Wykład:
Zastosowanie bakterii fermentacji mlekowej w biotechnologii


Po co nam biotechnologia ?
W odniesieniu do produkcji żywności celem biotechnologii jest:

-

opracowanie sposobów poprawienia cech organoleptycznych produktów (koloru, smaku, zapachu)

-

ich wartości odżywczej (zawartości białek, lipidów i sacharydów)

-

modyfikacje cech produkcyjnych roślin (np. opóźnienie dojrzewania, odporność na suszę, zasolenie czy też
na szkodniki, obniżenie kosztów produkcji roślinnej).

Równie ważne jest:

-

zapewnienie bezpieczeństwa zdrowotnego żywności (zwalczanie patogenów i szybkie testy na ich wykrywanie)

-

możliwość pozyskiwania żywności funkcjonalnej, tzn. wzbogaconej np. w witaminy, mikro- i makroelementy oraz
inne cenne składniki odżywcze lub też o obniżonej zawartości składników antyodżywczych

-

produkcja roślin zawierających substancje farmakologiczne, czyli tzw. jadalne szczepionki, rośliny zawierające
określone leki

Wymagania wobec mikroorganizmów stosowanych w biotechnologii:

-

stabilizacja cech genetycznych, fizjologicznych, morfologicznych i technologicznych

-

szczególnie przy produkcji z użyciem drogich składników i w dużej ilości, gdyż wymienione składniki rzutują
na efektywność ekonomiczną przedsięwzięcia

-

dotyczy to głównie organizmów zmodyfikowanych genetycznie, gdyż nakłady finansowe na otrzymanie
rekombinantu o pożądanych cechach są znaczne, zaś stabilność genetyczna organizmu labilna

Zaburzenia procesów biotechnologicznych
Mimo zachowania wszelkich zasad GLP (dobrej praktyki laboratoryjnej) lub GMP (dobrej praktyki przemysłowej) może

dojść do zaburzeń procesów biotechnologicznych:

• zakłócenia założonych warunków inżynieryjnych i w efekcie wydajności procesu
• utraty właściwości użytkowych technologicznych przez mikroorganizm stosowany w procesie biotechnologicznym
• zmiany warunków hodowli lub otrzymywanych produktów
Zaburzenia procesów biotechnologicznych bakteriofagi → straty finansowe

LAB w biotechnologii ???
Produkcja żywności fermentowanej:
Biosynteza aminokwasów:

-

L-lizyna (rodzaj LAB: Brevibacterium)

-

kwas L-glutaminowy (rodzaj LAB: Brevibacterium)

Wiadomo, że drobnoustroje syntetyzują wiele aminokwasów niezbędnych do budowy specyficznych białek.
Geny odpowiedzialne za biosyntezę poszczególnych aminokwasów „kontrolują” aktywność enzymów biorących udział w

biosyntezie danego aminokwasu, aby nie dopuścić do jego nadprodukcji.

W wyniku selekcji drobnoustrojów można uzyskać organizmy przydatne do przemysłowej produkcji aminokwasów.
Jednocześnie przez dobór warunków hodowli, a zwłaszcza mutagenizację drobnoustrojów metodami fizycznymi,

chemicznymi lub inżynierii genetycznej, można uzyskać organizmy zdolne do nadprodukcji danego
aminokwasu.

Mutagenizacja - wywołuje zmiany kierunków metabolicznych w wyniku zmiany aktywności określonych enzymów, co

powoduje zahamowanie biosyntezy niektórych aminokwasów i nadprodukcję pożądanego.

Umożliwia uzyskanie drobnoustrojów z rozkojarzonym systemem regulacji, nadprodukujących dany aminokwas ze

związku chemicznego, który jest prekursorem dla zahamowanej biosyntezy innych aminokwasów.

Uwaga:
Aminokwas, którego biosynteza została zahamowana, powinien być dodawany do pożywki.

Przebieg biosyntezy L-lizyny
1. aminotransferaza glutaminianowa przekształca szczawiooctan z cyklu kwasów trikarboksylowych w L-asparaginian,
2. kinaza asparaginowa przekształca L-asparaginian do semialdehydu β-asparaginowego,
3. enzymem decydującym o syntezie L-lizyny z semialdehydu jest syntetaza dihydrodipikolinianowa,
4. jej aktywność jest kilkunastokrotnie mniejsza od aktywności dehydrogenazy homoserynowej, katalizującej syntezę

L-metioniny, L-treoniny i L-izoleucyny,

5. aktywność kinazy asparaginowej można w 90 % zahamować nadmiarem L-lizyny i L-treoniny, natomiast L-izoleucyna

i L-walina zwiększają jej aktywność o 50 %, znosząc jednocześnie hamujące działanie L-lizyny i L-treoniny,

6. w biosyntezie mikrobiologicznej L-lizyny używa się mutantów auksotroficznych, które nie syntetyzują dehydrogenazy

homoserynowej lub mutantów regulatorowych, których kinaza asparaginowa jest niewrażliwa na obecność
analogu L-lizyny i L-treoniny,

7. najkorzystniej jest używać drobnoustrojów wykazujących te dwa rodzaje mutacji

Biosynteza kwasu L-glutaminowego
1. powstający w cyklu kwasów trikarboksylowych 2-oksoglutaran ulega przemianie do kwasu L-glutaminowego w

obecności dehydrogenazy glutaminianowej lub też może ulec dalszej przemianie w cyklu Krebsa zapoczątkowanej
przez dehydrogenazę 2-oksyglutaranową.

2. u auksotroficznych mutantów aktywność dehydrogenazy oksyglutaranowej jest bardzo mała, natomiast dehydrogenazy

glutaminianowej bardzo duża, co zapewnia nadprodukcję kwasu L-glutaminowego.

Biosynteza antybiotyków i bakteriocyn:

-

nizyna → lantybiotyk obecnie zaliczany do bakteriocyn (niektóre szczepy Lactococcus lactis subsp. lactis)

-

bakteriocyny → bioutrwalanie żywności nie tylko fermentowanej (różne rodzaje LAB)

Bakteriocyny bakterii G(+)
Generalnie, bakteriocyny bakterii Gram-dodatnich dzieli się na 4 klasy:
I) lantybiotyki - peptydy o masie cząsteczkowej poniżej 5 kDa, zawierające w swojej cząsteczce tioeterowy aminokwas

lantioninę, a czasem także 3-metylolantioninę. Są to substancje ciepłostabilne, o średnim lub szerokim spektrum
działania, np. nizyna, laktycyny;

II) peptydowe bakteriocyny - małe, nielantybiotykowe peptydy, o masie cząsteczkowej poniżej 10 kDa, ciepłostabilne,

o średnim lub szerokim spektrum działania, np. pediocyna AcH, sakacyna A, laktokokcyny, leukocyna UAL 187,
enterocyna A, mesenterycyna Y105, diwercyna V41;

III) białkowe bakteriocyny - nielantybiotykowe białka, ciepłolabilne, o masie cząsteczkowej ponad 10 kDa,

o wąskim spektrum działania, np. helwetycyna J, helwecyna J, kaseicyna 80;

IV) kompleksy białkowe - zawierające cząsteczkę cukru lub lipidu niezbędną do ich aktywności, ciepłostabilne,

o średnim spektrum działania, np. leukonocyna S, pediocyna SJ-1.

Nizyna
Nizyna (wykryta w 1947 r.) jest jedyną bakteriocyną produkowaną w skali przemysłowej.
Nie hamuje rozwoju Gram-ujemnych bakterii, drożdży i pleśni, natomiast hamuje rozwój szeregu szczepów bakterii z

rodzajów Staphylococcus, Micrococcus, Clostridium, Bacillus, Listeria, Lactococcus i Lactobacillus.

Uszkadza ścianę komórkową komórek wegetatywnych, ale nie działa na przetrwalniki, chociaż uniemożliwia

przekształcenie się ich w formy wegetatywne.

Jest trawiona przez trypsynę i nie wywołuje oporności oraz jest nietoksyczna dla organizmów wyższych, dlatego jest

bezpieczna dla zdrowia człowieka.

W większości krajów nie ustalono maksymalnego poziomu jej dodatku do żywności.
Znalazła zastosowanie w przemyśle spożywczym, a zwłaszcza w produkcji konserw owocowo-warzywnych, jako że

zachowuje swoją aktywność w temp. 121

o

C przez 15-20 min. (dodanie jej umożliwia obniżenie temperatury

obróbki konserw warzywnych).

Dodatek nizyny do produktów mięsnych, serów topionych, mleka przy produkcji serów (zapobiega rozwojowi bakterii

masłowych, a tym samym wzdymaniu serów).

W niektórych krajach dopuszcza się stosowanie nizyny w produkcji mleka, serów i deserów mlecznych oraz innych

napojów, co zapobiega ich kwaśnieniu.

Biosynteza nizyny
Selekcja szczepów do produkcji nizyny jest bardzo trudna ze względu na ich wrażliwość na bakteriofagi.
Szczepy Lc. lactis subsp. lactis odporne na fagi syntetyzują mało nizyny.
Ponieważ w hodowli Lc. lactis subsp. lactis często obserwuje się zakażenie dzikimi drożdżarni, przygotowanie inokulum

wymaga szczególnej staranności.

W celu uzyskania wymaganej objętości inokulum prowadzi się wielostopniową hodowlę lub też kilka hodowli o małej

objętości pożywki.

Najlepszą pożywką do hodowli bakterii jest sterylizowane mleko pełne, odtłuszczone lub regenerowane.
Hodowlę prowadzi się w warunkach beztlenowych, utrzymując kwasowość pożywki na stałym poziomie.
W celu wydzielenia nizyny, pożywkę po hodowli zakwasza się do pH 2, aby uwolnić nizynę zaadsorbowaną na

powierzchni komórek.

Po odwirowaniu roztwór doprowadza się pH 4,5 i dodaje chloroform oraz izooktanol.
Warstwę zawierającą chloroform wraz z nizyną oddziela się i dodaje ochłodzonego absolutnego alkoholu, co powoduje

wytrącenie nizyny.

Osad nizyny w temp. 50

o

C rozpuszcza się w HCl, a następnie wysala, używając NaCl.

Preparat nizyny w postaci proszku w temp. 18-22

o

C zachowuje aktywność przez kilka lat.

Biosynteza polisacharydów (egzopolisacharydów, EPS):

-

polisacharydy otoczkowe (m.in. rodzaj Lactobacillus)

-

dekstran (Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides i Ln. mesenteroides subsp. dextranicum)

Uwaga:
LAB nie są stosowane do biosyntezy m.in. białek i lipidów.

Polisacharydy otoczkowe

Egzopolimery produkowane przez LAB są polisacharydami zbudowanymi z rozgałęzionych, powtarzających się

jednostek połączonych wiązaniami α- i β-glikozydowymi, wydzielane w wielu odmianach.

Jakkolwiek, skład cukrowy polimerów pozostaje podobny: prawie zawsze są obecne D-galaktoza, D-glukoza, L-ramnoza,

różnią się jedynie wzajemnym stosunkiem molowym.

W polisacharydach mogą być również obecne inne reszty, np. sn-glicerolo-3-fosforan, N-acetyloaminocukry, grupy

fosforowe i acetylowe.

Środowisko i warunki hodowli są jednym z czynników wpływających na skład cukrowy i odmiany wiązań

glikozydowych.

Masa egzopolisacharydów produkowanych przez LAB waha się od 1 × 10

4

do 1 × 10

5

.

Fizyczne i reologiczne właściwości polisacharydów zależą od struktury 3-wymiarowej lub przestrzennej konformacji.
Natomiast 2- i 3-rzędowa struktura zależy od składu chemicznego polimeru.
Chociaż nawet niewielka zmiana w strukturze 1-rzędowej, może mieć ogromny wpływ na konformację i właściwości

EPS.

Znaczenie przemysłowe EPS wynika z ich właściwości emulgujących i reologicznych.
Heteropolisacharydy produkowane przez mezofilne i termofilne LABw wpływają na konsystencję i strukturę jogurtów i

innych fermentowanych napojów mlecznych.

Lewan znalazł zastosowanie w przemyśle spożywczym jako doskonały biozagęszczacz.
Polisacharydy otoczkowe produkowane przez LAB mogą wywoływać również niepożądane efekty: powodują zatykanie

filtrów i rur (dekstrany i lewany przyczyniają się do strat sacharozy w przemyśle cukrowniczym).

Dekstran
Dekstran jest polisacharydem zbudowanym z glukozy połączonej wiązaniami α-(1-6)-D-glikozydowymi. Między

resztami glukozowymi są wiązania α-(1-4)-i α-(1-3)-D-glukozydowe, tworzące „łańcuchy” boczne. Wiązania
α-(1-6)-D-glikozydowe stanowią 90 – 95 % wiązań glikozydowych w dekstranie, chociaż występuje również
dekstran, w którym wiązania α-(1-6)- stanowią poniżej 50 %. Masa cząsteczkowa dekstranu wynosi od 5 x 10

4

do

3 x 10

8

Da. Jest jasnożółtym lub białym proszkiem. W wodzie tworzy roztwór koloidalny o różnej lepkości,

zależnie od ilości i stosunku między wiązaniami α-(1-6)- α-(1-4)- i α-(1-3)-D-glikozydowymi.

W technologii żywności może być stosowany jako zagęstnik, dzięki któremu można uzyskać półstałą konsystencję

produktów. Dotychczas dekstran nie jest dopuszczony jako dodatek do żywności (ang. food additive), chociaż
opatentowano wiele możliwości zastosowania dekstranu.

Bakterie zasiedlające jelita człowieka i zwierząt są zdolne do rozkładu dekstranu, co powoduje szybki wzrost zawartości

cukru we krwi oraz glikogenu w wątrobie (niewydalony dekstran jest metabolizowany w wątrobie do CO

2

i wody).

Dekstran jest polecany jako bezpieczny biodegradowalny składnik opakowań dla żywności.
W 1942 r. Szwed Ingelman zaproponował użycie hydrolizatu dekstranu jako zamiennika plazmy krwi.
Obecnie dekstran o masie cząsteczkowej 70 000 i 40 000 jest stosowany w medycynie, zwłaszcza po urazach

chirurgicznych. Od 1959 r. dekstran jest również używany do produkcji żeli Sephadex, co przyczyniło się do
znacznego postępu w analityce i technikach rozdziału substancji.

Do produkcji dekstranu na skalę przemysłową, w większości krajów, używa się szczepu Leuconostoc mesenteroides

NRRL B12(F) lub Leuconostoc mesenteroides B512.

Proces biosyntezy dekstranu
Przebiega w dwóch etapach:

•

nagromadzenie enzymu dekstranosacharazy,

•

konwersja sacharozy do dekstranu.

Początkowe pH pożywki wynoszące 6,7 - 7,2 w miarę trwania hodowli obniża się do 6,4 - 6,9. Wówczas obserwuje się

syntezę dekstranosacharazy (najintensywniej w pH 6,7). Konwersja do dekstranu najintensywniej zachodzi przy
pH 5,2. Duże znaczenie ma zawartość sacharozy w podłożu, która powinna być większa od 2%. Dlatego podczas
hodowli ciągłej stosuje się zasilanie hodowli sacharozą.

Biosynteza witamin:

-

witamina B

12

(bakterie propionowe: Propionibacterium shermanii i P. freudenreichii)

Synteza witaminy B

12

W procesie biosyntezy witaminy B

12

ważny jest dodatek do pożywki soli kobaltowych, niezbędnych dla syntezy

witaminy, chociaż stężenie kobaltu w pożywce przekraczające 50 ppm hamuje biosyntezę witaminy. Również
dodatek betainy lub choliny stymuluje syntezę witaminy.

W hodowli niektórych drobnoustrojów stosuje się dodatek 5,6-dimetylo-benzoimidazolu, który odgrywa znaczącą rolę w

syntezie witaminy B

12

jako jeden z jej prekursorów witaminy.

P. freudenreichi ATCC 6207 i P. shermanii ATCC 13673 są zdolne do syntezy 5,6-dimetylo-benzoimidazolu w

znacznych ilościach.

Dlatego biosyntezę witaminy B

12

przez te bakterie prowadzi się w 2 etapach:

•

w warunkach beztlenowych prowadzi się namnażanie biomasy i synteza kobinoamidu,

•

w warunkach tlenowych prowadzi się syntezę prekursora i powstanie witaminy B

12

Hodowle bakterii propionowych prowadzi się przez kilka dni w temp. ok. 30

o

C przy pH na poziomie 6,5 - 7,0.

W celu otrzymania paszowego koncentratu witaminy B

12

całość płynu pohodowlanego wraz z bakteriami propionowymi

(witamina B

12

jest nagromadzana wewnątrz komórek) suszy się metodą rozpryskową.

Biosynteza enzymów:

-

Β-D-galaktozydaza (LAB z rodzajów Lactococcus, Lactobacillus) rzadko stosowane !

Produkcja kwasu mlekowego i mleczanów:

-

najczęściej z serwatki, melasy, lub podobnych odpadów przemysłowych

-

LAB z rodzaju Lactobacillus (badania nad wykorzystaniem Bifidobacterium)

-

LAB heterofermentatywne potrafią wykorzystać do tego celu nie tylko proste cukry i dwucukry , ale także cukry
złożone, np. skrobię

Produkcja kwasu propionowego i propionianów:

-

najczęściej z serwatki, melasy,

-

LAB z rodzaju Propionibacterium

-

jednocześnie można wytwarzać witaminę B

12

na cele paszowe

Biosynteza związków aromatotwórczych:

-

związki karbonylowe (LAB z rodzajów Lactobacillus, Streptococcus, Propionibacterium) wykorzystywane
podczas fermentacji żywności

Inne wykorzystanie LAB w biotechnologii:

-

hodowla szczepów probiotycznych

-

kultury starterowe (w tym GMO)

-

wykorzystanie LAB w medycynie

Cel modyfikacji genetycznych - przykłady:



zdolność do metabolizowania galaktozy



obniżanie poziomu cholesterolu w serum krwi lub ciśnienia tętniczego

„Naturalna” droga poszukiwania nowych probiotyków:
W marcowym numerze International Dairy Journal (2006, vol.16, s.189-199) podano informację o nowych szczepach

LAB wyizolowanych z solanki sera feta i spełniających kryteria probiotyczności:

-

Lb. plantarum ACA-DC 146 hamuje w jelitach adhezję E. coli o 40% oraz Salmonella typhimurium o 14%,

-

Lb. paracasei subsp. tolerans ACA-DC 4037 w jelitach hamuje adhezję E. coli i Salmonella o 35% i 28%,

LAB w biotechnologii
Obecnie w technologii produkcji kultur starterowych stosuje się selekcję, która umożliwia dobór szczepów odpornych

na bakteriofagi.

Kryteria doboru i selekcji nowych szczepów są następujące:

Mieszanina szczepów

Przesiewanie

Aktywność syntezy danej substancji

Odporność na bakteriofagi i inne czynniki hodowlane

Identyfikacja plazmidów DNA

Badanie zgodności steroidów

Test na wytwarzanie innych składników

Próbny wyrób produktu

Ocena i klasyfikacja szczepu

UWAGA: bakteriofagi
Fagi (bakteriofagi)
Są czynnikiem zakłócającym w prowadzeniu biofermentacji i produkcji fermentowanych artykułów żywnościowych.
Są pasożytami bakterii.

Współzależność między gospodarzem a bakteriofagiem może być dwojaka:
1.

Lityczna (wirulentna, zjadliwa) (ang. lytic bacteriophages)

2.

Lizogenna (umiarkowana, łagodna) (ang. temperate bacteriophages).

Współzależność lityczna

-

adsorpcja faga na powierzchni komórek (tzw. kompetentnych),

-

injekcja DNA do komórek,

-

cyrkularyzacja fagowego genomu,

-

replikacja (synteza) nowych cząstek fagów najczęściej w liczbie 2 - 100 z 1 komórki,

-

liza komórek bakteryjnych po około 40 - 50 minutach i uwolnienie fagów.

Istnieje zjawisko specyficzności - określone fagi zjadliwe atakują określone gatunki lub szczepy bakterii.
Stąd wynika korzyść stosowania wielogatunkowych kultur starterowych.

Współzależność lizogenna (utemperowana)

-

po wniknięciu do komórki bakterii, DNA faga wbudowuje się do genoforu tej bakterii i podczas podziałów jest
przekazywany (jako profag) do następnych pokoleń.

-

komórki bakterii w tym stanie stają się odporne na ataki identycznych lub pokrewnych fagów, ale mogą być
atakowane przez niespokrewnione fagi.

-

w pewnych okolicznościach (działanie UV, antybiotyków, środków chemicznych, środowiska, spontanicznie)
następuje uwolnienie DNA fagowego z genoforu bakterii, tworzenie nowych cząsteczek faga i zachodzi cykl
lityczny komórki bakteryjnej.

-

bakterie będące nosicielami faga utemperowanego (łagodnego) zostały nazwane lizogennymi,

-

większość bakterii stosowanych w przemyśle znajduje się w stanie lizogenności, co może być przyczyną zakłóceń
w produkcji,

-

fagi łagodne, po wniknięciu do komórek bakterii, mogą powodować indukcję innych, obecnych już profagów i lizę
komórek.

Bakteriofagi rodzaju Lactococcus należą do rzędu Caudovirales. Są to fagi o izometrycznej lub wydłużonej główce

posiadające ogonek.

Wyróżnia się następujące rodziny:

•

- Myoviridae - fagi z kurczliwym ogonkiem,

•

- Podoviridae - fagi z krótkim ogonkiem,

•

- Siphoviridae - fagi z długim, niekurczliwym ogonkiem.

Genomy tych bakteriofagów mają postać liniowego dwuniciowego kwasu DNA o lepkich (kohezyjnych)

lub powtórzonych, komplementarnych końcach.

Takie zakończenia genomów umożliwiają ich cyrkularyzację po dostaniu się do wnętrza komórki gospodarza.
Wielkość genomów waha się od 18 do 130 tpz.
Bakteriofagi wykazują takie samo zróżnicowanie pod względem kwasów nukleinowych jak wszystkie wirusy: mogą mieć

DNA w postaci dwuniciowej lub jednoniciowej koliście zamkniętej lub liniowej, RNA jedno- lub dwuniciowy

Około połowa sekwencji genomu bakteryjnego zawiera sekwencje profaga.
Objawy działania fagów
-

Stopniowe osłabianie tempa ukwaszania przez kultury podczas prowadzenia fermentacji we właściwej
temperaturze i po przewidzianym czasie.

-

całkowite zahamowanie procesu fermentacji, stwierdzane gdy atak fagów był silny.

Źródła fagów
- surowiec i jego mikroflora
- podłoże, np. mleko, serwatka (i pozostawione resztki)
- kurz z powietrza
- nie wydezynfekowane urządzenia
- szczepy lizogenne w szczepionkach

Mechanizmy obrony LAB przed atakiem fagów (najczęściej kodowane na plazmidach):

•

zapobieganie wnikaniu faga do komórki – przez maskowanie lub usunięcie z powierzchni komórki specyficznych
białek rozpoznawanych przez faga,

•

rozbudowanie systemu enzymów modyfikujących bakteryjne DNA w ten sposób, że jest ono rozróżnialne
od fagowego DNA, które, po wykryciu, jest niszczone enzymami restrykcyjnymi,

•

zahamowanie infekcji już po wniknięciu faga do komórki bakteryjnej przez wyrzucenie faga.

Metody zwalczania fagów
-

Selekcjonowanie szczepów opornych na fagi (→ inżynieria genetyczna)

-

Stosowanie metod chemicznych dezynfekujących: do aparatury i pomieszczeń, hodowla lub namnażanie
starterów w podłożach bezwapniowych (antyfagowych)

-

Stosowanie metod fizycznych: wyjaławianie aparatury i pomieszczeń (UV, termicznie), filtrowane powietrze w
pomieszczeniach, aseptyczne urządzenia do hodowli, kultury starterowe do bezpośredniego zaszczepiania surowca
(tzw. DVS)

-

Stosowanie metod biologicznych: rotacja starterów jednoszczepowych co 2 - 3 dni, stosowanie starterów
wieloszczepowych i wielogatunkowych i ich rotacja na inne, o innej wrażliwości na fagi (np. co 14 dni)