Chromosom Y jest specyficzny dla

osobników mêskich, co decyduje
o mo¿liwoœci jego wykorzystania
w badaniach dotycz¹cych napaœci na
tle seksualnym, kiedy istnieje potrze-
ba identyfikacji DNA sprawcy przy
przewa¿aj¹cej iloœci ¿eñskiego DNA
ofiary (ryc. 3). Na chromosomie Y zi-
dentyfikowano szereg markerów
krótkich powtórzeñ tandemowych
(STR), na podstawie których stwo-
rzono multipleksowe sondy reakcji
³añcuchowej polimerazy (PCR),
umo¿liwiaj¹ce rozró¿nianie niespo-
krewnionych mê¿czyzn.

Jedno z potencjalnych zastoso-

wañ badania Y-STR to ustalanie licz-
by osób, których materia³ biologiczny
znalaz³ siê w materiale dowodowym
w przypadkach zgwa³ceñ zbioro-
wych. W takich sytuacjach mamy
czêsto do czynienia z mieszanym
profilem, który jest interpretowany
drog¹ badania liczby oraz wzglêd-
nych wysokoœci pików wystêpuj¹cych
w danym locus. Wiêkszoœæ po-
wszechnie stosowanych markerów Y-
STR to pojedyncze kopie, z wyj¹t-
kiem locus polimorficznego DYS385.
Poniewa¿ wiêc chromosom Y nie ma
chromosomu w pe³ni homologiczne-
go, obserwujemy tylko jeden produkt
PCR w wyniku amplifikacji markera
Y-STR za pomoc¹ jednej pary prime-
rów PCR. Jednak ostatnio, w czasie
przeprowadzania studium populacyj-
nego, stwierdzono, ¿e w ponad 1%
badanych próbek wyst¹pi³o wiele al-
leli z loci, które wczeœniej uwa¿ano
za markery pojedynczych kopii. Poza

tym zaobserwowaliœmy jednoczesn¹
duplikacjê nawet w czterech ró¿nych
loci Y-STR i „jednej kopii”, pochodz¹-
cych od jednej osoby. W tym krótkim
opracowaniu zostanie omówiony
wp³yw duplikowanych (a nawet triple-
towanych) regionów chromosomu Y
na ocenê tego, czy w materiale do-
wodowym wystêpuje mieszanina
DNA pochodz¹ca od wielu dawców.

Materia³y i metody

Próbki DNA

Anonimowe próbki krwi p³ynnej

o znanej przynale¿noœci etnicznej za-
kupiono w Miêdzystanowym Banku
Krwi (Interstate Blood Bank) w Mem-
phis w stanie Tennessee i firmie Mil-
lenium Biotech, Inc. (Ft. Launderdale
w stanie Floryda) zgodnie z przepisa-
mi NIST (National Institute of Stan-
dards and Technology). Z próbek
tych uprzednio izolowano DNA i typo-
wano za pomoc¹ 15 autosomalnych
STR, z zastosowaniem kitu Amp-
FISTR

®

Identifiler™ (Applied Biosys-

tems z Foster City w Kalifornii). Mia³o
to na celu wykazanie, ¿e próbki siê
nie powtarzaj¹ i nie s¹ mieszaninami.

Odczynniki Y-STR

Przy u¿yciu kitu PowerPlex®

z Promega Corporation (z Madison
w stanie Wisconsin) amplifikowano
loci Y-STR: DYS19, DYS385a/b,
DYS389I/II, DYS390, DYS391, DYS-
-392, DYS393, DYS437, DYS438

i DYS439. Amplifikacjê PCR przepro-
wadzono zgodnie z instrukcjami pro-
ducenta w 30 cyklach i na 1–2 ng ma-
trycy DNA. Wykonano te¿ badania za
pomoc¹ NIST 20plex i 11plex.

Wykrywanie i analiza produktów PCR

Rozdzia³ i wykrywanie produktów

PCR przeprowadzono na sekwenato-
rze ABI Prism

®

310 albo ABI

PRISM

®

3100 (system 16-kapilaro-

wy) (Applied Biosystems) zgodnie
z protoko³ami producenta. Po zebra-
niu danych przeanalizowano próbki
za pomoc¹ Genescan

®

3.7 (Applied

Biosystems) i oznaczono allele za
pomoc¹ Genotypera 3.7 (Applied
Biosystems).

Wyniki i omówienie

Duplikacje w wielu loci

w obrêbie jednej próbki

Przeprowadzaj¹c przegl¹d oko³o

650 prób populacyjnych w USA, au-
torzy zaobserwowali w pewnej liczbie
próbek duplikacje w kilku loci Y-STR.
Niektóre z tych próbek zbadano po-
nownie przy u¿yciu kitu PowerPlex Y,
aby zweryfikowaæ fakt wystêpowania
wielu alleli w ró¿nych loci Y-STR.
Ryc. 1 przedstawia wyniki z Genoty-
pera dla jednej z tych próbek, w któ-
rych zaobserwowano wiele alleli Y-
-STR w wiêcej ni¿ jednym locus. Na-
le¿y zauwa¿yæ, ¿e w locus DYS385
czêsto obserwuje siê dwa allele, po-
niewa¿ na chromosomie Y czêsto

PROBLEMY KRYMINALISTYKI 250/05

70

PRZEK£ADY

J.M. Butler, Amy E. Decker, Margaret C. Kline, Peter M. Vallone

Duplikacje chromosomowe na chromosomie Y
i ich potencjalny wp³yw na interpretacjê Y-STR

Journal of Forensic Sciences, 2005, vol. 50, nr 4

wystêpuj¹ dwie kopie. Poniewa¿ sy-
gna³y alleli DYS3891, DYS439, DY-
389II i DYS437 s¹ praktycznie równe
w obrêbie ka¿dego locus, na pierw-
szy rzut oka to spostrze¿enie mo¿e
sugerowaæ obecnoœæ dwóch mêskich
komponentów w podobnych ilo-
œciach. Jednak w tej konkretnej prób-
ce, która by³a te¿ badana za pomoc¹
15 loci autosomalnych STR, stwier-
dzono proporcjonalne heterozygo-
tyczne allele w 13 loci, a homozygoty
tylko w TPOX i D5S818. Poniewa¿
po zbadaniu tak wielu polimorficz-
nych STR w ¿adnym locus autoso-
malnym STR nie stwierdzono wystê-
powania wiêcej ni¿ dwóch alleli, jest
ma³o prawdopodobne, ¿e w tej kon-
kretnej próbce wystêpuje dobrze
zrównowa¿ona mieszanina materia³u
od dwóch ró¿nych mê¿czyzn.

Ze wzglêdu na fakt, ¿e loci DYS-

389I, DYS439, DYS389II i DYS437
s¹ zwykle uznawane za markery po-

jedynczych kopii i dlatego przy ampli-
fikacji powinny dawaæ tylko jeden pik,
je¿eli materia³ pochodzi tylko od jed-
nego mê¿czyzny – autorzy postano-
wili zbadaæ zjawisko duplikacji marke-
ra Y-STR trochê dok³adniej i rozwa-
¿yæ jego potencjalny wp³yw na wykry-
wanie mieszanin mê¿czyzna-mê¿-
czyzna za pomoc¹ badania Y-STR.

Triplikacje

Próbkê, w której stwierdzono trzy

allele w DYS19 z powodu triplikacji
locus DYS19, amplifikowano przy
u¿yciu kitu PowerPlex Y. Nale¿y za-
uwa¿yæ, ¿e wszystkie trzy allele dla
DYS19 s¹ zbli¿one do siebie pod
wzglêdem wysokoœci piku i

¿e

PROBLEMY KRYMINALISTYKI 250/05

71

PRZEK£ADY

Tabela 1

Zestawienie duplikacji albo triplikacji dla czêstych loci Y-STR. Informacje pochodz¹

z Y-STR Haplotype Reference Database (http://www.yhrd.org), wydania 13. z 1 lipca
2004, sk³adaj¹cego siê z 25 066 minimalnych haplotypów. Wartoœci wyt³uszczone
obejmuj¹ allele rozdzielone jedn¹ jednostk¹ powtórzeñ. AMG oznacza informacje
otrzymane od Ann Marie Gross z Laboratorium Kryminalistycznego Biura Kryminalne-
go w Minnesocie. *Nomenklatura DYS448 za Redd i wsp.

Ryc. 1. Elektroferogram PowerPlex Y dla próbki
zawieraj¹cej materia³ od jednego mê¿czyzny z
wieloma allelami w loci „pojedynczej kopii”
DYS389I, DYS389II, DYS439 i DYS437
(zaznaczone). Jednorodnoœæ próbki potwierdzono
poprzez badanie 15 STR autosomalnymi za
pomoc¹ zestawu Identifiler. Warunki zgodne z
opisem w czêœci „Materia³y i Metody” dla 1 ng
DNA i wykrywaniem na ABI 3100.

wszystkie wysokoœci pików alleli z in-
nych loci s¹ zbli¿one, co sugeruje, ¿e
ka¿dy zaobserwowany allel wystêpu-
je na chromosomie Y tylko raz.

Chocia¿ triplikacje s¹ rzadsze,

Ÿród³a donosz¹ o ich wystêpowaniu
w DYS19 i DYS385. Triplikacje
w DYS385 mog¹ powstawaæ w wyni-
ku duplikacji jednego z ju¿ zdupliko-
wanych alleli DYS385 albo duplikacji
ca³ego regionu chromosomu Y, za-
wieraj¹cego allel „a” i „b”. Czêsto su-
ma tych dwóch alleli jest równa inne-
mu allelowi z duplikacjami DYS385.

Model duplikacji locus Y-STR

i dywergencji

Analiza skoñczonej sekwencji re-

gionu eurochromatycznego chromo-
somu Y pozwala zauwa¿yæ, ¿e du¿a
czêœæ sekwencji chromosomu Y po-
jawia siê wiêcej ni¿ jeden raz, czêsto
we wzorze palindromicznym. Ponie-
wa¿ na chromosomie Y zdaje siê wy-
stêpowaæ niewiele genów, istniej¹
mniejsze ograniczenia co do utrzy-
mania konkretnego kontekstu se-
kwencji i dlatego mo¿liwe s¹ polimor-
fizmy insercji du¿ych regionów chro-
mosomu Y. Przy braku rekombinacji
z innymi chromosomami istnieje du¿e
prawdopodobieñstwo akumulacji
zdarzeñ insercji na chromosomie Y,
co prowadzi do powstania licznych
kopii, czyli obszarów przy³¹czenia al-
leli dla loci, które pocz¹tkowo by³y
markerami jednej kopii. Niedawno
doniesiono o tym zjawisku dla obsza-
rów flankowania DYS19. Po amplifi-
kacji PCR zamiast jednej kopii locus
amplifikowano dwie, je¿eli na chro-
mosomie Y istnia³y dwa obszary
przy³¹czenia. Duplikacje mog¹ te¿
skomplikowaæ interpretacjê polimorfi-
zmu pojedynczego nukleotydu chro-
mosomu Y (Y-SNP) z loci takimi jak
P25 i 92R7, utrudniaj¹c te¿ ewentual-
n¹ interpretacjê mieszaniny z tymi lo-
ci, które wystêpuj¹ wiele razy na
chromosomie Y.

Ryc. 3 pokazuje, jak wyst¹pienie

duplikacji Y-STR mo¿e powodowaæ

pojawienie siê najpierw zduplikowa-
nego regionu (a’) w innym miejscu na
chromosomie Y. Region ten mo¿e na-
stêpnie niezale¿nie mutowaæ z up³y-
wem czasu z prêdkoœci¹ oko³o 10-

3

na generacjê, jednostopniowo, pro-
wadz¹c do powstania allela „b”, który
najprawdopodobniej bêdzie siê ró¿ni³
od orygina³u o jedn¹ jednostkê po-
wtórzenia.

PROBLEMY KRYMINALISTYKI 250/05

72

PRZEK£ADY

Ryc. 2. Elektroferogram PowerPlex Y próbki zawieraj¹cej materia³ od jednego mê¿czyzny, w którym
stwierdzono trzy allele w DYS19. Warunki zgodne z opisem w czêœci „Materia³y i Metody” dla 1 ng DNA
i wykrywaniem na ABI 3100.

Ryc. 3. Schemat procesu duplikacji i dywergencji, który mo¿e doprowadziæ do powstania mnogich alleli
na chromosomie Y, kiedy wykorzystuje siê specyficzne dla locus primery Y-STR. Najpierw dochodzi do
duplikacji odcinka (a) i powstaje odcinek (a’), który nastêpnie mo¿e z czasem podlegaæ mutacji w
odnoœnym locus Y-STR poprzez nabycie albo utratê jednostki powtórzenia, aby stworzyæ allel
oznaczony (b). Zauwa¿my, ¿e najlepiej zauwa¿alne allele powinny znajdowaæ siê w odleg³oœci jednej
jednostki powtórzenia, poniewa¿ mutacje jednostopniowe s¹ najpowszechniejsze dla markerów STR.

Duplikowane mog¹ byæ ca³e od-

cinki chromosomu Y, obejmuj¹ce set-
ki par zasad (kb). Markery Y-STR fi-
zycznie le¿¹ce niedaleko siebie na
chromosomie Y mog¹ po duplikacji
wykazywaæ dywergencyjne allele
specyficzne dla loci w tej samej prób-
ce DNA. Istotne jest to, ¿e próbki,
w których wyst¹pi³y konkret-
ne duplikacje, na przyk³ad al-
leli 15 i 16 DYS19, wszystkie
mog¹ nale¿eæ do tej samej
haplogrupy. Tabela 2 przed-
stawia zestawienie wszyst-
kich pozycji markera Y-STR
dla obecnie najczêœciej u¿y-
wanych loci. Zauwa¿my, ¿e
DYS437, DYS439 i DYS-
389I/II, które s¹ duplikowane
w próbce przedstawionej na
ryc. 1, wystêpuj¹ w odleg³o-
œci nie wiêkszej ni¿ 150 kb od
siebie i dlatego jest bardziej
prawdopodobne, ¿e by³y du-
plikowane razem. Ten region
AZFa chromosomu Y zosta³
tak¿e odnotowany przez Bo-
scha i Joblinga jako dupliko-
wany u niektórych jednostek.

Przyk³ad mieszaniny

mê¿czyzna-mê¿czyzna

Aby sprawdziæ, czy zaob-

serwowan¹ duplikacjê locus
Y-STR mo¿na odró¿niæ od
prawdziwej mieszaniny mê¿-
czyzna-mê¿czyzna, zbadano
próbkê zawieraj¹c¹ materia³
od dwóch ró¿nych mê¿czyzn
za pomoc¹ zestawu Power-
Plex Y. Tê konkretn¹ miesza-
ninê dok³adnie zanalizowano
wczeœniej jako „próbkê X”
w studium NIST Mixed Stain
Study #3, poniewa¿ zawiera
przewa¿aj¹c¹ iloœæ DNA ¿eñ-
skiego i dwa komponenty mêskie.
Poszczególne sk³adniki z oznacze-
niami autosomalnego allela STR mo-
g¹ byæ trudne do rozszyfrowania, kie-
dy w próbce wystêpuje DNA od wiê-
cej ni¿ jednego dawcy. Jak zauwa¿y³

Prinz, ustalenie liczby dawców nasie-
nia w przestêpstwach na tle seksual-
nym jest normalnie du¿o prostsze
przy u¿yciu Y-STR, poniewa¿ ¿eñski
komponent DNA nie jest wykrywany.

Jak widaæ na ryc. 4, w tej konkret-

nej mieszaninie dwóch sk³adników
mêskich wiêkszoœæ loci Y-STR o jed-

nej kopii ma wiêcej ni¿ jeden pik i wy-
soce polimorficzne locus DYS385 za-
wiera cztery piki zamiast typowych
dwóch. Dodatkowo wysokoœæ/pole
piku dla DYS392 wynosi mniej wiêcej
dwa razy tyle co analogiczna wiel-

koœæ pozosta³ych pików Y-STR w tym
samym kolorze, co sugeruje, ¿e wy-
stêpuj¹ dwie kopie allela 11 – po jed-
nej od ka¿dego dawcy p³ci mêskiej.
Zauwa¿my tak¿e, ¿e w tej konkretnej
mieszaninie locus DYS439 ma allele
10 i 13, które ró¿ni¹ siê trzema jed-
nostkami powtórzeñ. Podobnie DYS-

-437 zawiera allele 14 i 16,
które s¹ w odleg³oœci dwóch
jednostek powtórzeñ.

W tym przyk³adzie, w któ-

rym wyraŸny stosunek wyso-
koœci/pól pików od poszcze-
gólnych dawców jest bliski 1:
1, nie jest mo¿liwe przypisa-
nie z pewnoœci¹ alleli „wiêk-
szoœciowemu” czy „mniej-
szoœciowemu” dawcy (wa¿-
ne, by odnotowaæ, ¿e wiêk-
szoϾ mieszanin spotyka-
nych w œladach prawdopo-
dobnie nie bêdzie pozosta-
wa³a w stosunku 1:1). Za-
miast przypisywania alleli
konkretnym dawcom w celu
stworzenia haplotypów Y-
STR, które mo¿na by porów-
naæ z baz¹ danych, jest bar-
dziej prawdopodobne, ¿e
dojdzie do wykluczenia albo
potwierdzenia zgodnoœci po-
dejrzanego z profilem mate-
ria³u dowodowego. Przypisa-
nie alleli konkretnemu dawcy
w celu stworzenia z³o¿onego
haplotypu Y-STR najprawdo-
podobniej by³oby ³atwiejsze
przy mieszaninie o nierów-
nych proporcjach (np. 3:1 za-
miast 1:1).

Rozró¿nianie mieszaniny

od duplikacji locus

Aby u³atwiæ rozró¿nianie

ewentualnej duplikacji locus

od potencjalnej mieszaniny materia³u
od dwóch mê¿czyzn przy wykonywa-
niu badania Y-STR, przedstawiamy
tu kilka zasad opracowanych ad hoc.
Po pierwsze, nale¿y odnotowaæ licz-
bê loci, w których wyst¹pi³o wiêcej al-

PROBLEMY KRYMINALISTYKI 250/05

73

PRZEK£ADY

Tabela 2. Fizyczna lokalizacja 50 markerów Y-STR na

chromosomie Y na podstawie przeszukania sekwencyjnego
z wykorzystaniem zestawienia sekwencji Human Genome,
z lipca 2003 (http://genome.ucsc.edu). Pozycje w megaza-
sadach (Mb) s¹ zaokr¹glone do najbli¿szego tysi¹ca par za-
sad. Loci badane w niniejszym artykule s¹ wyt³uszczone.
Bliskie s¹siedztwo zduplikowanych loci zaobserwowanych
na ryc. 1 (DYS437, DYS439, DYDS389I, YS389II) zazna-
czono ramk¹, sugeruj¹c¹, ¿e ten ca³y region zosta³ zdupli-
kowany, a potem, z up³ywem czasu, nast¹pi³a dywergencja
alleli STR.

leli. Im wiêksza liczba loci z wiêcej ni¿
jednym allelem, z wyj¹tkiem uk³adu
DYS385a/b, tym wiêksze prawdopo-
dobieñstwo, ¿e w próbce wystêpuje
mieszanina materia³u od kilku mê¿-
czyzn.

Po drugie, je¿eli wiêcej alleli wy-

stêpuje w wiêcej ni¿ jednym locus,
nale¿y ustaliæ, czy te loci s¹ zlokali-
zowane blisko siebie na chromoso-
mie Y, pos³uguj¹c siê informacjami
na temat wzglêdnej pozycji Y-STR,
np. zawartych w tabeli 2. Je¿eli do-
mniemane zduplikowane loci s¹ bli-
sko siebie (np. <1 Mb), wówczas ca-
³y odcinek chromosomu Y móg³ zo-
staæ zduplikowany kiedyœ w przesz³o-
œci i obecnie ma rozbie¿ne allele. Im

bardziej domniemane zduplikowane
loci s¹ oddalone od siebie na chro-
mosomie Y (np. DYS19 i DYS438,
które znajduj¹ siê na ró¿nych ramio-
nach chromosomu Y), tym bardziej
prawdopodobne jest to, ¿e próbka
zawieraj¹ca wiele alleli w wielu loci
jest mieszanin¹.

Po trzecie, nale¿y zbadaæ odle-

g³oœæ wielokrotnych alleli amplifiko-

wanych za pomoc¹ primerów specy-
ficznych dla locus, aby sprawdziæ,
czy któreœ loci posiadaj¹ allele ró¿-
ni¹ce siê o wiêcej ni¿ jedn¹ jednost-
kê powtórzeñ. Duplikacje zazwyczaj
s¹ w odleg³oœci wiêkszej ni¿ jedno
powtórzenie, iloœæ produktu PCR dla
alleli jest podobna (np. DYS537 alle-
le 14 i 15), podczas gdy mieszaniny
najprawdopodobniej bêd¹ mia³y jed-
no albo wiêcej loci o rozstrzeleniu
wiêkszym ni¿ jedna jednostka powtó-
rzenia (np. DYS437 allele 14 i 16).
Je¿eli przyjrzymy siê odleg³oœciom
alleli dla duplikowanych loci w tabeli
1, dojdziemy do wniosku, ¿e wiêk-
szoϾ alleli dzieli jedna jednostka po-
wtórzeñ. Wreszcie nale¿y zbadaæ

DYS385 i sprawdziæ, czy to wysoce
polimorficzne locus posiada wiêcej
ni¿ dwa allele. Je¿eli tak, i spe³nione
s¹ inne kryteria dla mieszaniny, ist-
nieje wówczas wiêksze prawdopodo-
bieñstwo, ¿e mamy do czynienia
z mieszanin¹ ni¿ duplikacj¹ locus.

Oczywiœcie je¿eli œlad dowodowy

zawiera materia³ z jednego Ÿród³a,
w którym wykryto duplikacjê, ta sama

duplikacja musi wyst¹piæ u prawdzi-
wego sprawcy. Dlatego przypadki du-
plikacji takie jak opisane w tym opra-
cowaniu nie powinny wywo³ywaæ nie-
pokoju w kontekœcie badañ kryminali-
stycznych wykonywanych przy u¿y-
ciu markerów Y-STR. Celem autorów
jest zademonstrowanie, ¿e w próbce
zawieraj¹cej materia³ od jednej oso-
by mog¹ wyst¹piæ wielokrotne dupli-
kacje i dlatego nie nale¿y formu³owaæ
pochopnych wniosków co do liczby
dawców, kiedy w locus o pojedynczej
kopii zaobserwuje siê wiêcej ni¿ je-
den allel o równej intensywnoœci.

Duplikacja locus na chromosomie

Y jest pod wieloma wzglêdami analo-
giczna do heteroplazmii w DNA mito-
chondrialnym, co w zale¿noœci od
okolicznoœci mo¿e przyczyniæ siê do
zwiêkszenia „si³y” zgodnoœci miêdzy
dwiema próbkami. Opisane zjawisko
duplikacji loci nie powinno uniemo¿li-
wiaæ wiarygodnej interpretacji, cho-
cia¿ mo¿e utrudniæ wyjaœnianie wyni-
ków w s¹dzie. Specyficzny dla osob-
ników mêskich chromosom Y jest
u¿ytecznym narzêdziem wspomaga-
j¹cym identyfikacjê, choæ mo¿e siê
ona okazaæ bardziej z³o¿ona, ni¿ po-
cz¹tkowo s¹dzono.

Przegl¹d literatury

zawieraj¹cej doniesienia

na temat duplikacji Y-STR

Autorzy dokonali przegl¹du ok.

200 publikacji, zawieraj¹cych infor-
macje na temat populacji haplotypo-
wej Y-STR. Opracowania pochodz¹
ze zbioru literatury na temat STR
znajduj¹cego siê pod adresem
http://www.cstl.nist.gov/biotech/strba-
se/str_ref.htm. Czêœæ wyników stu-
diów populacyjnych mo¿na znaleŸæ
w Y-STR Haplotype Reference Data-
base (YHRD; http://yhrd.org, wcze-
œniej www.ystr.org.

oprac. Ewa Nogacka

PROBLEMY KRYMINALISTYKI 250/05

74

PRZEK£ADY

Ryc. 4. Elektroferogram PowerPlex Y dla mieszaniny materia³u od 2 mê¿czyzn. W zaznaczonych loci
jest widocznych wiele alleli, które s¹ oddzielone wiêcej ni¿ jedn¹ jednostk¹ powtórzenia. Oprócz tego
wysoce polimorficzne locus DYS385 ma cztery allele zamiast normalnych dwóch. Warunki zgodne z
opisem w czêœci „Materia³y i Metody” dla 1 ng DNA i wykrywaniem na ABI 3100.