-5, IFN-γ

LIMFOCYTY Th

Kontakt limf. Th z APC trwa zwykle ponad 10 godzin

TCR przekazuje sygnał do produkcji wtórnych przekaźników: Ca2+ i kinazy fosfatydyloinozytolu (PI3K)

Dochodzi do zmian w transkrypcji genów po kilku godzinach od kontaktu z APC

Następuje sekrecja IL-2 i innych cytokin

Proliferacja limfocytu T zachodzi po 24-48 godzinach od kontaktu z APC, trwa kilka dni; dochodzi do 3-4 kolejnych podziałów komórkowych

Kiedy komórka jest już aktywowana szybko z powierzchni wyrzucane są kompleksy TCR - CD3, są jednocześnie zastępowane nowo produkowanymi receptorami;

CTLA4 rywalizuje z CD28 o wiązanie się z CD80/CD86 i po ich związaniu hamuje przekaz sygnału z TCR przez rekrutację wewnątrzkomórkowej fosfatazy SHP2, która defosforyluje zaktywowane CD3

LIMFOCYTY Tc

W obrębie cSMAC występuje wyspecjalizowany region, który przekazuje cytolityczne ziarnistości. Region ten pozbawiony jest TCR.

Rozłączenie komórek może nastąpić szybko po fazie inicjacji.

Limf. Tc wymaga tylko kilku kompleksów peptyd - MHC, aby zabić komórkę.

Jeden limf. Tc może tworzyć synapsy z kilkoma komórkami

3. SYNAPSA MULTICENTRYCZNA

Sortowanie molekuł zatrzymuje się, zanim uformowały się cSMAC i pSMAC

Zgrupowywanie się TCR i CD3 zostaje przerwane → powstają niejednolite agregaty do 1 μm wielkości

Są dowody, że odgrywa rolę w sygnalizacji z udziałem TCR między limf. T i komórkami dendrytycznymi

Kiedy powstaje synapsa multicentryczna?

APC o wysokiej aktywności cytoszkieletu

Tworzą ją tymocyty podczas negatywnej selekcji

4. SYNAPSA NIEPOSEGREGOWANA

TCR i białka sygnałowe są rozproszone w obrębie obszaru interakcji

Przekazuje całą gamę sygnałów

Wyróżnia się 4 typy synaps :

a)Synapsa niespecyficzna

b)Synapsa wczesna przejściowa

c)Rozlany kontakt cytolityczny (dyfuzyjna)

d)Synapsa między dziewiczym limf. T i DC

(a) Synapsa niespecyficzna

In vitro: gdy limf. T łączy się z APC bez rozpoznawanego antygenu

Występuje małe zagęszczenie CD3, słaba fosforylacja w szlakach sygnałowych, niewielka ilość uwolnionego wapnia

In vivo: dynamiczny kontakt bez związania adhezyjnego

Niska liczebność peptydów endogennych lub słabe powinowactwo TCR do nich

(b) Synapsa wczesna przejściowa

Trwa minuty, generuje silny sygnał mimo nieuporządkowania

(c) Rozlany kontakt cytolityczny (dyfuzyjna)

Przy małej ilości antygenu nie dochodzi do wytworzenia synapsy sekrecyjnej między Tc i komórką docelową

Mimo nieuporządkowania następuje egzocytoza i zabicie komórki docelowej

(d) IS między dziewiczym limf. T i DC

Kiedy nieaktywowany lub aktywowany limf. T jest stabilnie w interakcji z DC, często nie dochodzi do segregacji i limf.T pozostanie w fazie adhezyjnej, słabo ruchliwej o typie wczesnym

5. SYNAPSA DYNAMICZNA

Powstaje, gdy nie dochodzi do zahamowania migracji limf. T

Limf. T migrujący wzdłuż powierzchni APC może uskutecznić sygnalizację

Obserwacje in vitro i in vivo np. limfocytoblasty migrujące po powierzchni aktywowanych fibroblastów

INTEGRACJA PRZEKAZYWANEJ INFORMACJI

 koncepcje integracji informacji w limf. T:

Model pojedynczego zetknięcia się

Model wielokrotnego zetknięcia się

Model kinetycznego przechodzenia

Model pojedynczego zetknięcia się

Jeden długotrwały i stabilny kontakt wystarczy do pobudzenia

Zdarza się to rzadko, ponieważ wystarczająco długo trwająca stabilizacja jest niełatwa do osiągnięcia

Model wielokrotnego zetknięcia się

Dynamiczne interakcje trwają zbyt krótko, by wzbudzić dostateczną aktywację

Limf. T musi wymieniać informacje z wieloma APC

Następuje kumulacja poszczególnych sygnałów → aktywacja

Model kinetycznego przechodzenia

Strefa grasiczozależna węzła chłonnego myszy

Faza I: wiele dynamicznych kontaktów limfocyta T i wielu DC → wczesna aktywacja

Faza II: stabilny, długi lub powolnie dynamiczny kontakt z DC → transformacja blastyczna

Faza III: limfocytoblast znów wymienia informacje z licznymi DC

Faza IV (tylko CD4): kontaktowanie się blastów w sieci DC

Podczas tych faz dziewiczy limfocyt T zbiera informacje o różnym charakterze

Rodzaj synapsy a los komórek

Pozytywna selekcja w grasicy - czas trwania przekazywania sygnału wpływa na równowagę między liczbą limf. CD4 i CD8

utrzymanie puli rezerwowej i różnorodności repertuarowej - seria podprogowych sygnałów przekazywanych podczas powstawania synaps niespecyficznych - wędrówka dziewiczych limf. T i spotykanie różnych DC

Wstępna aktywacja limf. T - dziewicze CD4 i CD8 wchodzą w interakcje dynamicznie wiele razy z DC → transformacja blastyczna, ale nie do rozwoju wszystkich funkcji efektorowych

Polaryzacja limf. T w kierunku Th - wymagany jest długotrwały, stabilny kontakt z APC, na zróżnicowanie Th wpływa rekrutacja pewnych receptorów i cząsteczek adhezyjnych (IFN-γR → Th1)

Indukcja tolerancji - niedojrzałe DC → krótkie i dynamiczne kontakty z limf. T CD8 → krótkotrwała, klonalna ekspansja

Funkcja wydzielnicza limf. Th i Tc - wysokie stężenia substancji wydzielonych i uszczelnienie szczeliny synaptycznej przez zewnętrzny pierścień adhezyjny - pomoc dla limf. B (Th), zabicie komórki docelowej (Tc)

Wychwytywanie rzadkich limf. T - stabilizacja kontaktu, by raz nawiązany nie został utracony

Odpowiedź indukuje immunodominujący antygen, gdy podane różne - „walka o antygen” - poprzez regulację stabilności kontaktu synaptycznego

Zmiana pozycji koniugatów komórkowych - np. połączone ze sobą limf. B i T migrują z dużą prędkością w węźle chłonnym

6

---