Ćwiczenie 9 (MOiŚ)

T: Metody oznaczania ogólnej liczby drobnoustrojów

1) Oznaczanie ogólnej liczby drobnoustrojów w 1 ml próby badanej (NPL)

a) metoda probówkowa
b) metoda płytek agarowych

2) Oznaczanie liczby bakterii w 100 ml próby badanej
3) Metoda filtrów membranowych

1) Oznaczanie ogólnej liczby drobnoustrojów w 1 ml (NPL)

a) metoda probówkowa



wykonujemy 6 rozcieńczeń badanej próby w postępie dziesiętnym; rozcieńczenia

wykonujemy w 0,85% NaCl



każdemu rozcieńczeniu próby przyporządkowujemy 5 probówek wypełnionych 10 ml

bulionu zwykłego. Do każdej z tych 5 probówek wlewamy po 1 ml próby z odpowiedniego
rozcieńczenia.



inkubujemy 24 h



zliczamy probówki z poszczególnych rozcieńczeń w których obserwujemy wzrost bakterii

(wynik dla każdego z rozcieńczeń będzie od zera do pięciu)



zapisujemy wyniki i układamy tzw. liczbę charakterystyczną; liczba charakterystyczna

składa się z 3 cyfr;
Pierwsza cyfra przyporządkowana jest ostatniemu rozcieńczeniu, które daje wzrost we
wszystkich próbach (lub w maksymalnej ilości), a kolejne cyfry liczby charakterystycznej
oznaczają liczbę prób dodatnich z kolejnych rozcieńczeń
Przykład

10

-1

10

-2

10

-3

10

-4

10

-5

10

-6

5

5

5

2

0

0

Odczytana liczba charakterystyczna to 520



Porównujemy wynik z tablicami Makrediego:
Dla 520 wynik z tablic to 5



Mnożymy liczbę odczytaną z tablic razy odwrotność rozcieńczenia odpowiadającego

pierwszej cyfrze liczby charakterystycznej (

5

20) czyli 10

-3



NPL= 5 x odwrotność rozcieńczenia

NPL= 5x10

3

= 5 x 1000

NPL = 5000 komórek bakteryjnych

Otrzymana liczba to liczba bakterii w 1 ml badanej próby. Oczywiście nie jest to pomiar co
do jednej komórki bakteryjnej tylko przybliżony odczyt lub nawet rząd wielkości.

[[[[[[]]]]]]]]
!!! Wyjątki w tworzeniu liczby charakterystycznej:



jeżeli wszędzie są piątki to bierzemy 3 ostatnie cyfry, odczytujemy z tablic McCrady’ego ale stawiamy znak

większości, a nie równości



10

-1

10

-2

10

-3

10

-4

10

-5

10

-6

5

5

5

5

5

5

--> 555

NPL > odczyt z tablic x 10

-4



jeżeli żadne z rozcieńczeń nie dają 5 wyników pozytywnych to pod uwagę bierzemy rozcieńczenie z najwyższą

liczbą prób dodatnich i dwa kolejne rozcieńczenia

2

0

0

0

0

0

--> 200

NPL > odczyt z tablic x 10

-1



jeżeli ostatnia cyfra liczby charakterystycznej to 1, a za nią w kolejnym rozcieńczeniu jest również 1 to

sumujemy obie jedynki i wpiusujemy 2 w miejsce ostatniej cyfry liczby charakterystycznej

5

5

3

1

1

0

liczba charakterystyczna to 532

[[[[[[[[]]]]]]]]

b) metoda płytek agarowych (metoda płytek lanych)



wykonujemy rozcieńczenia dziesiętne badanej próby



każdemu rozcieńczeniu przyporządkowujemy 2 płytki Petriego



na każdą płytkę wylewamy po 1 ml każdego rozcieńczenia i zalewamy 10 ml upłynnionego

agaru o temperaturze max. 42°C



inkubujemy 24 h



zliczamy liczbę kolonii (kolonie na powierzchni i kolonie wgłębne) w każdej parze płytek

agarowych



do obliczenia wyniku bierzemy pod uwagę płytki zawierające 10-300 kolonii; z każdej pary

płytek spełniających wymaganie wyciągamy średnią liczbę kolonii

Przykład:

10

-1

10

-2

10

-3

10

-4

10

-5

10

-6

>300 >300 70

9

0

1

>300 270

50

13

2

1

wynik to 60



mnożymy wynik przez odwrotność rozcieńczenia i otrzymujemy NPL jednostek

tworzących kolonie (CFU) w 1 ml



jeżeli będą 2 rozcieńczenia spełniające wymagania to oba bierzemy pod uwagę wyciągając

średnią

2) Oznaczanie liczby bakterii w 100 ml próby badanej

a) metoda posiewów trójkowych



wlewamy po10 ml badanej próby do trzech kolbek zawierających po 100 ml podłoża



wlewamy po 1 ml badanej próby do trzech probówek zawierających po 10 ml podłoża



wlewamy po 0,1 ml badanej próby do trzech probówek zawierających po 10 ml podłoża

Łącznie 9 kolbek/probówek



inkubujemy 24h w optymalnej temperaturze



Zliczamy liczbę prób dodatnich w każdym rozcieńczeniu, np:

3 x 10:100

3 x 1:10

3 x 0,1:10

1/3

0/3

1/3

Tworzymy trzycyfrową liczbę: „101”

Odczytujemy z odpowiednich tablic wartość odpowiadającą ustalonym próbom. Wartość
odczytana z tablic to NPL bakterii w 100 ml wody (wskaźnik wody).

[[[[[[]]]]]]

Inny system posiewu trójkowego:

3 x 100ml próby do 100 ml pożywki
3 x 10ml próby do 100 ml pożywki
3 x 1 ml próby do 10 ml pożywki
W tym wypadku wynik odczytany z tablicy dzielimy przez 10 ponieważ podaliśmy 10x
więcej próby.
[[[[[[]]]]]]

3) Metoda filtrów membranowych



przefiltrować daną objętość próby przez krążek o odpowiedniej średnicy porów

Można przefiltrować 1ml, 10ml, 50ml, 100ml i inne objętości próby ale zawsze musimy
przefiltrować co najmniej 25 ml płynu przez sączek. Jeżeli chcemy przefiltrować tylko 1ml
próby (bo jest ona bardzo zagęszczona itd.) To dodajemy do tej próby 24 ml 0,85% NaCl i
dopiero wtedy filtrujemy.



krążek umieścić na pożywce



inkubacja 24h w optymalnej temperaturze



zliczamy kolonie, które rosną na filtrze; bierzemy pod uwagę tylko liczbę kolonii

mieszczącą się w szeregu optymalnym tzn. 6-96 kolonii.

Wskaźnik = liczba kolonii x 100 / ilość przefiltrowanej wody w ml

Wskaźnik: liczba kolonii w 100 ml próby

Miano = 100/wskaźnik

(MIANO: najmniejsza objętość próby, w której znajduje sie 1 komórka bakteryjna)