EKOFIZJOLOGIA MIKROORGANIZMÓW WODNYCH

1

D

D

Y

Y

N

N

A

A

M

M

I

I

K

K

A

A

W

W

Y

Y

B

B

R

R

A

A

N

N

Y

Y

C

C

H

H

P

P

R

R

O

O

C

C

E

E

S

S

Ó

Ó

W

W

M

M

I

I

K

K

R

R

O

O

B

B

I

I

O

O

L

L

O

O

G

G

I

I

C

C

Z

Z

N

N

Y

Y

C

C

H

H

I

I

W

W

Ł

Ł

A

A

Ś

Ś

C

C

I

I

W

W

O

O

Ś

Ś

C

C

I

I

F

F

I

I

Z

Z

Y

Y

K

K

O

O

-

-

C

C

H

H

E

E

M

M

I

I

C

C

Z

Z

N

N

Y

Y

C

C

H

H

W

W

O

O

D

D

Y

Y

W

W

J

J

E

E

Z

Z

I

I

O

O

R

R

Z

Z

E

E

M

M

I

I

K

K

O

O

Ł

Ł

A

A

J

J

S

S

K

K

I

I

M

M

Z

Z

M

M

I

I

A

A

N

N

Y

Y

P

P

R

R

Z

Z

E

E

S

S

T

T

R

R

Z

Z

E

E

N

N

N

N

E

E

I

I

C

C

Z

Z

A

A

S

S

O

O

W

W

E

E

I

I

I

I

I

I

.

.

A

A

k

k

t

t

y

y

w

w

n

n

o

o

ś

ś

ć

ć

e

e

n

n

z

z

y

y

m

m

a

a

t

t

y

y

c

c

z

z

n

n

a

a

m

m

i

i

k

k

r

r

o

o

p

p

l

l

a

a

n

n

k

k

t

t

o

o

n

n

u

u

Ć

Ć

W

W

I

I

C

C

Z

Z

E

E

N

N

I

I

A

A

Mikołajki: 10 – 20 czerwiec 2007

2

EKOFIZJOLOGIA MIKROORGANIZMÓW WODNYCH

D

D

Y

Y

N

N

A

A

M

M

I

I

K

K

A

A

W

W

Y

Y

B

B

R

R

A

A

N

N

Y

Y

C

C

H

H

P

P

R

R

O

O

C

C

E

E

S

S

Ó

Ó

W

W

M

M

I

I

K

K

R

R

O

O

B

B

I

I

O

O

L

L

O

O

G

G

I

I

C

C

Z

Z

N

N

Y

Y

C

C

H

H

I

I

W

W

Ł

Ł

A

A

Ś

Ś

C

C

I

I

W

W

O

O

Ś

Ś

C

C

I

I

F

F

I

I

Z

Z

Y

Y

K

K

O

O

-

-

C

C

H

H

E

E

M

M

I

I

C

C

Z

Z

N

N

Y

Y

C

C

H

H

W

W

O

O

D

D

Y

Y

W

W

J

J

E

E

Z

Z

I

I

O

O

R

R

Z

Z

E

E

M

M

I

I

K

K

O

O

Ł

Ł

A

A

J

J

S

S

K

K

I

I

M

M

Z

Z

M

M

I

I

A

A

N

N

Y

Y

P

P

R

R

Z

Z

E

E

S

S

T

T

R

R

Z

Z

E

E

N

N

N

N

E

E

I

I

C

C

Z

Z

A

A

S

S

O

O

W

W

E

E

A

A

k

k

t

t

y

y

w

w

n

n

o

o

ś

ś

ć

ć

e

e

n

n

z

z

y

y

m

m

a

a

t

t

y

y

c

c

z

z

n

n

a

a

m

m

i

i

k

k

r

r

o

o

p

p

l

l

a

a

n

n

k

k

t

t

o

o

n

n

u

u

N

N

i

i

n

n

i

i

e

e

j

j

s

s

z

z

y

y

p

p

r

r

o

o

g

g

r

r

a

a

m

m

i

i

o

o

p

p

i

i

s

s

m

m

e

e

t

t

o

o

d

d

o

o

p

p

r

r

a

a

c

c

o

o

w

w

a

a

l

l

i

i

:

:

D

D

r

r

h

h

a

a

b

b

.

.

W

W

a

a

l

l

d

d

e

e

m

m

a

a

r

r

S

S

i

i

u

u

d

d

a

a

P

P

r

r

o

o

f

f

.

.

d

d

r

r

h

h

a

a

b

b

.

.

R

R

y

y

s

s

z

z

a

a

r

r

d

d

J

J

.

.

C

C

h

h

r

r

ó

ó

s

s

t

t

Prowadzący

ćwiczenia:

Prowadzący ćwiczenia:

Dr hab. Waldemar Siuda

Zakład Ekologii Mikroorganizmów

Instytut Mikrobiologii, Uniwersytet Warszawski

Warszawa 2007

3

W

W

p

p

r

r

o

o

w

w

a

a

d

d

z

z

e

e

n

n

i

i

e

e

Jezioro Mikołajskie jest środkową częścią kilkudziesięciokilometrowej rynny jeziorowej,

ciągnącej się z południa na północ, leży na obrzeżach Puszczy Piskiej, w sąsiedztwie Mazurskiego
Parku Krajobrazowego.

Mikołajskie od południa łączy się z Bełdanami, od południowego wschodu przez cieśninę

przy Dybowskim Rogu ze Śniardwami, północną granicą jeziora są mosty w Mikołajkach – za nimi
jezioro Tałty. Na plosie jeziora położone są trzy małe wyspy – dwie na pograniczu z Bełdanami,
trzecia (sztuczna, usypana w latach trzydziestych ub. stulecia) u północnych krańców zbiornika.

Linia brzegowa miernie rozwinięta, brzegi przeważnie wysokie i strome, zachodnie

zalesione (Puszcza Piska), północne i część wschodnich zajmują zabudowania Mikołajek, dalej ku
południowi brzegi wschodnie sa niskie, bezleśne, miejscami podmokłe, z łąkami i polami.

Roślinność jeziorowa dosyć skąpa. Makrofity
wynurzone, reprezentowa-ne przez trzcinę,
porastają wąskim, poprzerywanym pasem brzegi
zachodnie i południową część wschodnich.
Makrofity zanurzone również ubogie, choć
urozmaicone: moczarka, wywłócznik, rogatek,
ramienice, rdestnice, tworzą większe skupiska u
wschodnich brzegów.

Jezioro Mikołajskie

Gmina

Mikołajki

Dorzecze

Pisa – Narew - Wisła

Wysokość npm

116,1 m

Powierzchnia jeziora

497,7 ha

Powierzchnia wysp

1,3 ha

Głębokość maksymalna

25,9 m

Głębokość średnia

11,2 m

Długość maksymalna

5,75 km

Szerokość maksymalna

1,6 km

Długość linii
brzegowej

15,1 km

Jezioro Mikołajskie, przed laty sielawowe, obecnie
silnie zeutrofizowane. W pogłowiu ryb dominują
leszcze, sandacze, szczupaki, okonie, niewiele
węgorzy.

Na

północno-wschodnim i zachodnim brzegu jeziora Mikołajskiego położone jest miasto

Mikołajki (ok. 5,500 mieszkańców), obecnie centrum wypoczynku, żeglarstwa i sportów wodnych
na szlaku Wielkich Jezior Mazurskich, którego szczególnie dynamiczny rozwój i rozbudowa
nastąpiły w latach 90-tych ub. stulecia.

Ścieki komunalne z miasta Mikołajki podlegają procesowi oczyszczania metodą osadu

czynnego w dwustopniowej oczyszczalni biologicznej. W wyniku oczyszczania ze ścieków
usuwane są przede wszystkim zanieczyszczenia organiczne w procesie biologicznego utlenienia,
którego produktami końcowymi jest wiele związków mineralnych (m.in. eutrofogenne biogeny
azotu i fosforu). Ścieki oczyszczone odprowadzane są z oczyszczalni do zatoki w południowej
części jeziora Tałty. Zgodnie z kierunkiem przepływu wody południowej części Wielkich Jezior
Mazurskich (północ − południe) ścieki oczyszczone z zatoki jeziora Tałty przemieszczać się mogą
do północnej części jeziora Mikołajskiego i dalej wzdłuż wschodniego jego brzegu w kierunku
jeziora Śniardwy (Rys. 1 A, B).

4

P

P

l

l

a

a

n

n

y

y

j

j

e

e

z

z

i

i

o

o

r

r

a

a

i

i

m

m

i

i

a

a

s

s

t

t

a

a

Rys. 1 A. Północna połowa jeziora Mikołajskiego

Rys. 1 B. Południowa połowa jeziora Mikołajskiego

Stacja Hydrobiologiczna

CBE PAN

5

6

C

C

e

e

l

l

ć

ć

w

w

i

i

c

c

z

z

e

e

ń

ń

Celem ćwiczeń jest zbadanie dynamiki różnorodności zmian przestrzennych

(horyzontalnych, wertykalnych) i czasowych wybranych właściwości mikrobiologicznych
(fitoplankton, bakterioplankton, heterotroficzne nanowiciowce) i parametrów fizyczno-
chemicznych środowiska wodnego jeziora Mikołajskiego.

W celu zbadania

dynamiki i różnorodności zmian horyzontalnych

próbki wody

powierzchniowej pobrane zostaną z 4 stanowisk z jeziora:

1. stanowisko − północna część jeziora, dopływ wód z jeziora Tałty
2. stanowisko − jez. Mikołajskie, ploso, część centralna jeziora
3. stanowisko − jez. Mikołajskie, wypływ do jeziora Śniardwy
4. stanowisko − jez. Mikołajskie, wypływ do jeziora Bełdany

Wertykalna dynamika zmian zmian i różnorodność:

próbki wody pobrane zostaną w

miejscu o największej głębokości jeziora (głęboczek) w centralnej jego części z trzech warstw
kolumny wody:

1. warstwa fotyczna
2. górna warstwa profundalu
3. warstwa wody przydennej (1 m nad dnem)

Dynamika zmian czasowych:

próbki wody pobrane zostaną w miejscu największej

głębokości jeziora (głęboczek) z dwóch warstw kolumny wody: warstwa powierzchniowa (0-1 m)
oraz przydenna (1 m nad dnem) o różnej porze doby:

1. godz. 6:00
2. godz. 12:00
3. godz. 18:00

We wszystkich pobranych próbkach wody oznaczone zostanie szereg analiz ilościowych i

jakościowych głównych komponentów tworzących mikrobiocenozy jeziorne, zmierzone zostaną
także wybrane procesy aktywności enzymatycznej. Ponadto bezpośrednio w jeziorze określone
zostaną wartości wybranych parametrów fizyko-chemicznych wody in situ (tlen, temperatura,
przewodnictwo elektrochemiczne, pH, mętność wody, autofluorescencja, natężenie światła,
zawartość chlorofilu

a

).

Na

zakończenie zajęć eksperymentalnych poszczególne zespoły badawcze przedstawią (w

formie prezentacji komputerowej Power-Point) wyniki pomiarów i analiz próbek wody, podadzą
ich interpretację wraz z przedstawieniem wniosków finalnych i podsumowaniem literaturowym.

7

P

P

l

l

a

a

n

n

z

z

a

a

j

j

ę

ę

ć

ć

G

G

G

R

R

R

U

U

U

P

P

P

A

A

A

1

1

1

Czerwiec (10 − 15)

Treść zajęć

Niedziela

15

00

− 19

00

− przyjazd, zakwaterowanie

19

30

− zebranie informacyjne

Poniedziałek

9

00

− 13

00

− zajęcia

15

00

> zajęcia

Wtorek

9

00

− 13

00

− zajęcia

15

00

> zajęcia

Środa

9

00

− 13

00

− zajęcia

15

00

> zajęcia

Czwartek

9

00

− 13

00

− zajęcia

15

00

>

opracowanie wyników,

przygotowanie seminarium

Piątek

9

00

− 11

00

−

SEMINARIUM

11

00

− 12

00

− wyjazd ze Stacji

Każdego dnia pomiędzy 13

00

− 15

00

− przerwa obiadowa

8

P

P

l

l

a

a

n

n

z

z

a

a

j

j

ę

ę

ć

ć

G

G

G

R

R

R

U

U

U

P

P

P

A

A

A

2

2

2

Czerwiec (15 − 20)

Treść zajęć

Piątek

15

00

− 19

00

− przyjazd, zakwaterowanie

19

30

− zebranie informacyjne

Sobota

9

00

− 13

00

− zajęcia

15

00

> zajęcia

Niedziela

9

00

− 13

00

− zajęcia

15

00

> zajęcia

Poniedziałek

9

00

− 13

00

− zajęcia

15

00

> zajęcia

Wtorek

9

00

− 13

00

− zajęcia

15

00

>

opracowanie wyników,

przygotowanie seminarium

Środa

9

00

− 11

00

−

SEMINARIUM

11

00

− 12

00

− wyjazd ze Stacji

Każdego dnia pomiędzy 13

00

− 15

00

− przerwa obiadowa

9

Aktywność enzymatyczna

mikroplanktonu

Uwagi ogólne

Aktywność ektoenzymów (m. inn. fosfatazy alkalicznej, aminopeptydazy,

β- i

α-glukozydazy, N-acetylo-glukozaminazy),

enzymów pozakomórkowych (extracellular

enzymes) oraz niektórych enzymów wewnątrzkomórkowych (m. inn. esterazy i

ureazy) jest, obok szybkości produkcji pierwotnej i wtórnej oraz tempa respiracji,

jednym z podstawowych parametrów charakteryzujących aktywność metaboliczną

mikroplanktonu.

Eksperymentalne określenie aktywności enzymu w wodzie polega na dodaniu

do badanej próbki jednego ze standardowych substratów enzymatycznych i pomiarze

tempa przyrostu w niej stężenia barwnego lub fluoryzującego produktu reakcji

uwalnianego przez badany enzym. Jednakże ze względu na dużą zmienność

fizykochemicznych i biologicznych naturalnych środowisk wodnych, ilości i jakości

enzymów wytwarzanych przez mikroorganizmy wodne, a także na nie zawsze

określone podobieństwo substratu standardowego do substratów naturalnych pomiar

rzeczywistej aktywności określonego enzymu in situ jest niezwykle trudny a czasem

wręcz niewykonalny. Dlatego też w badaniach ekofizjologicznych rutynowo określa

się przede wszystkim tzw. potencjalną aktywność maksymalną enzymu (V

max

).

Wartość ta charakteryzuje maksymalną aktywność enzymu w badanej próbce wody

w określonych warunkach pomiaru i przy całkowitym wysyceniu substratem

dodanym do badanej próbki centrum aktywnych enzymu.

Stężenie substratu wysycające badany enzym w badanej próbce wody jest

zwykle nieznane. Jego doświadczalne wyznaczenie, a przynajmniej oszacowanie, jest

warunkiem koniecznym dla ustalenia prawidłowych warunków pomiaru V

max

.

Zarówno ilość i jakość enzymu jak również pula jego naturalnych substratów

10

podlegają w środowiskach wodnych ciąłym i dynamicznym zmianom. Dlatego też

stężenie substratu konieczne do wysycenia badanego enzymu w próbkach pobranych

z różnych środowisk rzadko bywa podobne. W krańcowych przypadkach, może

wahać się ono nawet o rząd wielkości. W praktyce więc zbyt mała (niewysycająca)

ilość substratu dodanego do badanych próbek przed pomiarem zaniża w sposób

istotny wartość V

max

, zaś duży jego nadmiar może czasami znacząco hamować

aktywność niektórych enzymów.

Dokładne doświadczalne wyznaczenie stężenia standardowego substratu

wysycającego badany enzym umożliwia procedura opisana w rozdziale “Kinetyka

reakcji enzymatycznej”.

Kinetyka reakcji enzymatycznej

Uwagi ogólne

Zasada pomiaru

Szybkość rozkładu enzymatycznego substratów przez większość enzymów

hydrolitycznych (np. fosfatazy, aminopeptydazy, itp) opisuje równanie Michaelis’a-

Menten:

Vmax x [S]

V =

Km + [S]

Zależność opisaną wzorem obrazuje wykres przedstawiony na Rys. 1.

0

10

20

30

40

50

60

0

50

100

150

200

250

[s] (µmol/L)

v

(

nm

ol

/L/

godz

)

1/2 Vmax

Vmax

Km

Rys. 1. Zależność szybkości reakcji enzymatycznej od stężenia substratu.

v =

szybkość reakcji

11

12

V

max

= szybkość maksymalna reakcji zachodząca kiedy wszystkie centra

aktywne enzymu zostały wysycone substratem. V

max

zależy of ilości i

aktywności enzymu w badanych próbkach.

K

m

= stężenie substratu, przy którym zachodzi połowiczna szybkość

maksymalna reakcji (1/2 V

max

). K

m

charakteryzuje powinowactwo

enzymu do substratu (im mniejsza wartośc tym większe

powinowactwo). K

m

nie zależy od ilości badanego enzymu w próbce;

na jego wartość może wpływać szereg warunków fizykochemicznych

środowiska reakcji enzymatycznej (np. obecność stymulatorów i/lub

inhibitorów enzymu)

[S] = stężenie substratu enzymatycznego

Parametry charakteryzujące powyższe równanie wylicza się na podstawie określonej

eksperymentalnie zależności szybkości reakcji enzymatycznej (v) od stężenia

substratu [S] dodanego do badanych próbek.

13

Aktywność L-Leucyno-Aminopeptydazy

Zasada oznaczania

Aktywność L-leucyno-aminopeptydazy może zostać określona z wykorzystaniem

sztucznego substratu L-leucyny-7-amido-4-metylkumaryny (LAMK), którego

hydroliza przez aminopeptydazę prowadzi do uwolnienia silnie fluorescencyjnego

rodnika 7-amino-metylkumaryny (AMK). Fluorescencję mierzy się przy ekscytacji

380 nm i emisji 440 nm.

L-Leucyno-7-amido-4-metylkumaryna + AMP => L-leucyna + 7-amino-metylkumaryna

(silnie fluorescencyjna)

Odczynniki

1.

2.

3.

Substrat: L-Leucyna-7-amido-4-metylkumaryna (LAMK; m.cz. 324.8)

Produkt reakcji: 7-amino-metylkumaryna (AMK; m.cz. 175.2)

Eter glikolu etylenowego (Cellosolve)

Przygotowanie odczynników i roztworów

1. Standard 10 nM AMK

Rozpuścić 17.52 mg AMK w 10 ml Cellosolve.

2. Roztwór substratu LAMK

Odważyć 16.240 mg L-leucyno-7-amido-4-metylkumaryny i w kolbce 25 ml

rozpuścić w alkoholu etylowym, dopełnić do kreski. 1 ml tak przyrządzonego

roztworu zawiera 2 µM substratu. Po dodaniu 0.1ml tego roztworu do 3.9 ml

próbki finalna koncentracja będzie 50 µM.

14

Oznaczenie

Kalibracja

Roztwory kalibracyjne sporządza się dodając do 3.9 ml wody destylowanej 0.1 ml

odpowiedniego stężenia AMK w eterze glikolu etylenowego (Cellosolve) tak aby

ostatecznie uzyskać stężenia 0.5, 1.0, 2.5, 5, 10, 20, 50, 100, 200 nM. Roztwór

wyjściowy 2 mM.

Próbki wody

Należy przygotować serię 7-9 probówek i napełnić je 3.9 ml badanej wody. Przy

spektrofluorymetrze, z timerem w ręku, dodawać do kolejnych probówek po 0.1 ml

kolejnych stężeń (LAMK) tak aby uzyskać ostateczne stężenia substratu w próbkach

wynosiły 0.25, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 5.0, 7.5, 10.0, 12.5, 15.0 µM. Po dodaniu

substratu natychmiast wymieszać i mierzyć fluorescencję (ekscytacja 336, emisja

444 nm) w czasie T

0

(Fp). Po 20 - 90 min. inkubacji w ciemności, z timerem w ręku

mierzyć fluorescencję próbek ponownie (Fb). Wyniki podać jako przyrost stężenia

AMK/godz.

Blank

Blank stanowi fluorescencja AMK (Fb) w badanych próbkach wody, w czasie T

0

inkubacji.

Obliczenia

Aktywność aminopeptydazy przy określonym stężeniu substratu (v)wyliczyć wg

wzoru:

F

p

F

b

a, b

t

= fluorescencja próbki badanej po inkubacji

= fluorescencja próbki badanej w czasie T

0

inkubacji

= współczynniki równania regresji liniowej fluorescencji r-rów

kalibracyjnych

AMP (nmol/l/godz) =

[(Fp – Fb) – b ] x 60

a x t

= czas inkubacji (min)

Ponieważ zależność szybkości reakcji enzymatycznej od stężenia substratu w

badanych próbkach wody ma charakter funkcji hiperboli, aby wyliczyć V

max

i K

m

analizuje się równanie regresji nieliniowej zależności v od [S] stosując odpowiedni

program komputerowy (np. Enzfitter, Biosoft). Na podstawie parametrów (V

max

i K

m

)

charakteryzujących kinetykę enzymatycznej hydrolizy badanych związków

organicznych wylicza się czas potrzebny do całkowitego ich rozkładu w próbkach

wody, tzw. "turnover time" (T

t

):

T

t

= K

m

/V

max

Parametry kinetyczne hydrolizy LAMK przez aminopeptydazę (K

m

+S

n

oraz V

max

)

mogą zostać określone np. metodą „direct plot” z użyciem programu

komputerowego Enzpack (Biosoft, UK).

15

Aktywność alkalicznej fosfatazy (APA)

Zasada oznaczenia

Fosfataza alkaliczna (APA; fosfohydrolaza monoestrów fosforowych; E.C. 3.1.3.1.)

reagując z susbtratem sztucznym fosforanem 4-metylumbelliferonu (MUFP)

powoduje jego hydrolizę enzymatyczną uwolniając do środowiska reakcji silnie

fluorescencyjny rodnik (7-metylumbelliferon), którego fluorescencjê mierzy się

fluorometrycznie (ekscytacja 365 nm, emisja 460 nm) w środowisku alkalicznym (pH

= 10,2).

APA

4-metylumbelliferyl-PO

4

3-

+ H

2

O 4-metylumbelliferon + PO

4

3-

(nie fluorescencyjny) H

2

0 (silnie fluorescencyjny)

Odczynniki

1. Substrat: 4-metylumbelliferyl-PO

4

3-

(MUFP; m.cz. 300.1)

2. Produkt reakcji: 4-metylumbelliferon (MUF; m.cz. 194.2)

3. Eter glikolu etylenowego (Cellosolve)

Przygotowanie odczynników i roztworów

1. Roztwór substratu 0,4 mM MUFP

16

17

Rozpuścić 24 mg MUFP w 1-2 ml Cellosolve, po całkowitym rozpuszczeniu

roztwór uzupełnić woda destylowaną do objętości końcowej 20 ml.

Uzyskany roztwór rozcieńczyć 10x wodą destylowaną. 1ml tak uzyskanego r-ru

„roboczego” zawiera 0,4 µmol MUFP, i po dodaniu 0.1 ml tegoż roztworu do

badanej próbki finalne stężenie MUFP w badanej próbce będzie 10.0 µM.

Przygotowany roztwór roboczy, rozcieńczony wodą dejonizowaną użyć do

sporządzenia pozostałych roztworów „roboczych” substratu.

2. Standard 20 µM MUF

Rozpuścić 19.4 mg MUF w 10 ml Cellosolve. Rozcieńczyć 5 00x (100x a

nastepnie 5x) wodą dejonizowaną. 1 ml tak przygotowanego roztworu zawiera 20

µmol MUF.

Oznaczenie

Kalibracja

Roztwory kalibracyjne sporządza się dodając do 3.9 ml wody destylowanej 0.1 ml

odpowiedniego stężenia rozcieńczonego woda destylowaną standardu MUF tak, aby

ostatecznie uzyskać stężenia 0.5, 1.0, 2.5, 5, 10, 20, 50, 100, 500 nM.

Próbki wody

Należy przygotować serię 7-9 probówek i napełnić je 3.9 ml badanej wody. Przy

spektrofluorymetrze, z timerem w ręku, każdą z probówek uzupełnić 0.1 ml

kolejnego roztworu „roboczego” MUFP tak aby ostateczne stężenia substratu w

próbkach wynosiły 0.1 0.25, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 5.0, 7.5, 10.0, µM.

Po dodaniu substratu każdą z próbek natychmiast wymieszać i zmierzyć

fluorescencję (ekscytacja 365, emisja 460 nm) w czasie T

0

(Fb). Po 0.30 - 60 min.

inkubacji w ciemności, z timerem w ręku mierzyć fluorescencję próbek ponownie

(F

p

). Wyniki podać jako przyrost stężenia MUF/godz.

18

Blank

Blank stanowi fluorescencja MUF (Fb) w badanych próbkach wody, w czasie T

0

inkubacji.

Obliczenia

F

p

F

b

a, b

t

= fluorescencja próbki badanej po inkubacji

= fluorescencja próbki kontrolnej po inkubacji

= współczynniki równania regresji liniowej fluorescencji r-rów

kalibracyjnych

= czas inkubacji (min)

Szybkość reakcji enzymatycznej przy określonym stęzeniu substratu (v) oraz parametry kinetyczne

hydrolizy MUFP przez APA (K

m

+S

n

,V

max

oraz T

t

) określić analogicznie jak w przypadku AMP.

Aktywność esteraz (EST)

Zasada oznaczenia

Ektoenzymy typu esteraz to grupa niespecyficznych enzymów hydrolizujących

wiązanie estrowe w szeregu zwiazków organicznych

reagując z susbtratem sztucznym dwuoctanem fluoresceiny (FDA) powoduje jego

hydrolizę enzymatyczną uwolniając do środowiska reakcji silnie fluorescencyjną

fluoresceinę, której fluorescencję mierzy się fluorometrycznie (ekscytacja 365 nm,

emisja 460 nm) w środowisku obojetnym (pH = 7,2).

Odczynniki

1. Substrat: dwuoctan fluoresceiny (FDA; m.cz. 416.38)

2. Produkt reakcji: fluoresceina (m.cz. 332.31)

3. 0.2 M roztwór Tris (m.cz.121.14)

0.2 M HCl (m. Cz. 36,5)

4.

5. Bufor Tris HCl 0.2 M, pH=7,2

Aceton

6.

19

20

Przygotowanie odczynników i roztworów

1. Roztwór substratu 0,6 mM FDA

Rozpuścić 24,98 mg FDA w 10m1 acetonu, po całkowitym rozpuszczeniu

uzyskany roztwór rozcieńczyć 10x acetonem aby uzyskać r-r „roboczy” FDA o

stęzeniu 0.6 mM. Po dodaniu 0.1 ml tegoż roztworu „roboczego” do 3,9 ml próbki

uzyskamy stęzenie finalne FDA w próbce 15.0 µM.Przygotowany roztwór

roboczy, rozcieńczony acetonem użyć do sporządzenia pozostałych roztworów

„roboczych” substratu.

2. Standard 4 mM fluoresceiny

Rozpuścić 26.6 mg fluoresceiny w 20 ml acetonu. Rozcieńczyć 200x (100x a

nastepnie 2x) acetonem. 1 ml tak przygotowanego roztworu zawiera 20 µmol

fluoresceiny.

3. Bufor Tris HCl 0.2 M

Do 50 ml 0.2M roztworu Tris dodać, w 100 ml kolbce, 44,2 ml 0.2M HCl. Po

dopełnieniu wodą do 100 ml otrzymuje się bufor o stęzeniu 0,1 M i pH 7,2.

Oznaczenie

Kalibracja

Roztwory kalibracyjne sporządza się dodając do 3.8 ml wody destylowanej 0,1 ml
1M buforu Tris HCl oraz 0.1 ml odpowiedniego stężenia rozcieńczonego acetonem
standardu fluoresceiny tak, aby ostatecznie uzyskać stężenia 0.5, 1.0, 2.5, 5, 10, 20,
50, 100, 500 nM.

Próbki wody

Należy przygotować serię 7-9 probówek i napełnić je 3.8 ml badanej wody.

Wszystkie próbki uzupełnic 0.1ml buforu TrisHCl (pH 7.2) Przy

spektrofluorymetrze, z timerem w ręku, dodawać do kolejnych probówek po 0.1 ml

21

kolejnych stężeń substratu (FDA) tak aby jego ostateczne stężenia w próbkach

wynosiły 0.25, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 5.0, 7.5, 10.0, 12.5, 15.0 µM. W czasie T

0,

natychmiast po dodaniu substratu, próbki wymieszać i zmierzyć ich fluorescencję

(ekscytacja 489, emisja 510 nm). Po 20 - 90 min. inkubacji w ciemności, z timerem w

ręku mierzyć fluorescencję próbek ponownie. Wyniki podać jako przyrost stężenia

fluoresceiny/godz.

Blank

Blank stanowi fluorescencja (Fb) mierzona w badanych próbkach wody, w czasie T

0

inkubacji.

Obliczenia

F

p

F

b

a, b

t

= fluorescencja próbki badanej po inkubacji

= fluorescencja próbki kontrolnej po inkubacji

= współczynniki równania regresji liniowej fluorescencji r-rów

kalibracyjnych

= czas inkubacji (min)