Sprawozdanie z laboratorium biologii

Temat: Aktywność enzymatyczna.

Enzymy są to białkowe katalizatory produkowane przez żywe komórki. Są zazwyczaj bezbarwne, czasami żółte, zielone, brązowe lub czerwone. Są rozpuszczalne w wodzie lub rozcieńczonym roztworze soli. Wpływają na szybkość i kierunek reakcji, nie zużywając się przy tym. Obniżają energię aktywacji w stosunkowo niskich temperaturach. Jeden rodzaj enzymu katalizuje jeden rodzaj reakcji.

W budowie enzymu można wyróżnić część białkową i niebiałkową. Trwale związaną cześć białkową z częścią niebiałkową nazywamy grupą prostetyczną, natomiast połączenie nietrwały nazywamy koenzymem. W budowie koenzymu część białkową określa się jako apoenzym, a niebiałkową holoenzym. Na powierzchni enzymu występuje zagłębienie, czyli centrum aktywne zawierające odpowiednie aminokwasy. Właśnie w tym miejscy przyłącza się niebiałkowy składnik enzymu. Boczne łańcuchy enzymu nazywamy grupami katalitycznymi, które są odpowiedzialne za rozpoznawanie, wpasowywanie i przemiany konkretnego substratu.

Za hamowanie albo aktywację enzymów odpowiadają różnego rodzaju substancje niskocząsteczkowe. Wyróżniamy hamowanie kompetencyjne (inhibitor jest podobny do substratu chemicznie i fizycznie, wchodzi w centrum aktywne enzymu), niekompetencyjne ( inhibitor jest niepodobny do substratu chemicznie i fizycznie, mimo to blokuje centrum aktywne), allosteryczne (inhibitor blokuje enzym w innym miejscu niż centrum aktywne, poprzez centrum allosteryczne).

Część katalitycznej siły enzymów wynika z zestawienia ze sobą ich substratów w korzystnej orientacji w kompleksach enzym-substrat. Przy stałym stężeniu enzymu szybkość reakcji zwiększa się wraz ze wzrostem stężenia substratu, aż do osiągnięcia maksymalnej szybkości reakcji. Przy odpowiednio dużych stężeniach substratu wszystkie miejsca katalityczne zostają osadzone i dlatego szybkość reakcji osiąga maksimum.

Zadanie 1.

Wstęp teoretyczny:

Oksydaza polifenolowa jest enzymem, który uczestniczy w utlenianiu powietrzem substancji zawierających ugrupowania polifenolowe. Ich utlenianie odpowiedzialne jest za ciemnienie np. świeżo obranych warzyw (ziemniaki). W wyniku utleniania syntezują się melaniny, które są barwnikami nadającymi kolor od jasnobeżowego do ciemnobrązowego.

Przebieg doświadczenia:

Do 4 ponumerowanych probówek dodano ok. 3 ml wyciągu z ziemniaka. Probówkę nr 3 ogrzano w łaźni wodne przez ok. 5 minut w temperaturze 100°C, a następnie ochłodzono do temperatury pokojowej. Do wszystkich probówek dodano odmierzone w poniższej tabeli ilości 0,1 M buforu fosforanowego o pH=7,4, 0,3% roztwory pirokatechiny i wody destylowanej. Następnie zamieszano zawartość wszystkich probówek i pozostawiono w temperaturze pokojowej. Co kilka minut probówkami nr 1, 2 i 3 wstrząsano dla lepszego dostępu powietrza. Wyniki odczytano po upływie 30 minut.

Nr próby	Wyciąg z ziemniaka [ml]	Woda [ml]	Bufor fosforanowy [ml]	Pirokatechina [ml]
1	3	0	0,5	1
2	3	1	0,5	0
3	3	0	0,5	1
4	3	0	0,5	1

Obserwacje:

W probówce 1 roztwór przyjął rdzawo-brązowy kolor. W probówce 2 i 3 roztwór przyjął barwę szarą, w 4 kolor jasnobrązowy. Roztwory w 1, 2 i 3 probówce były mocno spienione i klarowne, natomiast w 4 mniej spieniony i przejrzysty.

Wnioski:

W próbówce nr 3 reakcja nie zaszła, ponieważ wcześniejsze podgrzanie spowodowało dezaktywację oksydazy. W próbówce 2 reakcja również nie zaszła, ponieważ nie było w niej pirokatechiny, która stanowi substrat reakcji. Wyciąg z ziemniaka zawiera ugrupowania polifenolowe, która uaktywnia się w wyniku połączenia z substratem. Pozytywny wynik dały próby nr 1 i 4 co świadczy o obecności oksydaza polifenolowej w wyciągu z ziemniaka. Różnica w kolorach wynika z różnicy szybkości utleniania, które zaszło szybciej w probówkach 1, 2 i 3 niż probówce 4 ze względu na ograniczenie tlenu. Próby 2 i 3 zostały wykonane w celu wykrycia wpływu wysokiej temperatury na aktywność enzymu i ustalenia substratu reakcji.

Zadanie 2. Próba benzydynowa.

Wstęp teoretyczny:

Próba benzydynowa jest to próba służąca do wykrywania enzymu peroksydazy, która jest katalizatorem utleniania nadtlenkiem wodoru różnych substratów, tu odczynnika benzydynowego, który pod działaniem utleniaczy daje błękitny wielocząsteczkowy produkt o złożonej budowie. W obecności peroksydaz utlenianie przebiega bardzo szybko.

Przebieg doświadczenia:

Do dwóch probówek dodano ok. 1 ml wyciągu z ziemniaka. Jedną z nich ogrzano w łaźni wodnej (temperatura 100°C) i następnie ochłodzono do temperatury pokojowej. Do obu probówek dodano ok. 1 ml świeżo przygotowanego odczynnika benzydynowego.

Obserwacje:

Roztwór wcześniej zagotowany nie zmienił barwy, pozostał ciemnoszary, natomiast wcześniej zagotowany zmienił kolor na ciemnoniebiesko po dodaniu odczynnika benzydynowego.

Wnioski:

W wyciągu z ziemniaka, który nie był wcześniej ogrzany obecny jest enzym peroksydazy. Wysoka temperatura dezaktywowała enzym.

Zadanie 3. β-amylaza z nasion zbożowych.

Wstęp teoretyczny:

Próba Benedicta służy do wykrywania cukrów redukujących i czasem aldehydów. Odczynnik Benedicta to mieszanina siarczanu miedzi i przesączonej mieszaniny uwodnionego cytrynianu sodu z uwodnionym węglanem sodu. Odczynnik Benedicta dodaje się do roztworu i doprowadza do wrzenia. Duże stężenie cukrów redukujących lub aldehydu powoduje powstanie czerwonego osadu tlenku miedzi, mniejsze żółtego osadu. Jest to znaczne udoskonalenie próby Trommera.

Próba Lugola służy do wykrywania skrobi.  Płyn Lugola to wodny roztwór jodu z jodkiem potasu, Dodany do płynów zawierających skrobię zmienia ich barwę na fioletowo-czarną, przy niewielkich stężeniach na niebieskofioletową.

Przebieg doświadczenia:

Do sześciu ponumerowanych probówek dodano ok. 7 ml wody destylowanej i ok. 1 ml 0,5% roztworu skrobi. Do probówki nr 1 dodano ok. 0,3 ml zagotowanego i oziębionego wyciągu z nasion. Do pozostałych probówek dodano ok. 0,3 ml niezagotowanego wyciągu z nasion i zamieszano. Próbówki nr 2 nie inkubowano, wstawiono ją natychmiast do wrzącej łaźni wodnej (100°C) na ok. 5 minut w celu przerwania reakcji. Resztę probówek wstawiono do łaźni o temperaturze 37°C na czas podany w poniższej tabelce.

Po upływie podanego czasu wyjmowano kolejne probówki i zagotowano w łaźni wodnej (100°C) przez ok. 5 minut. Następnie oziębiono zawartość każdej probówki i podzielono na 2 równe części. W jednej przeprowadzono próbę Benedicta, a w drugiej Lugola dla każdej z probówek.

Obserwacje:

Zmiany barwy roztworu zawiera poniższa tabela:

Nr próby	Czas inkubacji	Próba Benedicta	Próba Lugola
1	30	jasnoniebieski	jasnoniebieski
2	0	mała ilość ceglastego osadu	jasnoniebieski
3	5	ceglasty osad	niebieski
4	10	ceglasty osad	jasnoniebieski
5	20	ceglasty osad	jasnofioletowy
6	30	ceglasty osad	bezbarwny

Wnioski:

Substratem reakcji jest β-amylaza, która pochodzi z nasion zbożowych. Próba lugol zostały wykonana, aby zbadać zawartość skrobi, a próba Benedicta w celu wykrycia obecności cukrów redukujących w roztworze, pochodzących z rozkładu skrobi. Podczas próby Lugola barwa roztworu wraz ze wzrostem okresu inkubacji stawała się coraz mniej intensywna. Wynika z tęgo, że enzymy pochodzące z nasion miały więcej czasu na rozłożenie skrobi, która została całkowicie rozłożona w probówce 6. W próbie Benedicta wraz ze wzrostem czasu inkubacji wzrasta ilość ceglastego osadu. Poświadcza to również rozkład skrobi na cukry proste przez enzym. Próba kontrolną doświadczenia była próba 1, ponieważ pogrzanie spowodowała denaturację enzymów, które nie brały udziału w późniejszej reakcji.

Zadanie 4. Inwertaza z drożdży.

Wstęp teoretyczny:

Inwertaza to enzym z klasy hydrolaz, rozkładający cukier sacharozę na glukozę i fruktozę. Występuje głównie w komórkach roślinnych, gdzie związany jest ze ścianą komórkową.

Próba Benedicta wykrywa obecność cukrów redukujących.

Przebieg doświadczenia:

Do czterech probówek dodano odmierzone ilości podanych w tabeli enzymu, wody destylowanej, roztworu inwertazy z drożdży, roztworu sacharozy i bufor octowy o pH=4,4. Enzym zawarty w probówce nr 4 zagotowano w łaźni wodnej (100°C) przed dodaniem pozostałych składników. Wszystkie próby indukowano w pokojowej temperaturze przez okres 30 minut. Po upływie tego czasu zawartość probówek zobojętniono roztworem węglanu sodu wobec papierka lakmusowego i wykonano próbę Benedicta.

Nr próby	Enzym [ml]	Woda [ml]	Bufor [ml]	Skrobia [ml]	Sacharoza [ml]
1	1	1	1	0	0
2	1	0	1	1	0
3	1	0	1	0	1
4	1	0	1	0	1

Obserwacje:

W probówce 1, 2 i 4 kolor roztworu po dodanie odczynnika Benedicta pozostał niebieski. Natomiast roztwór w probówce 3 przyjął barwę zielono-niebieską oraz wytrącił się ceglasty osad.

Wnioski:

Próba pierwsza dała negatywny wynik, ponieważ nie brały w niej udziału cukry. Taki sam wynika dała próba druga , co dowodzi, że skrobia nie jest cukrem redukującym. Próba czwarta była negatywna, ponieważ poprzez podgrzanie enzym uległ denaturacji. Próba 3 dowodzi, że tylko sacharoza jest rozkładana na cukry redukujące. Inwertaza jest enzymem, który katalizuje hydrolizę sacharozy do glukozy i fruktozy.

Zadanie 5. Enzymatyczna hydroliza skrobi przez α-amylazę śliny.

Wstęp teoretyczny:

α-amylaza to enzym, który odpowiedzialny jest za rozkład skrobi w procesie wstępnego trawienia pokarmu w jamie ustnej. Występuje w ślinie człowieka.

Przebieg doświadczenia:

Do czterech probówek dodano ok. 3 ml 1% roztworu skrobi i ok. 1 ml śliny. Probówkę 3 i 4 zagotowano w łaźni wodnej (100°C). Po ostudzeniu roztworu przeprowadzono próbę Benedicta w probówce 1 i 3 oraz próbę Lugola w probówce 2 i 4.

Obserwacje:

W probówkach, gdzie ślina nie została wcześniej podgrzana po przeprowadzeniu próby Benedicta w roztworze pojawił się ceglastoczerwony osad. Po próbie Lugola można zaobserwować powstanie białego żelu. Po użyciu zagotowanej śliny w przypadku próby Benedicta roztwór pozostał niebieski, natomiast w próbie Lugola przyjął granatową barwę.

Wnioski:

W probówce niezagotowanej próba Benedicta wykryła obecność cukrów redukujących. Brak obecności skrobi poświadcza negatywny wynik próby Lugola. Po zagotowaniu probówek ze śliną nie wykryto obecności cukrów redukujących, natomiast pozytywny wynik próby Lugola dowodzi obecności skrobi. Wysoka temperatura dezaktywowała enzym α-amylazę, który rozkłada skrobię do cukrów prostych redukujących.