SYNAPSA IMMUNOLOGICZNA
Synapsa (gr. synapsis = połączenie)- styk, złącze między komórkami, gdzie następuje przekazywanie sygnału z jednej komórki do drugiej
XIXw. - słowo użyte do opisu połączenia między dwoma chromosomami, a następnie zastosowane w opisie połączeń neuronów
Synapsa immunologiczna - termin zastosowany w opisie interakcji komórek T z komórkami APC
Norcross, M. A. A synaptic basis for T-lymphocyte activation. Ann. Immunol. (Paris)135D, 113-134 (1984).
Paul, W. E. et al. Regulation of B-lymphocyte activation, proliferation, and differentiation. Ann. NY Acad. Sci. 505, 82-89 (1987).
Wykrycie obecności SMACs (supramolecular activation clusters) w immunologicznej synapsie
Monks, C. R., Freiberg, B. A., Kupfer, H., Sciaky, N. & Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature 395, 82-86 (1998).
Synapsa immunologiczna (IS) to strefa styku błon komórek (np. limfocyty T i APC) w której przekazywane są informacje warunkujące wzajemną odpowiedź.
Obecna definicja IS bazuje na polaryzacji komórek, segregacji cząsteczek adhezyjnych i receptorów TCR limfocytów T w strefie styku między komórkami T i APC.
Dustin ML, Colman DR (2002) Neural and immunological synaptic relations. Science 298:785-789
Techniki stosowane w badaniach synapsy immunologicznej
Wide-field epi-illumination fluorescence microscopy
Confocal laser scanning microscopy (CLSM) - ok. 80μm
Spinning (Nipkow) disk confocal microscopy. CHARGE COUPLED DEVICE (CCD)
Two-photon and multi-photon laser scanning microscopy - ok. 450 μm, fala wzb. - 900nm
Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) FLUORSCENCE RESONANCE ENERGY TRANSFER (FRET) - wykorzystuje przeniesienie energii między parami fluorochromów.
Interference-reflection microscopy (IRM), TOTAL INTERNAL REFLECTION MICROSCOPY (TIRFM)
Modele doświadczalne
Komórki Jurkat T i Raji B plus superantygen
Hybrydy komórek T
Stabilne klony i linie kom. T
Pierwotne linie kom.T stymulowane in vitro
Obrazowanie in vivo
Lipidowe układy dwuwarstwowe (sztuczne błony) - techniki IRM i TIRM
Tworzenie synapsy
Wzajemny kontakt dwóch komórek i następnie przesunięcie centrosomu w kierunku synapsy
Transport wewnątrzkomórkowych pęcherzyków i powierzchniowych receptorów (TCR, kostymulatory) doprowadzącego lamellipodium
IS może trwać od kilku minut do kilkunastu godzin
Rodzaj i ilość przekazanych informacji zależy od stanu komórek i czynników środowiska
Czynniki decydujące o IS
Czas i dynamika interakcji
Rodzaj zaangażowanych receptorów cząsteczek sygnałowych
Siła przekazywanego sygnału
Obecność sekrecji
Limfocyt T i APC - fazy interakcji
FAZA I - inicjacja kontaktu
Po adhezji do APC limfocyt T ulega zaokrągleniu (zanik uropodium)
Boczna ruchliwość limf. T w stosunku do błony APC jest mniejsza niż 1 μm/min, co pozwala na redystrybucję receptorów
FAZA II - formowanie płaszczyzny interakcji
Polaryzacja w kierunku APC i powolny rozwój przebudowy cytoszkieletu w strefie kontaktu obu komórek
Boczna ruchliwość 1 do 2 μm/min
Wzajemne przemieszczanie się ułatwia wejście i wyjście receptorów z i do obszaru synapsy
FAZA III - odłączanie się limfocytu T i jego dalsza migracja
Zwiększenie aktywności ruchowej
Polaryzacja komórki i ruch postępowy 1 do 10 μm/min prowadzący do odczepienia się komórki
APC a typ synapsy
Stabilność i czas trwania interakcji jest odwrotnie skorelowana z morfologiczną złożonością i aktywnością cytoszkieletu APC
Limfocyt T a synapsa
Typ limfocytu (T CD4+, T CD8+)
Stan aktywacji (limfocyty T bardziej zaktywowane tworzą kontakty bardziej dynamiczne i krócej trwające)
Rola gęstości kompleksów MHC - peptyd
Gęstość powierzchniowa kompleksów MHC - peptyd agonistyczny jest wprost proporcjonalna do czasu trwania i intensywności indukowanego sygnału zależnego od kationów wapnia
Podwyższony poziom kationów wapnia wyzwala przejściowy sygnał stop, co powoduje silniejsze związanie
Znaczenie gęstości kompleksów MHC - peptyd
Około 1-400 specyficznych kompleksów MHC - peptyd na APC może całkowicie zaktywować co najmniej kilka limfocytów T
Można monitorować konsekwencję interakcji limf. T - APC, badając wzrost wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia i zachowanie się białek przyczepionych do GFP
Wykazano w ten sposób, że niektóre limf. T CD4+ mogą odpowiadać nawet na jeden ligand, słabo wpływając na ciągle zmiany stężenia wapnia
Limfocyt T może wytworzyć sygnał po reakcji z nawet tylko jednym ligandem, ale co najmniej 10 jest potrzebnych aby zwiększyć i podtrzymać poziom wapnia wewnątrz komórki.
Jeśli cząsteczki CD4 będą zablokowane, to do otrzymania odpowiedniego efektu potrzeba 25-30 kompleksów MHC - peptyd.
To wskazuje na fakt, iż CD4 są wymagane przy rozpoznawaniu antygenów o małej gęstości powierzchniowej.
Zależności indukowanego sygnału wapniowego od ilości kompleksów peptyd - MHC na APC, przy obecności/braku CD4
Wzrost poziomu wapnia jest kluczowy do aktywacji limfocytu T, ponieważ indukuje obecność w jądrze komórkowym czynnika transkrypcyjnego NF-AT odpowiedzialnego za wiele zmian
w ekspresji genów związanych z aktywowanymi limf. T
Być może połączenie jednego liganda, wraz z dostarczeniem kinazy LCK przez cząsteczki CD4 i CD8, wystarcza do inicjacji kaskady sygnału.
W reakcji z rozpuszczalnym kompleksem MHC - peptyd wymagane są dimery lub wielomery TCR do aktywacji limfocytu T.
W reakcji kompleksu MHC - peptyd z limfocytem Tc CD8+ wystarczają monomeryczne TCR, pod warunkiem współdziałania fibronektyny lub CD18/CD11.
Sugeruje się istnienie modelu pseudodimeru - CD4 wiąże krzyżowo 2 TCR, z których jeden wiąże kompleks: agonistyczny peptyd-MHC, a drugi wiąże się słabo z endogennym kompleksem peptyd - MHC, którego duże ilości ulegają wiązaniu z TCR i są rekrutowane do synapsy.
Rola siły agonistycznej peptydu
Swoistość łączenia limf. T z APC jest dodatnio skorelowana z powinowactwem lub awidnością TCR do kompleksu MHC-peptyd
faworyzacja stabilnej i wydłużonej interakcji, jeśli peptyd jest agonistą
Rola środowiska
Środowisko o wysokiej złożoności (np. narządy miąższowe, strefa grasiczozależna węzłów chłonnych) → dynamiczny kontakt limf. T i APC
Środowisko o niskiej złożoności (np. zatoka brzeżna węzłów chłonnych) → stabilna agregacja
RODZAJE SYNAPS
Podział synaps pod względem rodzaju molekularnej struktury płaszczyzn kontaktujących się
1.Synapsa stabilna (monocentryczna)
2.Synapsa wydzielnicza (efektorowa)
3.Synapsa częściowo posegregowana (multicentryczna)
4.Synapsa nieposegregowana
5.Synapsa dynamiczna
Synapsy immunologiczne różnią się:
Właściwościami fizycznymi
Czasami istnienia
Wykazują zmienność, różnorodność oraz niejednorodność rozwoju
SYNAPSA MONOCENTRYCZNA
Spolaryzowana interakcja limf. T i APC
Trwa 30' albo dłużej
Powstaje dzięki rekrutacji i segregacji receptorów powierzchniowych i białek adaptorowych
Powoduje ciągłą transmisję sygnałów wewnątrzkomórkowych
Fazy istnienia synapsy monocentrycznej
I.Skanowanie powierzchni, kontakt, areszt adhezyjny
II.Wczesne gromadzenie molekuł i przekazywanie sygnału
III.Dojrzewanie i segregacja receptorów
IV.Internalizacja TCR
V.Rozpad
Faza I
1.Limf. T rozpoznaje kompleks MHC-peptyd oraz intracellular adhesion molecule (ICAM-1)
2.Przejściowy areszt (sygnał stop)
3.CD4 zbliża się do łańcucha ξ CD3
Faza II
1.Rekrutacja CD3ξ, LCK, ZAP70 (ξ-chain associated protein kinase of 70kDa), kinaza 3-fosfatydyloinozytolu (PI3K)
2.Fosforylacja LCK, ZAP70
3.Uruchomienie sygnałów zależnych od wapnia
4.ZAP70 → Pi+LAT (linker for activation of T cells); LAT zawiera immunoreceptor tyrosine-based activation motifs (ITAMs), po ich fosforylacji mogą się do nich przyłączać Src homology 2 domains kinaz oraz białek adaptorowych
5.PI3K przyłącza się do LAT → wzrost stęż. trójfosforanu inozytolu → jego zgrupowanie → rekrutacja białek zawierających pleckstrin homology domain czyli WAVE i AKT = PKB
6.TCR, CD4, CD28 i inne - migracja do obszaru kontaktu (transport - cytoszkielet, mikrotubule)
7.Organizacja platformy sygnałowej TCR (PI3K, PLC, homologiczna do RAS rodzina GTP-az)
8.Małe GTP-azy RAC1 i RHO-A → wzrost dynamiki de- i polimeryzacji aktyny
9.Kostymulacja => aktywacja kofiliny → rozpad F-aktyny (warunek remodelingu sieci) → wspomożenie RAC1
Wpływ wielkości cząstek powierzchniowych na ich segregację
W aktywnym procesie cząsteczki powierzchniowe są transportowane z całego limfocytu T do synapsy.
Aby cząsteczki powierzchniowe mogły się przemieszczać potrzebne są sygnały z TCR i CD28/LFA-1
Następuje również przegrupowanie mikrodomen (LIPID RAFTS) (glikolipidy, cholesterol)
Mniejsze, stabilne połączenia receptorów z ligandami wykluczają ze swego sąsiedztwa większe białka błonowe
Większe molekuły chronią mniejsze białka błonowe przed kontaktem z adekwatnym receptorem
Sąsiadujące ligandy po połączeniu z receptorami spowodują pofałdowanie błony komórkowej (termodynamicznie niekorzystne)
Powiększenie rozmiaru CD48, łączącej się z CD2, hamuje aktywację limfocytu T.
Duże rozmiary pary ICAM-1 - LFA-1 powodują że mieści się ona w pSMAC,
a CD45 jest z podobnych przyczyn wyrzucana poza obwód pSMAC, daleko od centralnie położonej, dużo mniejszej pary peptyd-MHC - TCR. Później wraca do pSMAC.
Wpływ innych czynników na segregację cząsteczek powierzchniowych
Agryna - (glikoproteina, normalnie występuje w złączu nerwowo - mięśniowym, gdzie pomaga w kontroli rec. Ach) indukuje polaryzację TCR, CD28 i mikrodomen w spoczynkowych limfocytach T
MGAT5 - enzym szlaku N-glikozylacji - w skrócie: powoduje podwyższenie progu aktywacji limf. T
Faza III
Okres trwania 5 - 30 minut interakcji
Dochodzi do molekularnej segregacji
cSMAC (central supramolecular activation cluster) - TCR, CD3, PKC, CD28, CD2, CTLA4, (CD4, CD45)
pSMAC (peripheral) - LFA1 (lymphocyte function -associated antigen 1)
dSMAC (distal) - CD45
•IFN-γR, IL-4R => pomoc w kostymulacji
Warstwy SMAC
cSMAC - część środkowa SMAC (TCR, efektory przekazujące sygnał w dół - kinaza proteinowa C-Θ → PKC-Θ)
pSMAC - cześć peryferyjna SMAC (cząsteczki adhezyjne, np. LFA1)
dSMAC - obszar poza pSMAC (tu duże cząsteczki, takie jak CD43, CD45)
Po kontakcie z APC TCR-CD3 i CD4 znajdują się w centrum synapsy, ale później tylko TCR-CD3 dalej tam pozostaje, natomiast CD4 przemieszcza się na obwód.
Rekrutacja ZAP70 do TCR-CD3 jest procesem dynamicznym (szybkie łączenie się
i rozłączanie)
LCK najpierw lokalizuje się w cSMAC, potem przechodzi do pSMAC
Faza IV
Internalizacja TCR stanowi ujemne sprzężenie zwrotne regulujące pobudzenie i prowadzi do rozpadu synapsy
Faza V
Na początku pewne fragmenty błon pozostają ogniskowo w kontakcie
Możliwe dalsze reakcje:
Hamowanie ekspresji TCR i cząsteczek adhezyjnych
Stymulacja ekspresji inhibitorów przesyłania sygnału (np. CTLA4)
Indukcja ekspresji chemokin i ich receptorów → wzrost ruchliwości
Redystrybucja współzawodniczących cząsteczek adhezyjnych (np. CD43) do strefy kontaktu
SYNAPSA WYDZIELNICZA
Wariant synapsy stabilnej tworzony przez Tc, Th, NK i komórkę docelową, która ma zostać uszkodzona bądź wystawiona na wpływ cytokin (np. aktywacja limf. B przez limf. Th)
Przekazuje stały sygnał
Podobne fazy jak w synapsie stabilnej
Do cSMAC przylega domena wydzielnicza, która zawiera centrosom (MTOC), spolimeryzowaną tubulinę i nowo zrekrutowane granule; ten region odpowiada za ogniskową egzocytozę zawartości pęcherzyków
Zewnętrzny pierścień adhezji stabilizuje połączenie i redukuje wyciek uwalnianych czynników, co pozwala na zogniskowanie wydzielania
Zawartość granul komórek Tc i Th
Tc: granzymy, perforyna, proteoglikany, białka lizosomalne
Th: IL-2, IL-4, IL-5, IFN-γ
LIMFOCYTY Th
Kontakt limf. Th z APC trwa zwykle ponad 10 godzin
TCR przekazuje sygnał do produkcji wtórnych przekaźników: Ca2+ i kinazy fosfatydyloinozytolu (PI3K)
Dochodzi do zmian w transkrypcji genów po kilku godzinach od kontaktu z APC
Następuje sekrecja IL-2 i innych cytokin
Proliferacja limfocytu T zachodzi po 24-48 godzinach od kontaktu z APC, trwa kilka dni; dochodzi do 3-4 kolejnych podziałów komórkowych
Kiedy komórka jest już aktywowana szybko z powierzchni wyrzucane są kompleksy TCR - CD3, są jednocześnie zastępowane nowo produkowanymi receptorami;
CTLA4 rywalizuje z CD28 o wiązanie się z CD80/CD86 i po ich związaniu hamuje przekaz sygnału z TCR przez rekrutację wewnątrzkomórkowej fosfatazy SHP2, która defosforyluje zaktywowane CD3
LIMFOCYTY Tc
W obrębie cSMAC występuje wyspecjalizowany region, który przekazuje cytolityczne ziarnistości. Region ten pozbawiony jest TCR.
Rozłączenie komórek może nastąpić szybko po fazie inicjacji.
Limf. Tc wymaga tylko kilku kompleksów peptyd - MHC, aby zabić komórkę.
Jeden limf. Tc może tworzyć synapsy z kilkoma komórkami
SYNAPSA MULTICENTRYCZNA
Sortowanie molekuł zatrzymuje się, zanim uformowały się cSMAC i pSMAC
Zgrupowywanie się TCR i CD3 zostaje przerwane → powstają niejednolite agregaty do 1 μm wielkości
Są dowody, że odgrywa rolę w sygnalizacji z udziałem TCR między limf. T i komórkami dendrytycznymi
Kiedy powstaje synapsa multicentryczna?
APC o wysokiej aktywności cytoszkieletu
Tworzą ją tymocyty podczas negatywnej selekcji
SYNAPSA NIEPOSEGREGOWANA
TCR i białka sygnałowe są rozproszone w obrębie obszaru interakcji
Przekazuje całą gamę sygnałów
Wyróżnia się 4 typy synaps :
a)Synapsa niespecyficzna
b)Synapsa wczesna przejściowa
c)Rozlany kontakt cytolityczny (dyfuzyjna)
d)Synapsa między dziewiczym limf. T i DC
(a) Synapsa niespecyficzna
In vitro: gdy limf. T łączy się z APC bez rozpoznawanego antygenu
Występuje małe zagęszczenie CD3, słaba fosforylacja w szlakach sygnałowych, niewielka ilość uwolnionego wapnia
In vivo: dynamiczny kontakt bez związania adhezyjnego
Niska liczebność peptydów endogennych lub słabe powinowactwo TCR do nich
(b) Synapsa wczesna przejściowa
Trwa minuty, generuje silny sygnał mimo nieuporządkowania
(c) Rozlany kontakt cytolityczny (dyfuzyjna)
Przy małej ilości antygenu nie dochodzi do wytworzenia synapsy sekrecyjnej między Tc i komórką docelową
Mimo nieuporządkowania następuje egzocytoza i zabicie komórki docelowej
(d) IS między dziewiczym limf. T i DC
Kiedy nieaktywowany lub aktywowany limf. T jest stabilnie w interakcji z DC, często nie dochodzi do segregacji i limf.T pozostanie w fazie adhezyjnej, słabo ruchliwej o typie wczesnym
SYNAPSA DYNAMICZNA
Powstaje, gdy nie dochodzi do zahamowania migracji limf. T
Limf. T migrujący wzdłuż powierzchni APC może uskutecznić sygnalizację
Obserwacje in vitro i in vivo np. limfocytoblasty migrujące po powierzchni aktywowanych fibroblastów
INTEGRACJA PRZEKAZYWANEJ INFORMACJI
koncepcje integracji informacji w limf. T:
Model pojedynczego zetknięcia się
Model wielokrotnego zetknięcia się
Model kinetycznego przechodzenia
Model pojedynczego zetknięcia się
Jeden długotrwały i stabilny kontakt wystarczy do pobudzenia
Zdarza się to rzadko, ponieważ wystarczająco długo trwająca stabilizacja jest niełatwa do osiągnięcia
Model wielokrotnego zetknięcia się
Dynamiczne interakcje trwają zbyt krótko, by wzbudzić dostateczną aktywację
Limf. T musi wymieniać informacje z wieloma APC
Następuje kumulacja poszczególnych sygnałów → aktywacja
Model kinetycznego przechodzenia
Strefa grasiczozależna węzła chłonnego myszy
Faza I: wiele dynamicznych kontaktów limfocyta T i wielu DC → wczesna aktywacja
Faza II: stabilny, długi lub powolnie dynamiczny kontakt z DC → transformacja blastyczna
Faza III: limfocytoblast znów wymienia informacje z licznymi DC
Faza IV (tylko CD4): kontaktowanie się blastów w sieci DC
Podczas tych faz dziewiczy limfocyt T zbiera informacje o różnym charakterze
Rodzaj synapsy a los komórek
Pozytywna selekcja w grasicy - czas trwania przekazywania sygnału wpływa na równowagę między liczbą limf. CD4 i CD8
utrzymanie puli rezerwowej i różnorodności repertuarowej - seria podprogowych sygnałów przekazywanych podczas powstawania synaps niespecyficznych - wędrówka dziewiczych limf. T i spotykanie różnych DC
Wstępna aktywacja limf. T - dziewicze CD4 i CD8 wchodzą w interakcje dynamicznie wiele razy z DC → transformacja blastyczna, ale nie do rozwoju wszystkich funkcji efektorowych
Polaryzacja limf. T w kierunku Th - wymagany jest długotrwały, stabilny kontakt z APC, na zróżnicowanie Th wpływa rekrutacja pewnych receptorów i cząsteczek adhezyjnych (IFN-γR → Th1)
Indukcja tolerancji - niedojrzałe DC → krótkie i dynamiczne kontakty z limf. T CD8 → krótkotrwała, klonalna ekspansja
Funkcja wydzielnicza limf. Th i Tc - wysokie stężenia substancji wydzielonych i uszczelnienie szczeliny synaptycznej przez zewnętrzny pierścień adhezyjny - pomoc dla limf. B (Th), zabicie komórki docelowej (Tc)
Wychwytywanie rzadkich limf. T - stabilizacja kontaktu, by raz nawiązany nie został utracony
Odpowiedź indukuje immunodominujący antygen, gdy podane różne - „walka o antygen” - poprzez regulację stabilności kontaktu synaptycznego
Zmiana pozycji koniugatów komórkowych - np. połączone ze sobą limf. B i T migrują z dużą prędkością w węźle chłonnym
6