Immunodiagnostyka, Uczelnia SUM, immunologia


IMMUNODIAGNOSTYKA

Reakcje precypitacji - antygeny biorące udział w reakcji to antygeny białkowe, zarówno pełnowartościowe jak i resztkowe (hapteny); cechą charakterystyczną jest ich wielowartościowość (jednowartościowe, posiadające tylko jedną determinantę antygenową [epitop] nie precypitują, choć też nie wszystkie wielowartościowe precypitują), ponadto są rozpuszczalne (co różni je od antygenów biorących udział w precypitacji, które tworzą zawiesinę); przeciwciała biorące udział w reakcji precypitacji noszą nazwę precypityn. Nieprecypitujące przeciwciała mają niskie powinowactwo do antygenu, albo wykazują dwuwartościowość monogamiczną (dwa miejsca wiązania dla dwóch determinant tej samej cząsteczki antygenu).

Reakcje precypitacji zachodzą w dwóch etapach:

utworzenie strątu → wytrącenie kompleksu pod wpływem elektrolitów obecnych w środowisku reakcji; etap ten zachodzi tylko w optymalnych warunkach - w strefie ekwiwalencji (odpowiednie proporcje antygenu i przeciwciała; w przypadku nadmiaru któregoś z reagentów powstają niewidoczne kompleksy rozpuszczalne).

Przeciwciała o bardzo wąskiej strefie ekwiwalencji (wąski zakres stężeń reagentów, w którym ulegają one precypitacji) nazywamy przeciwciałami flokulującymi. Powstały w wyniku flokulacji precypitat ma postać luźnych kłaczków.

Optymalne warunki precypitacji: 0.15-molowy roztwór NaCl, pH 6.4-8.5

W przypadku surowic ludzkich, reakcje przebiegają identycznie w temperaturach 20 i 37°C.

Należy w reakcjach precypitacji stosować surowice zinaktywowane (pozbawione dopełniacza, który wiąże się z kompleksem antygen-przeciwciało powodując częściowe jego rozpuszczenie).

Odczyny precypitacji w środowisku płynnym:

Odczyn precypitacji szkiełkowej → na szkiełko przedmiotowe nakrapiamy roztwór antygenu i surowicy i intensywnie mieszamy. Na dnie kropli pojawia się strąt;

Odczyny precypitacji w środowisku stałym (immunodyfuzja):

Pozwalają badać jednocześnie wiele układów antygen-przeciwciało; oparte są na zjawisku dyfuzji w żelu (agarowym, agarozowym lub poliakrylamidowym) - na granicy zetknięcia się dyfundujących reagentów (w ich strefie ekwiwalencji) powstają linie precypitacyjne. Przebieg immunodyfuzji zależy od wielkości cząsteczek i ich stężenia. Optymalne pH to 6.0-9.0, temperatura zazwyczaj pokojowa. Po zakończeniu badania preparaty się utrwala (płucze w NaCl, potem w wodzie destylowanej by usunąć cząstki reagentów nie związane w kompleksach; suszy przykrywając bibułą; wybarwia - najczęściej czernią amidową).

Immunodyfuzja pojedyncza → gdy jeden reagent dyfunduje, a stężenie drugiego jest stałe.

Immunodyfuzja podwójna → gdy oba reagenty dyfundują.

Obie można przeprowadzać w probówkach (metoda Oudina) lub na płytkach (metoda Outcherlony'ego):

Podwójna immunodyfuzja probówkowa → na dno probówki wlewa się agar z surowicą, następnie warstwę samego agaru, potem roztwór antygenu, lub żel zawierający antygen - reagenty dyfundują do żelu obojętnego;

Pojedyncza immunodyfuzja płytkowa (immunodyfuzja radialna) → przeciwciała miesza się z płynnym agarem i wylewa na płytkę, po zastygnięciu wycina się studzienki i wypełnia roztworem badanego antygenu. Antygen dyfunduje pierścieniowo, tworząc pierścieniowe strefy precypitacyjne o średnicy wprost proporcjonalnej do stężenia antygenu, które można wyliczyć porównując do krzywej kalibracyjnej;

Immunoelektroforeza - metoda łącząca elektroforezę z podwójna immunodyfuzją:

immunodyfuzja rozdzielonych elektroforetycznie antygenów i odpowiednich przeciwciał (w agarze wycina się rowek równoległy do kierunku migracji, i dodaje się do neigo surowicę → antygeny i przeciwciała dyfunduja, dając linie precypitacyjne w ich strefie ekwiwalencji; im wyższe bylo stężenie antygenu, tym bliżej rowka z surowicą znajduje się linia precypitacyjna).

Wyróżniamy:

Immunoelektroforezę rakietkową wg. metody Laurella → pozwala na ilościowa ocenę poszczególnych białek; na płytkę wylewa się agar z przeciwciałami, do studzienek dodaje się badany płyn ustrojowy i poddaje elektroforezie. Linie precypitacyjne przyjmą kształt stożka (rakietki), którego wysokość jest wprost proporcjonalna do stężenia antygenu (które odczytamy z krzywej wzorcowej);

Elektroimmunodyfuzję (immunoelektroforeza przeciwprądowa) → w żelu agarowym wycina się dwie studzienki, do jednej wprowadza sie antygen, do drugiej przeciwciala i poddaje się elektroforezie (warunki dobrane tak, by reagenty wędrowały do siebie) - łuki precypitacyjne widoczne już po 30 minutach!

Aglutynacja - reakcja, w której dochodzi do zlepiania się elementów upostaciowanych (aglutynogenów, którymi mogą być komórki np. erytrocyty lub sztuczne nośniki antygenu, np. cząsteczki lateksu, bentonitu, polistyrenu) pod wpływem swoistych przeciwciał (aglutynin) skierowanych przeciwko antygenom znajdującym się na ich powierzchni (własnym lub obcym, uprzednio opłaszczonym na ich powierzchni).

Przeciwciała niekompletne → nie mają zdolności aglutynacyjnych (mały kąt rozwarcia regionu zawiasowego powoduje powstawanie wiązania monogamicznego, tylko z jednym antygenem).

Cząsteczki antygenu posiadające ładunek elektrostatyczny nie aglutynują.

Reakcja aglutynacji zachodzi dwuetapowo:

wypadanie z roztworu powstałych kompleksów w postaci dobrze widocznych agregatów (aglutynatów).

Warunkami optymalnymi są: pH 6.8-7.2, 0.15-molowy roztwór NaCl, temperatura pokojowa.

Reakcje aglutynacji można podzielić na dwa typy:

  1. metoda szkiełkowa - na szkiełku przedmiotowym umieszcza sie kroplę zawiesiny badanego antygenu i kroplę wstępnie zinaktywowanej surowicy zawierającej swoiste przeciwciała (aglutynaty tworzą na dnie kropli wyraźny strąt) → metoda stosowana do oznaczania grup krwi w zakresie układu AB0, lub w diagnostyce leptospirozy (odczyn Fletschera)

  2. metoda probówkowa - metoda półilościowa; w szeregu probówek przygotowuje się kolejne rozcieńczenia badanej surowicy, do każdej dodaje się taką samą ilość aglutynogenu; miano przeciwciał podaje się jako odwrotność największego rozcieńczenia surowicy, przy którym wystąpiła jeszcze aglutynacja → metoda stosowana w diagnostyce duru brzusznego (odczyn Widala), duru plamistego (odczyn Weil-Felixa) czy brucelozy (odczyn Wrighta)

Biorąc pod uwagę rodzaj antygenu powierzchniowego, wyróżniamy trzy typy aglutynacji bakterii:

aglutynację O (komórkową, grudkową) - związaną z obecnością antygenu somatycznego O (bakterie zlepiają się biegunami, aglutynaty tworzą zwarte grudki opadające na dno probówki);

aglutynację Vi - związaną z obecnością antygenu powierzchniowego Vi (bakterie przylegają do siebie całą powierzchnią, aglutynaty osadzają się na dnie i bocznych sciankach probówki)

  1. odczyn lateksowy - cząsteczki lateksu opłaszczone danym antygenem inkubuje sie z badaną surowicą i ocenia wystąpienie aglutynacji -> metoda stosowana do wykrywania czynnika reumatoidalnego (RF) przy diagnozowaniu reumatoidalnego zapalenia stawów, do wykrywania obecności antystreptolizyny O w diagnozowaniu trwających i przebytych chorób paciorkowcowych
    (test w wersji odwróconej wykorzystywany jest do wykrywania obecności białka C-reaktywnego CRP w surowicy)

odczyn hemaglutynacji - zjawisko aglutynacji erytrocytów opłaszczonych uprzednio danym antygenem, w obecności swoistych przeciwciał skierowanych przeciwko temu antygenowi (erytrocyty będące nośnikiem nie powinny same reagować z badana surowicą, dlatego stosujemy erytrocyty barana, lub ludzkie grupy 0 Rh-); oceniamy makroskopowo wystąpienie aglutynacji (dno płytki równomiernie pokryte krwinkami - wynik dodatni; na dnie zbity "guziczek" z erytrocytów - wynik ujemny)

odczyn hamowania hemaglutynacji - jest odmianą odczynu hemaglutynacji, w którym przed dodaniem do surowicy opłaszczonych antygenem erytrocytów, surowicę inkubujemy z badanym materiałem, w którym poszukujemy tego antygenu (jeśli znajduje się on w próbie badanej, to zwiąże on przeciwciała, i po dodaniu erytrocytów nie zajdzie reakcja hemaglutynacji - wynik dodatni)

odczyn antyglobulinowy Coombsa - służy do wykrywania przeciwciał niekompletnych, prowadzi się go w dwóch wariantach:

odczyn pośredni - pozwala wykryć obecność przeciwciał niekompletnych w surowicy (po opłaszczeniu erytrocytów wzorcowych badana surowicą, dodajemy przeciwciała antyglobulinowe, np. przy wykrywaniu obecności przeciwciał anty-D układu Rh w surowicy matki w przypadku podejrzenia konfliktu serologicznego)

Odczyn pośredni jest także wykorzystywany w teście Waalera-Rosego, do wykrywania obecności w surowicy czynnika reumatoidalnego RF (klasy IgM). W teście wykorzystuje sie erytrocyty barana opłaszczone przeciwciałami króliczymi skierowanymi przeciwko erytrocytom barana (do opłaszczania stosuje się surowicę króliczą o stężeniu czterokrotnie mniejszym niz stężenie wywołujące aglutynację tych krwinek). Następnie inkubuje sie je z kolejnymi rozcieńczeniami uprzednio zinaktywowanej surowicy badanej. Ponieważ w surowicach ludzkich znajdują się naturalne przeciwciala skierowane przeciwko białkom surowicy królika, aglutynacja może zajść nawet w przypadku nieobecności czynnika RF. Przyjęto, iż wynik dodatni to taki, w którym aglutynacja erytrocytów barana występuje przy rozcieńczeniu surowicy badanej 160x lub więcej.

Odczyn wiązania dopełniacza - kompleksy immunologiczne antygen-przeciwciało (IgG lub IgM) mają zdolność wiązania dopełniacza. Jeśli kompleks związany ejst z erytrocytem, powoduje to jego lizę (hemoliza immunologiczna) - początkowo mętna zawiesina krwinek staje się klarowna o intensywnie czerwonym kolorze. Metodę tę stosuje sie w diagnostyce wielu zakażeń bakteryjnych, grzybiczych i wirusowych. Przed wykonaiem odczynu należy przygotować:

opłaszczone przeciwciałami antyerytrocytarnymi erytrocyty barana (do opłaszczenia stosuje się 2 jednostki hemolityczne amboceptora),

Odczyn wykonuje się dwuetapowo:

dodanie układu wskaźnikowego - opłaszczonych erytrocytów barana (jeśli uprzednio dopełniacz został związany, to nie nastąpi hemoliza krwinek - wynik dodatni)

Aktywność hemolityczna dopełniacza (CH50) oznaczana jest przez ustalenie ilości surowicy wywołującej 50-procentową lizę opłaszczonych erytrocytów barana.

Odczyn antystreptolizyny O (ASO) - antystreptolizyna O jest przeciwciałem wytwarzanym w organizmie w odpowiedzi na zakażenie paciorkowcami beta-hemolizującymi grupy A; jest swoiście skierowana przeciwko streptolizynie O (SO). Zasada oznaczania poziomu ASO w surowicy oparta jest na hamowaniu przez antystreptolizynę zjawiska hemolizy erytrocytów zachodzacej pod wpływem SO:

do każdej probowki dodaje się zawiesinę erytrocytów królika i inkubuje (jeśli erytrocyty nie uległy hemolizie - wynik dodatni)

Wynik podaje się w jednostkach międzynarodowych jako miano surowicy (odwrotność największego rozcieńczenia surowicy, przy którym hemoliza jeszcze nie wystąpiła) - miano do 200 j.m. przyjmuje sie za prawidłowe; podwyższone świadczy o przebytych chorobach paciorkowcowych, choć u 5-10% ludzi zdrowych również stwierdza się podwyższone miano.

Poziom antystreptolizyny mozna też ocenić stosując odczyn lateksowy (do badanej surowicy dodaje się kroplę odczynnika lateksowego (zawiesina cząstek lateksu opłaszczonych oczyszczona streptolizyną O) -> wystąpienie aglutynacji świadczy o obecności ASO w mianie wyższym niż 200 j.m.

Metody immunologiczne z zastosowaniem znaczników - polegają na wyznakowaniu jednego ze składników reakcji antygen-przeciwciało; ze względu na użyty znacznik, wyróżniamy:

  1. metody homogenne - przeprowadzane w środowisku płynnym; badany materiał inkubowany jest z przeciwciałami znakowanymi fluorochromem i mierzy się stopień wygasania fluorescencji w porównaniu do wyjściowej w miarę łączenia się przeciwciał z poszukiwanym antygenem

  2. metody heterogenne - jeden ze składników związany jest z fazą stałą (np. powierzchnią probówki polistyrenowej); po reakcji odpłukuje sie supernatant i mierzy fluorescencję kompleksu związanego z fazą stałą; wyróżniamy:

metody pośrednie - antygen związany z fazą stałą inkubujemy z badaną surowicą (tworzą się kompleksy antygen-przeciwciało), po czym dodajemy wyznakowane fluorochromem przeciwciała homologiczne do tych poszukiwanych (im wyższe ich stężenie w badanym materiale, tym mniej przeciwciał wyznakowanych zwiąże się z antygenem)

  1. metodę kompetycyjną - przeciwciała inkubuje się z badanym antygenem w obecności homologicznego antygenu znakowanego izotopem, które wspólzawodniczą; ocenia się radioaktywność roztworu (wolny antygen) i kompleksu, oraz porównuje z krzywą kalibracyjną -> stosuje się do oznaczania stężenia hormonów i białek związanych z nowotworami

metoda bezpośrednia (Farra) - znakowany antygen inkubujemy z badanym materiałem, w którym poszukujemy przeciwciał; utworzony kompleks wytrąca się z roztowru np. siarczanem amonu i mierzy radioaktywność związana z osadem -> stosuje się do oznaczania poziomu przeciwciał anty-DNA

  1. metoda immunoradiometryczna (IRMA) - powierzchnię probówek pokrywa się nieznakowanymi przeciwciałami, dodaje badany materiał z poszukiwanym antygenem; po opłukaniu dodaje się przeciwciała znakowane i mierzy radioaktywność związaną ze ścianką probówki; dla IgE opracowano:

Techniki immunomorfologiczne - pozwalają wykryc obecność przeciwciała lub antygenu związanego bezposrednio z komórka lub tkanką. Biorąc pod uwagę przebieg reakcji, wyróżniamy metody bezpośrednie i pośrednie; biorąc za kryterium rodzaj użytego znacznika, wyrózniamy:

techniki immunoenzymatyczne (EIA) - stosowanymi chromagenami zazwyczaj są tetrachlorowodorek dwuaminobenzydyny (DAB, przekształca się w ciemnobrązowy nierozpuszczalny produkt) lub 3-amino-9-etylokarbazol (AEC, przekształca sie w nierozpuszczalny produkt barwy czerwonej). Do najczęściej stosowanych odmian pośrednich reakcji immunoenzymatycznych należą:

  1. reakcja peroksydaza-antyperoksydaza (PAP) - po wstepnej inkubacji materiału badanego ze swoistymi przeciwciałami, do kompleksu antygen-przeciwciało dołącza się kompleks PAP za pomocą mostka (nieznakowanych przeciwciał o powinowactwie zarówno do przeciwciała pierwotnego jak i kompleksu enzym-antyenzym); dodanie H2O2 i chromagenu i ocena spektrometryczna

reakcja fosfataza alkaliczna-antyfosfataza alkaliczna (APAAP) - zasada metody jak wyżej, lecz z zastosowaniem kompleksu APAAP; do substratu należy dodać lewamizol dla zahamowania aktywności fosfatazy endogennej

reakcja przy użyciu układu biotyna-awidyna - utworzenie kompleksu antygen-przeciwciało (pierwotne); reakcja kompleksu z przeciwciałem wtórnym biotynylowanym (skierowanym przeciwko immunoglobulinie); reakcja powstałego kompleksu z kompleksem awidyna-biotynylowana peroksydaza (ABC - Avidin-Biotynylated peroxidase Complex), mającej zdolność przyłączania się do biotyny przeciwciała wtórnego.

Odmianą tej reakcji jest LAB (Labelled Avidin-Biotin), gdzie z biotynylowanym przeciwcialem wtórnym wiąże się wyznakowana enzymem awidyna.

Test cytotoksyczny - zasada tego testu oparta jest na zjawisku niszczenia komórek docelowych w obecności swoistych przeciwciał i dopełniacza; reakcja przebiega w dwóch fazach: związanie przeciwciał z antygenami obecnymi na powierzchni komórek, oraz przyłączenie dopełniacza i uszkodzenie błony, co prowadzi do śmierci komórki.

Wynik reakcji oceniamy:

metodą izotopową - przed wykonaniem właściwego testu, komórki docelowe należy wyznakować izotopem chromu 51Cr; po reakcji z przeciwciałami komórki martwe uwalniają chrom do środowiska -> oceniamy radioaktywność supernatantu.

Najczęściej test cytotoksyczny wykonuje się w modyfikacji opracowanej przez Terasaki i McClellenda (test mikrolimfocytotoksyczny):

  1. ponizej 25% komórek martwych - wynik ujemny (nieobecny antygen)

26-45% komórek martwych - wynik watpliwy

>45% - wynik dodatni (antygen zgodności tkankowej obecny)

Metody izolacji komórek immunologicznie czynnych - najczęściej izoluje się limfocyty T, limfocyty B, monocyty, komórki NK, granulocyty; proces składa się z dwóch etapów:

  1. z płynów ustrojowych - krew obwodową pobiera się na heparynę, cytrynian sodu lub EDTA (wersenian sodu) i poddaje sedymentacji; uzyskany nadsącz zawiera leukocyty z niewielką domieszką erytrocytów;

z tkanek litych - rozdrabniamy tkanke mechanicznie by uwolnic komórki ze zrębu łącznotkankowego, po czym trawimy tkankę enzymami (kolagenazą, DNA-zą); zawiesinę komórek oddzielamy od tkanki przesiewając przez odpowiednie filtry.

  1. wirowanie na gradientach gęstości: najczęściej stosowanym gradientem jest mieszanina Ficoll-Uropolina (Ficoll → hydrofilny polimer cukrozy; Uropolina → rozpuszczalnik) wykorzystywany do izolacji limfocytów (a takze do 15% monocytów i 5% granulocytów) z płynów ustrojowych czy komórek nowotworowych od limfoidalnych (równiez rozdzielane w roztworze surowicy cielęcej); stosowany jest też gradient Percollu (koloidalna krzemionka pokryta poliwinylopyrolidonem, rozcieńczacna roztworem NaCl) mający zastosowanie do rozdziału limfocytów T od B, izolacji komórek NK oraz do izolacji monocytów i granulocytów; przez wirowanie w gradiencie Gradisolu G (wodny roztwór Uropoliny i Dekstranu) uzyskujemy interfazę górną (zawierającą oczyszczone limfocyty) i interfazę dolną (neutrofile);

metody adherencyjne: oparte na zdolności przylegania niektórych komórek do szkła lub plastiku; zawiesine komórek inkubuje się w kolumnach wypełnionych np. watą nylonową, bo czym wypłukuje się komórki nie zaadsorbowane; aby uzyskać komórki zaadsorbowane, przepłukujemy roztworem surowicy cielęcej (FCS);

eliminacja komórek na drodze szoku osmotycznego: ma na celu usunięcie z mieszaniny erytrocytów przez dodanie wody destylowanej lub chlorku amonu;

metody z zastosowaniem immunoadsorbentów: podczas inkubacji zawiesiny komórek z immunoadsorbentem następuje wiązanie się do opłaszczonych cząsteczek nośnika jedynie tych komórek, których antygeny reagują z danymi przeciwciałami; stosowana do izolacji poszczególnych subpopulacji limfocytów;

metoda izolacji magnetycznej: paramagnetyczne cząstki polistyrenu (Dynabeads) opłaszczane są przeciwciałami i inkubuje z zawiesina komórek; komórki związane "wyciąga się" za pomoca magnesu

metoda z wykorzystaniem zjawiska fagocytozy: dodając do zawiesiny komórek karbonylku zelaza, komórki fagocytujące możemy oddzielić za pomocą magnesu;

tworzenie rozet: oparta na spontanicznym zjawisku wiązania się erytrocytów barana z limfocytami T poprzez antygen CD2; utworzone rozetki wirujemy na gradiencie.

Ocena fenotypu: metody różnicowania poszczególnych subpopulacji limfocytów oparta jest na identyfikacji antygenów różnicowania CD (Cluster Differentiation), np. CD2, CD3 (limfocyty T), CD4 (limfocyty T pomocnicze), CD8 (limfocyty T supresorowo-cytotoksyczne), CD19 (limfocyty B). Fenotyp komórek oceniamy techniką immunofluorescencji stosując przeciwciała anty-CD.

Metody oceny czynnościowej komórek układu immunologicznego:

  1. metodą morfologiczną (barwiąc metodą Pappenheima; w preparacie nie stymulowanym indeks blastyczny nie powinien przekroczyć 7%);

metodą izotopową (opartą na pomiarze inkorporacji do kwasów nukleinowych radioaktywnie znakowanej tymidyny lub białek, np. leucyny).

  1. ocena adherencji fagocytów -> stosując kolumny wypełnione watą nylonową; po odpłukaniu komórek nie adherujących, dodaje sie barwnik MTT, który przekształcany jest przez komórki w pochodną - farmazan barwy niebieskiej;

badanie migracji fagocytów → prowadzone może byc w komorach Boydena (składajacych się z dwóch przedziałów oddzielonych filtrem; w górnej części kommory umieszcza sie zawiesinę badanych komórek, natomiast w dolnej części czynnik chemotaktyczny; błonę filtru wybarwia się i bada mikroskopowo) lub na płytce w żelu agarowym (wycina sie 3 studzienki: w środkowej umieszcza się zawiesinę komórek, a w studzienkach po obu jej stronach → płyn hodowlany i czynnik chemotaktyczny; po wybarwieniu metodą Pappenheima wyznaczamy indeks chemotaktyczny, czyli stosunek migracji w kierunku czynnika chemotaktycznego do migracji swobodnej w kierunku płynu hodowlanego);

badanie fagocytozy → do probówki dodaje sie zawiesinę badanych komórek i zawiesinę cząstek fagocytowanych w stosunku 1:6, a po odwirowaniu i wybarwieniem barwnikiem Giemza oblicza się indeks fagocytarny (stosunek liczby cząstek sfagocytowanych do komórek fagocytujących); można również znakować cząstki fagocytowane fluoresceiną lub pierwisatkiem promieniotwórczym i dokonać odczytu odpowiednio spektrofluorymetrycznego lub radioizotopowego;

ocena metabolizmu wewnątrzkomórkowego fagocytów → można albo dokonać oceny wybuchu tlenowego (spektrofluorymetrycznie oceniając redukcję cytochromu C przez produkowany podczas przemian bakteriobojczych anion ponadtlenkowy), albo wykonać test pochłaniania i redukcji NBT (błękitu nitrotetrazoliowego, który łatwo dostaje się do komórek podczas fagocytozy i ulega redukcji w fagolizosomach do nierozpuszczalnego farmazanu barwy ciemnogranatowej).

oznaczanie aktywności cytotoksycznej komórek: ogólna zasadą tych testów jest inkubacja komórek atakujących (efektorowych) z atakowanymi (docelowymi), a następnie ocena liczby uszkodzonych komórek:

  1. metodą morfologiczną - dodając błękit trypanu wychwytywany jedynie przez komórki martwe, i dokonując pomiaru spektrofotometrycznego;

metodą izotopową - przed inkubacją znakuje sie komórki docelowe izotopem chromu, a po reakcji ocenia się radioaktywność supernatantu

Szczegółowe warunki przeprowadzania testu zależy od rodzaju badanych komórek efektorowych, np.:

  1. komórki K - przeprowadza sie test ADCC (antibody dependent cellular cytotoxicity), w którym komórki docelowe (erytrocyty ludzkie/baranie lub komórki nowotworowe) muszą byc dodatkowo wstępnie opłaszczone przeciwciałami IgG3;

makrofagi, neutrofile - należy najpierw przeprowadzić inkubację komórek efektorowych z zawiesiną zabitych bakterii;

komórki NK - jako komórki testowe stosuje się komórki linii ludzkiej białaczki erytroleukemicznej K 562.

Cytofluorymetria przepływowa - słuzy do wieloparametrowej oceny komórek znajdujacych się w zawiesinie, które są kierowane do kanału w strumieniu cieczy formowanym siłami hydrodynamicznymi (warunki przepływu dobrane tak, by komorki przepływały pojedynczo). Wiązka światła (niebieskie lub ultrafioletowe) oswietla komórki i wzbudza fluorescencje, jeśli były one wyznakowane znacznikami fluorescencyjnymi. Detektory odbierają światło ugięte, rozproszone i fluorescencyjne. Każda komórka może mieć zmierzone takie parametry jak ugięcie światla na jej brzegach, rozproszenie swiatła na jej strukturach wewnątrzkomórkowych czy natężenie fluorescencji, którego źródłem moze być:

Cytometria przepływowa jest najszybszą metodą służącą do oceny immunofenotypu komórek (umożliwia jakościwą ocenę antygenową).

Cytometr mierzy takie wartości jak:

Ocena stanu układu immunologicznego pacjenta in vivo:

próby skórne - z zastosowaniem roztworów danych alergenów:

  1. metoda skaryfikacyjna - na naskórku umieszcza się kroplę alergenu i skaryfikuje igłą, ale tak by nie spowodować krwawienia (wynik dodatni gdy bąbel przekracza 2mm, a rumień 5mm);

metoda śródskórna - roztwór alergenu wstrzykujemy śródskórnie a wynik oceniamy po 15 min (reakcja natychmiastowa) i 24 godzinach (reakcja późna); metoda ta polecana jest przy testowaniu alergenów pokarmowych.

  1. próba nosowa - roztwór umieszcza sie na błonie sluzowej jamy nosowej i ocenia zmiany miejscowe (obrzęk, zblednięcie) i reakcje obronne (kichanie, swędzenie)

próba oskrzelowa - roztwór podaje się drogą wziewną i ocenia się maksymalną objętość wydechową sekundową (FEV1); próbę ocenia się jako dodatnią, gdy wziewanie alergenu powoduje spadek FEV1 o conajmniej 20%.

10



Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
prelekcja rosliny, Uczelnia SUM, immunologia
Leki stosowane w transplantologii, Uczelnia SUM, immunologia
prelekcja przeszczepy, Uczelnia SUM, immunologia
PROBLEMY TRANSPLANTACJI, Uczelnia SUM, immunologia
Immunomodulacja-rośliny, Uczelnia SUM, immunologia
prelekcja prowadzenie pacjenta po przeszczepie, Uczelnia SUM, immunologia
Niedobory odporności, Uczelnia SUM, immunologia
Wtórne niedobory odporności, Uczelnia SUM, immunologia
SYNAPSA IMMUNOLOGICZNA, Uczelnia SUM, immunologia
Zakażenia po przeszczepie narządów, Uczelnia SUM, immunologia
SIEĆ CYTOKIN, Uczelnia SUM, immunologia
prelekcja immunoregulacja, Uczelnia SUM, immunologia
Immunoregulacj1, Uczelnia SUM, immunologia
Nadwrażliwość, Uczelnia SUM, immunologia
Immunologia pas, Uczelnia SUM, biologia medyczna
Nowotwory, Uczelnia SUM, immunologia
Immunoregulacja, Uczelnia SUM, immunologia
Kleszcze, Uczelnia SUM, Higiena i epidemiologia
Toksoplazmoza, Uczelnia SUM, Higiena i epidemiologia

więcej podobnych podstron