Doświadczenie 1.

β-amylaza z nasion zbożowych.

1. Wstęp teoretyczny:

Amylaza to enzym hydrolityczny, rozkładający polisacharydy do cząsteczek dwucukru maltozy. U większości kręgowców amylaza wydzielana jest wyłącznie przez trzustkę, natomiast u człowieka także przez gruczoły ślinowe. Zapoczątkowuje proces trawienia skrobi.

Spotykane są trzy rodzaje amylaz:

• α-amylaza

• β-amylaza

• γ-amylaza

W organizmie człowieka stwierdzono obecność dwóch odmian amylazy, a mianowicie α oraz γ.

β-amylaza hydrolizuje amylopektynę (część skrobi). Wynikiem jest powstanie cząsteczki maltozy. Enzym ten występuje miedzy innymi w nasionach zbóż.

1. Materiały:

1. wyciąg z nasion

2. płyn Lugola

3. 0.5% roztwór skrobi

4. Odczynnik Benedicta

1. Wykonanie:

Do 6 ponumerowanych probówek odmierzamy po 0,7 ml wody i 1 ml roztworu skrobi. Do probówki nr 1 dodajemy 0,3 ml zagotowanego i oziębionego wyciągu z nasion, do pozostałych po 0,3 ml niezagotowanego wyciągu z nasion, mieszamy. Probówkę nr 2 nie inkubujemy tylko od razu wstawiamy do wrzącej łaźni wodnej na ok 5 minut w celu przerwania reakcji. Pozostałe probówki wstawiamy do łaźni o temp. 37ºC na czas podany w tabelce. Po upływie podanego czasu wyjmujemy kolejne probówki i dokładnie zagotowujemy we wrzącej łaźni wodnej (ok 5 minut). Oziębiamy, zawartość każdej z probówek podzielimy na 2 części; w jednej przeprowadzamy próbę Benedicta, natomiast w drugiej próbę Lugola.

1. Obserwacje:

Numer próby	Czas inkubacji (min)	Próba Benedicta	Próba Lugola
1	60	Niebieskie zabarwienie, Brak osadu.	Fioletowe zabarwienie.
2	0	Brunatne zabarwienie, Widoczny osad.
3	10	Brunatne zabarwienie, Widoczny osad.
4	20	Brunatne zabarwienie, Widoczny osad.
5	40	Brunatne zabarwienie, Widoczny osad.
6	60	Brunatne zabarwienie, Widoczny osad.

1. Wnioski:

1. Pozytywny wynik próby Benedicta otrzymałyśmy w probówkach 2-6, natomiast w próbie Lugola pozytywny wynik otrzymaliśmy w probówce 1.

2. Substratem reakcji jest skrobia. Rozkład tego cukru na cukry proste jest katalizowany przez β-amylazę.

3. Próba Benedicta wykorzystana w interesującym nas zadaniu bada właściwości redukujące, natomiast próba Lugola wykrywa obecność skrobi.

4. Próbą kontrolną jest roztwór 1 zawierający dezaktywowany przez wysoką temperaturę enzym zawarty w wyciągu z nasion. Skrobia nie została tu rozłożona do cukrów prostych, dlatego obserwujemy pozytywny wynik próby Lugola (fioletowe zabarwienie).

5. Wraz ze wzrostem czasu inkubacji ilość brunatnego osadu (otrzymanego w próbie Benedicta) zwiększa się, co wskazuje na wzrost stężenia cukrów redukujących w roztworze. Jednocześnie możemy zaobserwować zmniejszanie się intensywności i zanik granatowego zabarwienia w tych roztworach, co z kolei świadczy o spadku ilości skrobi w roztworach. Można zatem wnioskować, że im dłuższy czas inkubacji roztworów w temperaturze 37ºC tym więcej skrobi rozkłada się pod wpływem β-amylazy do cukrów prostych.

Zadanie 2.

Próba benzydynowa.

1. Wstęp teoretyczny:

Peroksydazy to grupa enzymów katalizujących utlenianie nadtlenkiem wodoru różnych substratów.

Badając aktywność peroksydazy jako odczynnika użyto benzydynę Jest to substancja rakotwórcza, należąca do diamin aromatycznych. Utleniona benzydyna przyjmuje barwę niebieską, normalnie zaś jest koloru jasnobrązowego.

1. Materiały:

1. wyciąg z ziemniaków

2. odczynnik benzydynowy

1. Wykonanie:

Do 1 ml wyciągu z ziemniaków dodajemy kilka kropel świeżo przygotowanego odczynnika bezydynowego. Próbę powtarzamy dla wyciągu ziemniaka uprzednio zagotowanego i oziębionego.

1. Obserwacje:

Po dodaniu odczynnika benzydynowego do wyciągu z ziemniaka uprzednio zagotowanego i oziębionego, nie nastąpiła zmiana zabarwienia (kolor jasnobrązowy). Natomiast po dodaniu odczynnika do roztworu nie zagotowanego obserwujemy zmianę zabarwienie na kolor niebieski.

1. Wnioski:

Pojawienie się niebieskiego zabarwienia w probówce z wyciągiem z ziemniaka niezagotowanego świadczy o obecności peroksydazy, której nie ma w probówce z zagotowanym i ostudzonym wyciągiem z ziemniaka.

W obecności peroksydazy benzydyna ulega utlenieniu przez nadtlenek wodoru do difenochinonodiiminy, która kondensując z cząsteczką zredukowanej benzydyny tworzy błękit benzydynowy.

Zadanie 3.

Oksydaza polifenolowa w wyciągu z ziemniaka.

1. Wstęp teoretyczny:

Oksydaza polifenolowa umożliwia przenoszenie elektronów na tlen, uczestniczy w przemianach metabolicznych komórki. Źródłem tego enzymu będzie wyciąg z ziemniaka.

Typową reakcją katalizowaną przez ten enzym jest utlenianie pirokatechiny. Działaniu enzymu ulega również fenol jednowodorotlenowy, przy czym najpierw tworzy się pirokatechina.

1. Materiały:

1. Wyciąg z ziemniaków

2. 0,1 M bufor fosforanowy (pH=7,4)

3. 0,3% r-r pirokatechiny

1. Wykonanie:

1. Do 4 ponumerowanych probówek dodano po 3 ml wyciągu z ziemniaka. Próbkę nr 3 wstawiono na 5 min. Do wrzącej łaźni wodnej, a następnie oziębiono do temperatury pokojowej. Następnie do wszystkich probówek odmierzono podane w tabeli ilości buforu fosforanowego i roztworu pirokatechiny lub wody.

2. Zawartość wszystkich probówek zmieszano, zanotowano czas i pozostawiono w temperaturze pokojowe. Co kilka minut probówki 1-3 mocno wytrząsano dla lepszego dostępu powietrza . Próbę nr 4 pozostawiono bez wytrząsania (ograniczono dostęp tlenu). Wyniki odczytano i umieszczono w tabeli po 30 min.

1. Obserwacje:

Numer próby	Wyciąg z ziemniaka (ml)	Woda (ml)	Bufor fosforanowy (ml)	Pirokatechina (ml)	Wynik
1	3	0	0,5	1	Zmiana barwy na brunatną, reakcja zachodzi w całej objętości roztworu.
2	3	1	0,5	0	Reakcja nie zachodzi, nie ma zmiany barwy.
3	3	0	0,5	1	Reakcja nie zachodzi, nie ma zmiany barwy.
4	3	0	0,5	1	Reakcja zachodzi w górnej warstwie roztworu, zabarwienie brunatne.

1. Wnioski:

1. Substratem reakcji jest pirokatechina. Wyciąg z ziemniaka odgrywa rolę enzymu, który oddziałuje z naszym substratem.

2. W próbie nr 1 zachodzi pełna reakcja w całej objętości próbki, ponieważ jej zawartość została mocno wytrząsana, aby zwiększyć dostęp do tlenu, przez co zwiększyła się szybkość zachodzenia reakcji utleniania pirokatechiny.

3. Kolejne próby mają charakter kontrolny. W próbie nr 2 nie zauważono żadnych zmian. Reakcja nie zaszła, ponieważ nie było substratu reakcji. W próbie nr 3, reakcja również nie zachodzi, gdyż enzym z wyciągu z ziemniaka był nieaktywny (dezaktywacja z pomocą temp. 100 °C), próba ta miała na celu sprawdzenie czy sam substrat nie ulega reakcji. Ostatnia próba sprawdzała jaki wpływ na zajście reakcji ma tlen.

Zadanie 4.

Inwertaza z drożdży.

1. Wstęp teoretyczny:

Inwertaza - enzym rozkładający cukier sacharozę na glukozę i fruktozę. Występuje głównie w komórkach roślinnych, gdzie związany jest ze ścianą komórkową. Najłatwiej uzyskuje się ten enzym z komórek drożdży.

1. Materiały:

1. roztwór inwertazy

2. bufor octanowy (pH=4.4)

3. roztwór skrobi

4. roztwór sacharozy

5. odczynnik Benedicta

1. Wykonanie:

Do 4 ponumerowanych probówek odmierzamy podane w tabeli ilości enzymu, wody, buforu octanowego, roztworu skrobi, roztworu sacharozy.

W probówce nr 4 roztwór enzymu zagotowałyśmy przed dodaniem pozostałych składników.

Próby inkubujemy w temperaturze pokojowej przez 30 min.

Po tym czasie zawartość probówek zobojętniamy roztworem węglanu sodu (wobec papierka lakmusowego) i wykonujemy próbę Benedicta.

1. Obserwacje:

Numer próby	Enzym (ml)	Woda (ml)	Bufor (ml)	Skrobia (ml)	Sacharoza (ml)	Próba Benedicta
1	1	1	1	0	0	Wynik negatywny (zabarwienie niebieskie)
2	1	0	1	1	0	Wynik negatywny (zabarwienie niebieskie)
3	1	0	1	0	1	Wynik pozytywny (pomarańczowe zabarwienie)
4	1	0	1	0	1	Wynik negatywny (zabarwienie niebieskie)

1. Wnioski:

Próba Benedicta dała pozytywny wynik jedynie w trzecie probówce. Nastąpiło w niej wytrącenie ceglastego osadu, co świadczy o obecności cukrów redukujących. Mimo, że substratem reakcji jest sacharoza to w probówce czwartej otrzymujemy negatywny wynik, ponieważ przez zagotowanie enzymu zostaje on dezaktywowany.

Zadanie 5.

Enzymatyczna hydroliza skrobi przez α-amylazę śliny.

1. Wstęp teoretyczny:

α-amylaza odpowiedzialna jest za hydrolizę wiązań α-1,4-glikozydowych, co powoduje skrócenie łańcuchów polisacharydowych budujących skrobię. Powstają dwu­cukry i triozy.

α-amylaza jest enzymem trawiennym, występuje w ślinie (przeprowadza jeden z pierw­szych etapów trawienia) oraz w trzustce.

1. Materiały:

1. 1% roztwór skrobi

2. odczynnik Benedicta

3. ślina

4. płyn Lugola

1. Wykonanie:

1. Do probówek dodano 3 ml roztworu skrobi i 1 ml śliny, zamieszać. Po 10 minutach wykonano próbę Benedicta oraz Lugola.

2. Powtórzono doświadczenie używając śliny uprzednio zagotowanej.

1. Obserwacje:

Ślina	Skrobia (ml)	Próba Benedicta	Próba Lugola
Niezagotowana 1 ml	3	Wynik pozytywny, pojawiło się pomarańczowe zabarwienie.	Wynik negatywny, brak zmian w zabarwieniu roztworu.
Zagotowana 1ml	3	Wynik negatywny, brak zmian w zabarwieniu roztworu.	Wynik pozytywny, pojawiło się granatowe zabarwienie.

1. Wnioski:

1. Substratem reakcji jest skrobia, zaś źródłem enzymu (α-amylazy) jest ślina.

2. Próba Benedicta wykorzystana bada właściwości redukujące, natomiast próba Lugola wykrywa obecność skrobi.

3. Próbą kontrolną jest roztwór 1 zawierający dezaktywowany przez wysoką temperaturę enzym zawarty w ślinie. Skrobia nie została rozłożona do cukrów prostych, dlatego obserwujemy pozytywny wynik próby Lugola (granatowe zabarwienie).

4. Pozytywny wynik w przypadku próby Benedicta warunkowany jest pojawieniem się cukrów redukcyjnych poprzez rozerwanie wiązań w skrobi przez α-amylazę.