Temat: właściwości aminokwasów i białek Celem tego ćwiczenia jest poznanie niektórych reakcji charakterystycznych stosowanych w wykrywaniu aminokwasów i białek. Umożliwiają one: * odróżnienie aminokwasów od innych związków organicznych * odróżnienie białek od wolnych aminokwasów * wykrywanie aminokwasu zawierającego grupę hydrosuflidową (- SH) * wykrywanie aminokwasów aromatycznych * poznanie właściwości białek np. wytrącanie się ich z roztworu pod wpływem różnych czynników (denaturalizacja) I. Reakcja ninhydrynowa: Za pomocą tej reakcji możliwe jest odróżnienie wolnych aminokwasów od innych związków organicznych. W obecności wolnego aminokwasu i ninhydryny po podgrzaniu powstaje niebieskofioletowy produkt kondensacji. W reakcji bierze udział grupa 2-karboksylowa i 2-aminowa. Wnioski: W reakcji z ninhydryną roztwór z wolnym aminokwasem powstaje produkt o barwie ciemnego fioletu. Wolny aminokwas znajduje się w probówce pierwszej. W drugiej probówce znajduje się inny związek organiczny (białko), ponieważ wytrąca się osad. II Reakcja biuretowa Piotrowskiego Reakcja ta pozwala wykryć obecność wiązania peptydowego w białku lub peptydzie zawierającym przynajmniej dwa takie wiązania. Wnioski: W probówce drugiej znajdują się białka bądź peptydy ponieważ jon miedziowy tworzy, w środowisku zasadowym, z wiązaniami peptydowymi kompleks o zabarwieniu fioletowym. W probówce pierwszej również możemy zaobserwować zmianę barwy, jednak jest ona skutkiem występowania miedzi w roztworze - jest to barwa odczynnika. III Reakcja ksantoproteinowa Dzięki tej reakcji możemy wykryć obecność aminokwasów zawierających grupę aromatyczną zarówno wolnych jak i wchodzących w skład białek i peptydów. Ob: W probówce z rozcieńczonym roztworem białka kurzego możemy zaobserwować jak powstaje barwny (pomarańczowy) produkt reakcji. W probówce z glicyny nie widać żądnej zmiany, roztwór pozostaje bezbarwny. Wnioski: W probówce drugiej (rozcieńczony roztwór białka kurzego) znajdują się aminokwasy posiadające grupę aromatyczną, ponieważ powstają, pod wpływem kwasu azotowego, nitrowe pochodne pierścieni aromatycznych, mające zabarwienie pomarańczowe w środowisku zasadowym. IV Reakcja mająca na celu wykrycie grupę hydrosuflidową (- SH) W probówce z rozcieńczonym roztworem białka kurzego możemy zaobserwować wytrącenie się ciemnoszarego osadu. Natomiast w probówce z glicyną nie widać żadnych zmian. Wnioski: Aminokwasy zawierające grupę -SH reagują w podwyższonej temperaturze z wodorotlenkiem sodu dając sole ołowiane w tym nierozpuszczalny siarczek ołowiany mający postać ciemnoszarego osadu. Takie aminokwasy znajdują się w probówce z rozcieńczonym roztworem białka kurzego. Denaturalizacja (reakcje V, VI, VII) Denaturalizacja - określenie nieodwracalnych zmian w strukturze i utraty biologicznych właściwości białka, na skutek działania różnych czynników.
V Koagulacja cieplna białka Próbka białka, zostaje poddana działaniu wysokiej temperatury. Roztwór pod wpływem wysokiej temperatury mętnieje oraz wytrącają się drobinki białego osadu. VI Wytrącanie białka kwasem Roztwór pod wpływem zmiany stężenia jonów wodorowych mętnieje oraz wytrącają się drobinki białego osadu. VII Wytrącanie białka solami metali ciężkich Roztwór pod wpływem wysokiego stężenia soli metalu ciężkiego mętnieje oraz wytrącają się drobinki białego osadu. Wnioski (V, VI, VII): W skutek wysokiej temperatury, zmiany stężenia jonów wodorowych lub wysokiego stężenia soli metalu ciężkiego, wtórna struktura (słabe wiązania wodorowe oraz oddziaływania hydrofobowe) białka ulega zniszczeniu, natomiast struktura pierwotna (mocne wiązania peptydowe) pozostaje bez zmian. Białko traci swoje biologiczne właściwości.
Temat: Fotometryczne oznaczanie białka
Celem ćwiczenia jest poznanie zasad, na których oparte są ważniejsza metody oznaczania białka związanych z cechami jego budowy, oraz zapoznanie się z fotometryczną analizą ilościową (metoda Lowry'ego) często wykorzystywaną w badaniach biochemicznych. Metoda: W metodach fotometrycznych wykorzystuje się zjawisko pochłaniania promieniowania elektromagnetycznego przez różne substancje. Pomiar absorpcji światła przy określonej długości fali może być miarą ilości substancji absorbującej i jest podstawą fotometrycznej analizy ilościowej. Do oznaczeń wykorzystuje się widmo określonych związków lub barwnych produktów reakcji chemicznych, które można mierzyć metodami spektrofotometrycznymi i kolorystycznymi. Zdolność pochłaniani promieniowania elektromagnetycznego określonej częstotliwości zależy od budowy, struktury tej substancji, zwłaszcza od występowania i rozmieszczenia wiązań nienasyconych. Fotometryczną analizę ilościową przeprowadzono metodą Lowry'ego i współpracowników. Wykorzystuje ona następujące cechy białek: *obecność wiązań peptydowych *obecność aminokwasów aromatycznych (tryptofan, tyrozyna) *obecność aminokwasu siarkowego - cysteiny Obserwacje: Po dodaniu odczynnika miedzowego nie zaobserwowano żadnej zmiany barwy. Po dodaniu następnego odczynnika (odczynnika Folina) można dostrzec jak roztwór zmienia barwę z bezbarwnej na odcienie fioletu w końcowym etapie. W zależności od stężenia białka barwa jest intensywniejsza (przy większym), bądź mało intensywna (przy mniejszym). Wnioski: Reakcja biuretowa (tworzenie kompleksów poprze wiązania peptydowe reagujące z jonami odczynnika miedziowego) jest wzmocniona w metodzie Lowry'ego, reakcją odczynnika Folina i Ciocalteu, w której kwas fosforomolibdenowy i fosforowolframowy ulega redukcji do błękitu fosforomolibdenowego z udziałem tyrozyny , tryptofanu i cysteiny. Umożliwiło to zmierzenie stężenie barwnego kompleksu za pomocą fotometru w widmie widzialnym o długości 670 nm. Stężenie białka odczytano z krzywej wzorcowej, opracowanej na podstawie wyników widma dla białka wzorcowego o kolejnych stężeniach.
Czynniki warunkujące aktywność enzymów
Celem ćwiczenia jest poznanie wpływu takich podstawowych czynników jak temperatura, stężenie jonów wodorowych oraz stężenie enzymu na aktywność enzymów. Wnioski: W zależności od temperatury, stężenia enzymu czy też pH roztworu, absorpcja fali jest większa bądź mniejsza. Największą wartość osiąga w optymalnych warunkach, to jest w temperaturze 38˚C i w środowisku o pH = 5,2. Zwiększone stężenie roztworu nie powoduje spadku absorpcji, jak to jest w przypadku poprzednich czynników.
Temat: Wyznaczenie stałej Michaelita-Menten i oznaczanie aktywności enzymów
Celem ćwiczenia jest poznanie kinetyki enzymów (stałej Km i wpływu stężenia enzymu na szybkość reakcji) na przykładzie dwóch enzymów z różnych klas - hydrolazy i oksydoreduktazy. Metoda: Aktywność fosfataz oznacza się zazwyczaj używając sztucznych substratów takich jak: 2-glicerofosforan, fenylofosforan, fosforan fenoloftaleiny, 4-nitrofenylofosforan. Aktywność enzymu mierzy się ilością uwolnionego fosforanu lub części organicznej estru po inkubacji enzymu z substratem w ściśle określonych warunkach. Szczególnie dogodny jako substrat jest 4-nitrofenylofosforan, ponieważ jeden z produktów reakcji przechodzi w formę barwną już po zalkalizowaniu środowiska. Obserwacje: Po dodaniu do 4-nitrofenylofosforanu buforu o pH=5,3 oraz wody i pierwszej inkubacji nie zaobserwowano żadnej zmiany barwy. Po dodaniu enzymu drugiej inkubacji i dodaniu następnego odczynnika (roztwór NaCO3) można dostrzec jak roztwór zmienia barwę z bezbarwnej na odcień zieleni. W zależności od stężenia substratu barwa jest intensywniejsza (przy większym), bądź mało intensywna (przy mniejszym). Wnioski : Wartości stałej Km wahają się w granicach od 10-1 do 10-8 i zależą od rodzaju enzymu, substratu, temperatury, pH. W określonych warunkach stała Km jest wskaźnikiem powinowactwa enzymu do substratu. Wartość 2,16*10-4 jest wartością stosunkowo niską zatem wskazuje na duże powinowactwo i dużą szybkość procesu katalitycznego.
Oznaczanie zawartości kwasu askorbinowego w materiale roślinnym
Ćwiczenie poświęcone jest zapoznaniu się z jedną z metod oznaczania zawartości kwasu askorbinowego w materiale biologicznym, opartą na reakcji jego utleniania
2,6-dichlorofenoloindofenolem. Metoda miareczkowania: Oznaczanie kwasu askorbinowego polega na jego utlenianiu za pomocą mianowanego roztworu barwnika 2,6- dichlorofenoloindofenolu. Jest to metoda oksydymetryczna , ponieważ stosuje się mianowany roztwór utleniacza. Zawartość kwasu askorbinowego oblicza się z ilości zużytego mianowanego roztworu barwnika. Używany niebieski barwnik w środowisku kwaśnym w formie utlenionej ma barwę różową, a redukowanej jest bezbarwny. Trwała różowa barwa podczas miareczkowania powstaje po całkowitym utlenieniu kwasu askorbinowego w momencie dodania pierwszej kropli nadmiaru barwnika. Oznaczanie kwasu askorbinowego: Z rozcieńczonego w kolbie miarowej na 50 ml wyciągu z kapusty (15 ml), po uprzednim uzupełnieniu do 2% kwasem szczawiowym (35 ml) i wymieszaniu, pobrano dokładnie pipetą próbki po 10 ml, przeniesiono do kolby stożkowej i szybko miareczkowano 2-6 dichlorofenoloindofenolem, aż do uzyskania jasnoróżowego zabarwienia utrzymującego się w ciągu 30 sekund. Miareczkowanie wykonano 3-krotnie aż do uzyskania zbliżonych wyników. Następnie wykonano identyczne miareczkowanie 10 ml próbek soku z cytryny (15 ml) rozcieńczonego i wymieszanego w kolbie miarowej na 50 ml z 2% kwasem szczawiowym
Temat: Reakcje charakterystyczne sacharydów
Przypomnienie wiadomości z chemii o budowie i właściwościach sacharydów. Stosowane w doświadczeniach sacharydy oraz reakcje są dobrane tak aby na podstawie ich wyników możliwe było zakwalifikowanie nieznanego sacharydu do określonej grupy strukturalnej.
Metoda i charakterystyczne reakcje: Właściwością często wykorzystywaną w oznaczeniach jest ich zdolność do redukowania innych związków. Właściwość ta związana jest z występowaniem cząsteczki sacharydów w formie łańcuchowej zawierającej reaktywną grupę aldehydową lub ketonową. Wszystkie monosacharydy mają właściwości redukujące. Reakcje Benedicta - zachodzi w środowisku kwaśnym, następuje utlenienie sacharydów redukujących do odpowiednich hydroksykwasów, a w obecności odczynnika Benedicta jony Cu2+ redukują się do jonów Cu+ wypadających z roztworu w postaci nierozpuszczalnego Cu2O Reakcja Barfoeda - zachodzi w środowisku słabo kwaśnym, tylko reakcji z monosacharydem produktem będzie czerwony osad tlenku miedziowego; w wyższych stężeniach jonów wodorowych oraz wysokiej temperaturze disacharydy ulegają hydrolizie, właściwości redukujące wynikają z obecności w nim produktów hydrolizy - monosacharydów. Reakcja Molischa - wszystkie sacharydy po odwodnieniu kwasem siarkowym dają z α-naftolem fioletowo zabarwiony produkt kondensacji. Reakcja Biala - tylko pentozy przekształcają się w furfural kondensujący z orcynolem, w wyniku czego powstaje produkt o barwie zielonej. Odczynnik Seliwanowa zawiera rezocynol, który z produktem odwadniania ketoz daje barwę łososiową.
Oznaczenie zawartości sacharydów w materiale biologicznym
Ćwiczenie poświęcone jest poznaniu jednego ze sposobów ilościowego oznaczania poziomu sacharydów w materiale biologicznym. Zasada metody: W zastosowanej w ćwiczeniu metodzie wykorzystane są właściwości redukcyjne sacharydów, które w środowisku zasadowym redukują grupy nitrowe kwasu 3,5 - dinitrosalicylowego do grup aminowych, a same utleniają się do odpowiednich kwasów onowych. Powstaje aminowe pochodzenie kwasu 3,5 - dinitrosalicylowego mają barwę pomarańczową. Intensywność zabarwienia zależy od ilości sacharydów redukcyjnych w próbie, dlatego też może stanowić podstawę do ich kolorymetrycznego oznaczenia.
Temat: Badanie składników kwasów nukleinowych
Ćwiczenia ma na celu poznanie niektórych reakcji barwnych charakterystycznych dla kwasów dezoksyrybonukleinowych, w których składzie obecne są pentoza - deoksyryboza, oraz tymina, jak również na wykonanie reakcji na obecność otrofosforanów. Zasada metody 1. Hydrolizę chemiczną wykonuje się najczęściej traktując frakcję kwasów nukleinowych zasadami lub kwasami, np. 0,3-molowym NaOH w temp. 37oC, 6-molowym HCl w temp. 100oC lub 12-molowym HCl4 w temp. 100oC. Oba kwasy nukleinowe zachowują się różnie pod wpływem tych związków. Reakcja na wykrywanie tyminy: Odróżniono oba typy kwasów polega na wytworzeniu przez tę zasadę z diazową pochodną kwasu sulfanilowego kompleksu o barwie czerwonobrunatnej. Reakcja na obecność fosforanów: Polega na łączeniu się molibdenianu amonowego z jonem fosforanowym, tworzącym wówczas kompleksu o barwie żółtej. 2. Składniki kwasów nukleinowych można też badać za pomocą reakcji barwnych w preparatach nie hydrolizujących. Nie hydrolizujące kwasy nukleinowe wykazują wspólną reakcję na obecność pentozy (reakcja Biala). Natomiast reakcją odróżniającą RNA od DNA w formie nie hydrolizującej jest reakcja Dishego na obecność deoksyrybozy. Podsumowanie: Kwasy nukleinowe można rozpoznać za pomocą różnych reakcji barwnych. Reakcja na obecność otrofosforanu umożliwiła udowodnienie, że w probówce znajduje się kwas nukleinowy, ponieważ reakcja z DNA lub RNA tworzy wraz z roztworem molibdenianu amonowego kompleks barwy żółtej. Reakcja na obecność tyminy wytwarza czerwony kompleks w probówce zawierającą roztwór z tą zasadę. Reakcja ta umożliwia określenie konkretnego kwasu nukleinowego znajdującego się w probówce - DNA. Za pomocą reakcji Biala wykryto pentozę znajdującą się w roztworze, a dzięki reakcji Dishego określono, konkretną pentozę znajdującą się w próbce - deoksyrybozę, na podstawie której scharakteryzowano kwas nukleinowy jako DNA.