1.2 Pożywki

Wszystkie niezbędne do wzrostu substancje hodowany obiekt pobiera z pożywki (tylko kilka
składników może być też, w nieznacznym stopniu, pobierane z atmosfery naczynia hodowlanego).
Pożywka może mieć postać wodnego roztworu (płynna) albo galaretki (pożywka stała), otrzymanej
dzięki dodaniu czynnika żelującego do roztworu substancji odżywczych. Jako substancje odżywcze
pożywka zawiera zwykle następujące składniki (

tab.1

):



proste sole mineralne, dostarczające wszystkich niezbędnych pierwiastków (makro- i
mikroelementów),



witaminy (zwłaszcza z grupy B),



jakiś cukier (zwykle sacharoza), stanowiący dla hodowanego obiektu główne źródło węgla



regulatory wzrostu



czasami jakiś aminokwas, rzadziej inne substancje, np. kwasy organiczne,
przeciwutleniacze.

Hodowanemu obiektowi trzeba dostarczyć wszystkich niezbędnych pierwiastków. Uważa się, że
roślinom do prawidłowego rozwoju potrzebne jest tylko kilkanaście spośród 90 występujących w
przyrodzie pierwiastków. Przyjęło się dzielić je na organogeny (węgiel, wodór i tlen),
makroelementy (tworzą powyżej 0,1% suchej masy roślin, a w pożywkach występują zwykle w
stężeniu powyżej 0,5 mM) i mikroelementy wymagane w mniejszych ilościach (ich zawartość w
roślinach może być ponad 1000x mniejsza niż makroelementów). Oczywiście podane zawartości
makro- i mikroelementów odnoszą się do roślin oszczędnie odżywianych (nie przenawożonych).
Jeśli rośliny hodowane są w środowisku o wysokiej zawartości np. cynku (lub innych
przyswajalnych pierwiastków), to stężenie tego składnika w ich tkankach może wielokrotnie
wzrosnąć, mimo to jednak nie będziemy cynku uważać za makroelement. Makroelementami są: N,
P, K, Ca, Mg, S. Do mikroelementów natomiast zalicza się zwykle: Fe, Mn, Mo, Cu, Zn, B, Cl.
Niektórzy fizjologowie roślin wyróżniają również pierwiastki śladowe, albo korzystne (w
odróżnieniu od niezbędnych), zaliczając do nich np. Co, Na, Si, Al, V (zależnie od gatunku rośliny).
W praktyce jednak granica pomiędzy mikroelementami, a pierwiastkami śladowymi jest trudno
uchwytna i w dalszym opisie pierwiastki z obu grup będziemy nazywać mikroelementami.
Makroelementy i mikroelementy z reguły dostarczane są do pożywki w postaci prostych soli
mineralnych i pobierane są przez komórki w postaci jonów. Żelazo, ze względu na słabą
przyswajalność dla roślin w postaci prostych jonów, zazwyczaj stosowane jest w formie chelatów,
tj. soli kompleksowych, w których atom metalu połączony jest kilkoma wiązaniami
kompleksowymi (tzw. wiązaniami kleszczowymi) z cząsteczką chelatora. Łatwo przyswajalnymi
związkami żelaza są na przykład wersenian żelazowo-sodowy, cytrynian żelaza i winian żelaza. W
tabeli 1 wśród składników kilku pożywek podano wersenian sodowy i siarczan żelaza, jednakże
roztwory tych dwóch substancji łączy się przed dodaniem ich do pożywki, tak że do pożywki
wprowadza się już właściwie produkt ich reakcji, tj. wersenian sodowo-żelazowy (NaFeEDTA).
Tabela 1 podaje skład pożywek w bardzo często stosowanym formacie; ściślej jednak mówiąc,
zawiera ona nie tyle skład pożywki, co zestaw substancji dodawanych do pożywki podczas jej
przyrządzania. Rzeczywisty skład jest znacznie bardziej złożony ze względu na dysocjację soli i
wzajemne oddziaływania poszczególnych składników podczas sporządzania pożywki, jej
odkażania, przechowywania a także podczas hodowli.
Tabela 1. Skład wybranych pożywek do roślinnych hodowli in vitro

MS

B5

WPM

WH

Knop

mM

mg/l

mM

mg/l

mM

mg/l

mM

mg/l

mM mg/l

Źródła makroelementów (makropierwiastków)

1.1 Podstawowe definicje; główne kierunki przemian rozwojowych
roślinnych tkanek

in vitro

NH

4

NO

3

20,6

1650

--

--

4,99

400

--

--

--

--

KNO

3

18,8

1900

25

2500

--

--

0,8

80

2,5

250

CaCl

2

* 2H

2

O

3

440

1

150

0,65

96

--

--

--

--

MgSO

4

* 7H

2

O

1,5

370

1

250

1,5

370

3

737

1

250

KH

2

PO

4

1,25

170

--

--

1,25

170

--

--

1,84 250

(NH

4

)2SO

4

--

--

1

134

--

--

--

--

--

--

NaH

2

PO

4

* H

2

O --

--

1,1

150

--

--

0,12

19

--

--

Ca(NO

3

)

2

*

4H

2

O

--

--

--

--

2,35

556

1,2

288

4,23 1000

KCl

--

--

--

--

--

--

0,9

65

--

--

Na

2

SO

4

--

--

--

--

--

--

1,4

200

--

--

K

2

SO

4

--

--

--

--

5,68

990

--

--

--

--

Źródła mikroelementów (mikropierwiastków)

μM

mg/l

μM

mg/l

μM

mg/l

μM

mg/l

μM mg/l

FeSO

4

* 7H

2

O

100

27,8

100

27,8

100

27,8

--

--

(45) (12,5)

Fe

2

(SO

4

)

3

--

--

--

--

--

--

6,3

2,5

--

Na

2

EDTA *

2H

2

O

100

37,3

100

37,3

100

37,3

--

--

KI

5

0,83

4,5

0,75

--

--

4,5

0,75

H

3

BO

3

100

6,3

50

3

6,2

25

1,5

MnSO

4

* 4H

2

O

100

22,3

--

--

29,43

29,8

6,65

MnSO

4

* H

2

O

--

--

60

10

--

--

--

--

ZnSO

4

* 7H

2

O

30

8,6

7

2

8,6

9,3

2,67

Na

2

MoO

4

*

2H

2

O

1

0,25

1

0,25

1

0,25

--

--

MoO

3

--

--

--

--

--

--

0,007

0,0001

CuSO

4

* 5H

2

O

0,1

0,025

0,1

0,025

1

0,25

0,004

0,001

CoSO

4

* 6H

2

O

0,1

0,025

0,1

0,025

--

--

--

--

Składniki organiczne

μM

mg/l

μM

mg/l

μM

mg/l

μM

mg/l

sacharoza

87.600 30.000 58.400 20.000 58.400 20.000 58.400 20.000

mio-inozytol

555,1

100

555,1

100

555,1

100

-

kwas nikotynowy 4

0,5

8,1

1

4

0,5

4

0,5

pirydoksyna-HCl 2,4

0,5

4,9

1

2,4

0,5

0,5

0,1

tiamina-HCl

0,3

0,1

29,6

10

3

1

0,3

0,1

pantotenian-Ca

--

--

--

--

--

--

1

glicyna

25

2

--

--

25

2

40

3

cysteina-HCl

--

--

--

-1

Odczyn (pH)

5,6 - 5,8

agar [g/l]

10 (8)

8

8

8

--

Analizę składu różnych pożywek utrudnia fakt, że ten sam pierwiastek może być dostarczany w
postaci różnych soli, a ta sama sól może (w niektórych przypadkach) być stosowana w różnym
stopniu uwodnienia. W związku z tym porównując pożywki warto rozpatrywać stężenia molowe
(lub mM czy μM) poszczególnych składników. Wskazane jest też zestawienie tzw. bilansów
jonowych pożywek, podsumowujących stężenia danego jonu niezależnie od tego w formie jakiego
związku jest dostarczany (tabela 2).
Tabela 2. Bilanse jonowe wybranych pożywek do roślinnych kultur in vitro (zachęcamy czytelnika
do uzupełnienia tabeli dla pożywek WPM i WH na podstawie danych z tabeli 1; pożywka Knopa -
podobnie jak większość pozostałych - stosowana była w wielu wersjach; zwykle nie zawierała Fe,
ale czasami dodawano je w formie siarczanu; zaznaczono to - w tej tabeli, podobnie jak w
poprzedniej - liczbami w nawiasach)

MS

B5

WPM

WH

Knop

[mM]

NO

3-

39,4

25

6,7

NH

4

+

20,6

1

0

og.azot

60

26

6,7

PO

4

3-

itp. 1,2

1,1

1,84

K

+

20

25

4,31

Ca

2+

3

1

4,23

Mg

2+

1,5

1

1,01

SO

4

3-

1,731

2

1,01
(1,055)

Fe

2+

0,1

0,1

0
(0,045)

I

-

0,005

0,004

0

BO

3

3-

0,1

0,048

0

Mn

2+

0,1

0,06

0

Zn

2+

0,03

0,07

0

Mo

6+

0,001

0,001

0

Cu

2+

0,0001

0,0001

0

Co

2+

0,0001

0,0001

0

Cl

-

6

2

0

Pożywka MS, opracowana w 1962 r. przez Murashigego i Skooga (czyt. [Muraszigego] i [Skuuga])
zaliczana jest do podłoży bogatych. Charakteryzuje się zwłaszcza znaczną zawartością azotu i to w
obu podstawowych postaciach: azotanowej i amonowej. Pierwotnym przeznaczeniem pożywki MS
były hodowle tkanek łodygi tytoniu (por.

dodatek 2

), ale obecnie jest ona wykorzystywana bardzo

powszechnie do kultur in vitro bardzo różnych gatunków roślin i różnych ich fragmentów.
Stosunkowo bogatą pożywkę stanowi też zestaw B5 Gamborga, opracowany początkowo w celu
hodowli kalusów soi, a charakteryzujący się wysoką zawartością jonów azotanowych, a także
witamin z grupy B. O wiele uboższy skład ma pożywka Knopa, opracowana z przeznaczeniem do
wodnych i hydroponicznych upraw całych roślin, ale znajdująca czasem zastosowanie także do
kultur in vitro, zwłaszcza niezbyt wymagających, na przykład do kiełkowania nasion lub
zarodników. Również uboga jest pożywka WH opracowana przez White'a i stosowana głównie do
hodowli fragmentów korzeni.
Pożywka WPM została opracowana (przez Lloyda i McCowna) w celu hodowli tkanek roślin
drzewiastych (skrót pochodzi od ang. Woody Plant Medium). W porównaniu z pożywką MS
podłoże WPM charakteryzuje się obniżoną ogólną zawartością soli, a zwłaszcza związków azotu i
chloru. Osiągnięto to, zastępując - częściowo - chlorek wapnia azotanem, a azotan potasu (w
całości) - siarczanem. W związku z tym pożywka WPM charakteryzuje się też wysoką zawartością
siarki.
Witaminy dodawane do pożywek dla roślinnych kultur in vitro, należą przede wszystkim do grupy
B. Zwykle są to: tiamina (B

1

), kwas nikotynowy (B

3

, PP), kwas pantotenowy B

5

, pirydoksyna (B

6

).

Do witamin grupy B zalicza się również mio-inozytol (syn. mezo-inozytol), jakkolwiek w
odróżnieniu od wszystkich powyższych witamin inozytol nie zawiera grupy aminowej i nie pełni
funkcji prekursora żadnego koenzymu (natomiast jest ważnym składnikiem błony komórkowej). Z
tych powodów inozytol pod względem biochemicznym trafniej określany bywa jako cyklitol
(cykliczny, wielowodorotlenowy alkohol). Znacznie rzadziej od powyższych substancji dodaje się
do pożywki witaminę B

2

(ryboflawinę), kwas foliowy (witaminę B

c

) oraz - nie zaliczany już do

grupy B - kwas askorbinowy (czyli witaminę C). Ryboflawina, na świetle, znacznie przyspiesza
utlenianie niektórych regulatorów wzrostu z grupy auksyn i czasami bywa właśnie do tego
wykorzystywana. Ponieważ w wyniku takiej fotoprzemiany następuje również unieczynnienie
samej witaminy B

2

, pożywki zawierające tę substancję są na świetle stosunkowo nietrwałe. Jako

przeciwutleniacz bywa natomiast dodawany do pożywki kwas askorbinowy. Tę samą funkcję może
spełniać aminokwas cysteina. Jeszcze częściej dodaje się do pożywek glicynę oraz kwas
glutaminowy lub glutaminę, choć już nie w charakterze przeciwutleniaczy, ale po prostu jako
aminokwasy przyspieszające wzrost niektórych obiektów. Prawie zawsze pożywka zawiera też jakiś
cukier. Uważa się, że na rośliny dwuliścienne najkorzystniej działa zwykle sacharoza (w stężeniu
1-5%), natomiast do hodowli jednoliściennych lepsza może okazać się glukoza (3 - 4%). Dużo
rzadziej dodaje się do pożywki fruktozę, maltozę, galaktozę, laktozę lub mannozę. Sporadycznie
opisywano tkanki, np. sekwoi i bielma kukurydzy, które mają tak wysoką aktywność amylolityczną,

że jako jedyne źródło węglowodanów wystarcza im polisacharyd - skrobia. Cukry pełnią funkcje
zarówno substratu do przemian metabolicznych, jak i substancji decydującej o dostępności dla
roślin wody z pożywki (tj. o potencjale osmotycznym pożywki). Wskazuje na to fakt, że w
hodowlach kalusa tytoniu sacharozę można częściowo zastąpić rafinozą (cukrem nieprzyswajalnym
dla tych komórek).
Wprowadzanie do pożywek cukrów, witamin i aminokwasów może trochę dziwić, bo wiadomo, że
w naturalnych warunkach rośliny zadowalają się pobieranymi ze środowiska prostymi związkami
mineralnymi. Trzeba jednak pamiętać, że nie wszystkie komórki roślinne przeprowadzają
fotosyntezę i są samożywne. Poza tym w warunkach kultur in vitro wydajność fotosyntezy jest
dodatkowo ograniczana szybkim wyczerpywaniem się dwutlenku węgla w dość szczelnie
zamkniętym naczyniu hodowlanym (szczelne zamknięcie ma chronić hodowany obiekt przed
zakażeniami i wysychaniem). Dostarczając hodowanym obiektom organicznych półproduktów,
jakimi są cukry czy aminokwasy, możemy uzyskać zwiększenie częstości podziałów i
przyspieszenie wzrostu. Z drugiej jednak strony właśnie z powodu dodawania do pożywki
składników organicznych konieczne staje się prowadzenie wszystkich manipulacji w warunkach
jałowości, ponieważ substancje te bardzo pobudzają rozwój drobnoustrojów. Utrudnia to trochę
pracę i podnosi koszty, stąd podejmuje się czasem próby zakładania hodowli w pełni samożywnych,
na ubogich, mineralnych pożywkach.
Bardzo charakterystycznymi składnikami pożywek, silnie wpływającymi na wynik hodowli są
substancje zwane regulatorami wzrostu, albo fitohormonami. Ta druga nazwa sugeruje oczywiście,
że chodzi o roślinne substancje, które pełnią funkcje podobne do zwierzęcych hormonów. W
przeciwieństwie jednak do hormonów zwierzęcych, fitohormony często wytwarzane są nie w ściśle
określonej tkance, ale w różnych tkankach. Często wyraźnie działają na tę tkankę w której są
wytwarzane, podczas gdy hormony zwierzęce z reguły działają w tkankach innych od tych w
których zostały wytworzone. Fitohormony mają niewielką swoistość działania - dają szeroki zakres
efektów, np. auksyny m. in. pobudzają wydłużanie i podziały komórek, tworzenie tkanek
przewodzących, tworzenie korzeni przybyszowych, wzrost owoców, hamują rozrost kątowych
merystemów, przerywają spoczynek pąków, wpływają na determinację płci kwiatów, kontrolują
starzenie się liści. Z powodu tych różnic między fitohormonami, a hormonami zwierzęcymi, termin
regulatory wzrostu (i rozwoju) uważa się za nieco bardziej poprawny (lecz niezbyt poręczny).
Auksyny i cytokininy są najczęściej wykorzystywanymi do hodowli in vitro fitohormonami. Nieco
rzadziej wykorzystuje się gibereliny, a także kwas abscysynowy. Sporadycznie dodawane są do
pożywki jeszcze inne regulatory wzrostu (tab. 3c).
Auksyny występujące naturalnie w tkankach roślinnych (endogenne) są pochodnymi tryptofanu i
zawierają dwupierścieniowy układ indolu. Ich przykładami są. kwas indolilo-3-octowy (IAA) i
kwas indolilo-3-masłowy (IBA). Powyższe substancje są też łatwo dostępne w handlu i często
dodaje się je do pożywek. Poza indolowymi auksynami w skład pożywek mogą wchodzić także ich
syntetyczne analogi, w których indol zastąpiony jest innym układem pierścieniowym. Uważa się, że
aby wykazywać działanie typowe dla auksyn substancja musi spełniać następujące warunki: a.)
zawiera układ pierścieniowy z co najmniej jednym wiązaniem podwójnym, b.) zawiera łańcuchowy
podstawnik sąsiadujący z wiązaniem podwójnym, c.) zawiera grupę karboksylową oddzieloną od
układu pierścieniowego jednym lub dwoma atomami węgla. Są to zapewne warunki konieczne lecz
nie wystarczające, ponieważ spełniają je również typowe aminokwasy jak tryptofan, fenyloalanina,
tyrozyna, a mimo to nie mają aktywności auksynowej. Typowymi syntetycznymi auksynami są np.
kwas α-naftylooctowy (NAA), kwas 2,4-dichlorofenoksyoctowy, dicamba (dikamba), picloram
(pikloram). Na ogół auksyny syntetyczne mają większą trwałość i wyższą aktywność niż związki
będące dokładnymi odpowiednikami auksyn endogennych. Niektóre auksyny syntetyczne
(zwłaszcza 2,4-D, picloram, dicamba) bywają stosowane jako herbicydy (środki chwastobójcze; w
tym celu używane są jednak w stężeniach kilkadziesiąt tysięcy razy wyższych niż w pożywkach do
kultur in vitro - rzędu kilkudziesięciu gramów/l). Wśród substancji modyfikujących działanie
auksyn wyróżnia się antyauksyny, tj. związki blokujące receptory auksyn, fitotropiny, tj. substancje

blokujące ukierunkowany (polarny, dopodstawowy) transport auksyn, substancje przyspieszające
rozpad auksyn i substancje hamujące ten proces (tab. 3). O tym jak różnorodne efekty
morfologiczno-fizjologiczne mogą wywoływać auksyny wspominaliśmy już wyżej, szczególną
uwagę warto jednak zwrócić na trzy rodzaje reakcji, uważane za najbardziej charakterystyczne dla
auksyn:

1. pobudzanie wydłużania komórek (wzrostu wydłużeniowego)
2. pobudzanie podziałów komórkowych (we współdziałaniu z cytokininami, a czasami także

giberelinami)

3. uaktywnianie niektórych jądrowych genów.

Działaniu auksyn towarzyszy też zakwaszenie środowiska (wypompowanie protonów z komórek).
W niektórych przypadkach samo zakwaszenie środowiska, bez obecności auksyn wywoływało
efekty typowe dla działania auksyn.
Typowymi wynikami działania cytokinin są: pobudzenie podziałów komórkowych oraz
przeciwdziałanie procesowi starzenia się roślinnych organów. Cytokininy mogą także pobudzać
kiełkowanie w ciemności nasion dodatnio fotoblastycznych (tj. wymagających światła do
kiełkowania). W pobudzaniu podziałów komórkowych cytokininy współdziałają z auksynami. Pod
niektórymi innymi względami są przeciwieństwem auksyn - powstają głównie w korzeniach
(auksyny w wierzchołkach pędu), skąd wędrują ksylemem ku górze i pobudzają organogenezę
pędową, pobudzają rozwój merystemów kątowych (hamowany przez auksyny), hamują wydłużanie
się pędów. Również pod względem chemicznym cytokininy stanowią w pewnym stopniu
przeciwieństwo auksyn - o ile, jak już wspominaliśmy, auksyny są kwasami organicznymi, to
naturalne cytokininy są pochodnymi adeniny, a więc azotowej zasady. Przykładami takich
naturalnie występujących w roślinach cytokinin są zeatyna i N

6

-izopentenyloadenina (2-iP, IPA).

Pochodnymi adeniny, ale mającymi charakter wyłącznie cytokinin egzogennych (sztucznie
wprowadzanych) są 6 benzyloaminopuryna (BAP) i kinetyna. Istnieje też grupa substancji o
zupełnie innej budowie chemicznej (pochodnych mocznika), ale bardzo podobnym działaniu
fizjologicznym, stąd nazywa się je związkami cytokininopodobnymi, albo po prostu
mocznikowymi cytokininami. Ich przykładami są tidiazuron (thidiazurone = TDZ) i CPPU. Uwaga!
Należy starannie odróżniać cytokininy (fitohormony, substancje niebiałkowe) od zwierzęcych
białek zwanych cytokinami!
Wszystkie gibereliny natomiast zawierają złożony, czteropierścieniowy szkielet gibanu. Opisano
dotychczas grubo ponad 100 związków tego typu, obejmujących kwas giberelinowy i jego różne
pochodne. W praktyce tylko kilka substancji z tej grupy bywa czasami dodawane do pożywek, a
najczęściej jest to kwas giberelinowy (GA

3

). Typowe wyniki działania giberelin, to pobudzenie

wydłużania pędów (zwłaszcza u karłowatych mutantów), zahamowanie wzrostu korzeni bocznych,
przerwanie spoczynku nasion, pąków i cebul, uaktywnienie enzymów katabolicznych w nasionach,
pobudzenie kiełkowania pyłku i wydłużania łagiewek pyłkowych, wywoływanie partenokarpii
(powstawania owoców z niezapylonych słupków), pobudzenie kwitnienia w warunkach
nieindukcyjnych. Czasami stosuje się też substancje hamujące biosyntezę giberelin, np.
paclobutrazol, ancymidol, które powstrzymując wzrost bulw, cebul, czy zarodków, pozwalają na
zgromadzenie w nich większej ilości materiałów zapasowych, a także ułatwiają aklimatyzację roślin
do niesprzyjających warunków hodowli ex vitro. W tym samym celu mogą być wykorzystywane
retardanty, takie jak CCC (chlorek chlorocholiny i AMO 1618).
Przykłady regulatorów wzrostu i rozwoju, które obecnie (jeszcze?) są dużo rzadziej
wykorzystywane w kulturach in vitro niż auksyny, cytokininy i gibereliny, podaje tabela 3C.
Warto podkreślić, że wynik działania fitohormonów w pożywce zależy od stanu fizjologicznego
umieszczonej na niej tkanki i od występujących w komórkach fitohormonów endogennych.
Regulatory wzrostu pobierane są z pożywki, co prowadzi do przejściowego podwyższenia
wewnątrzkomórkowego stężenia tych substancji. Ten wzrost jest zwykle krótkotrwały ponieważ

istnieją naturalne mechanizmy unieczynniania fitohormonów, częściowo w wyniku rozpadu (np.
wspomnianego już utleniania indolowych auksyn), częściowo zaś w wyniku wbudowywania ich w
konjugaty - mało aktywne fizjologicznie połączenia z innymi substancjami, np. cukrami. Ocenia
się, że zaledwie ok. 1% głównych fitohormonów występuje w komórce w postaci wolnej, większa
ich część natomiast tworzy konjugaty.
W niektórych doświadczeniach stosuje się tzw. pulsowe (tj. bardzo krótkotrwałe) działanie
badanych składników pożywki. W tym celu eksplantat inkubuje się na pożywce zawierającej
badany składnik przez okres zaledwie kilku do kilkudziesięciu godzin, po czym przenosi się na inną
pożywkę. Czasami pulsowe oddziaływanie na rośliny jakiegoś składnika pożywki jest wynikiem nie
szybkiego pasażu, ale niewielkiej trwałości składnika w pożywce lub tkance. Na przykład jeśli
pożywka zawiera witaminę B

2

oraz - w niewielkim stężeniu - IAA, a hodowla prowadzona jest na

świetle, to auksyna będzie działać pulsowo nawet jeśli eksplantat pozostanie na tej pożywce przez
kilka tygodni. Na świetle stosunkowo szybko rozpadają się także niektóre antybiotyki (np.
tarcefoksym, tj. cephotaxim).

Tabela 3A. Charakterystyka fitohormonów. Auksyny

*

Efekty działania

Przykłady

Substancje modyfikujące działanie
fitohormonu (wpływające na
szybkość jego biosyntezy,
transportu, rozkładu, lub blokujące
receptory)

Masa
mol.

Typowy
zakres
stężeń w
pożywce
(mg/l)

Rozpuszczalnik

Zalecany
sposób
odkażania

1. Tworzenie

korzeni
przybyszowych

2. Tworzenie

zarodków
somatycznych

3. Podziały

komórkowe

4. Tworzenie i

wzrost kalusa

5. Hamowanie

wzrostu pąków
kątowych

6. Hamowanie

wzrostu korzeni

IAA
(kwas indolilo-3-
octowy)

175,2

0,01 -
3,0

etanol / 1N
NaOH

A/F

1. Kwas 2,3,4-

trójjodobenzoesowy (TIBA)
i 1-N-naftyloftalamowy
(NPA) działają jako tzw.
fitotropiny, tzn. hamują
polarny transport auksyn

2. Kwas p-

chlorofenoksyizomasłowy
(PCIB) działa jako
antyauksyna blokując
receptor auksyny

3. Związki fenolowe (np. kwas

ferulowy albo floroglucyna)
hamują utlenianie auksyn

4. Ryboflawina silnie sprzyja

fotoutlenianiu IBA i IAA

IBA (kwas indolilo-3-
masłowy)

203,2

0,1 -
10,0

etanol / 1N
NaOH

A/F

NAA (kwas
naftalenooctowy)

186,2

0,1 -
10,0

1 N NaOH

A

PAA (kwas
fenylooctowy)

136,2

0,1 -
50,0

etanol

A/F

2,4-D (kw. 2,4-
dichlorofenoksyoctowy
)

221,0

0,01 -
5,0

etanol /
DMSO / 1N
NaOH

A

CPA (4-CPA, kw. p-
chlorofenoksyoctowy)

186,6 0,1 - 5,0 etanol

A

picloram (kwas 4-
amino-3,5,6-
trichloropikolinowy)

241,5

0,01 -
10,0

DMSO

A

dicamba (kwas 2-
metoksy-3,6-
dichlorobenzoesowy)

221,0

0,01 -
10,0

etanol / woda

F

2,4,5-T (kwas 2,4,5-
trichlorofenoksyoctowy
)

NOA (kwas 2-
naftoksyoctowy)

*

pojęcia najbardziej istotne i godne zapamiętania wyróżniono kolorem

Tabela 3B.Charakterystyka cytokinin i giberelin

C

Efekty działania

Przykłady

Substancje
modyfikujące działanie
fitohormonu
(wpływające na
szybkość jego
biosyntezy, transportu,
rozkładu, lub blokujące
receptory)

Masa
mol.

Typowy
zakres
stężeń w
pożywce
(mg/l)

Rozpuszczalnik

Zalecany
sposób
odkażania

1. powstawanie

pędów
przybyszowych
(wysokie stężenia
cytokinin)

2. hamowanie

tworzenia korzeni

3. podziały

komórkowe

4. powstawanie

kalusa i jego
wzrost

5. rozwój pąków

kątowych

6. hamowanie

wydłużania
pędów

7. hamowanie

starzenia się liści

zeatyna

219,2

0,01 -
5,0

1N NaOH

A/F

Opisano szereg
antycytokinin, na
przykład lovastatynę,
która hamuje biosyntezę
cytokinin, a także ich
rozpad i działanie;
znaczenie tych
substancji i skutki ich
stosowania są jeszcze
słabo poznane

rybozyd zeatyny

351,4

0,01 -
5,0

1 N NaOH

F

2iP (N6-izopentenylo-
adenina)

203,2

1,0 -
30,0

1 N NaOH

A/F

izopentenyloadenozyna 335,4

0,01 -
10,0

woda

F

BAP (6-
benzyloaminopuryna)

225,3 0,1 - 5,0 1 N NaOH

A/F

kinetyna (KIN)

215,2 0,1 - 5,0 1 N NaOH

A/F

TDZ (thidiazurone)

220,2

0,001 -
0,05

DMSO

A/F

CPPU (N-(2-chloro-4-
pyridyl)-
N'fenylomocznik)

247,7

0,001 -
1,0

DMSO

F

2hZ (dihydrozeatyna, DZ), Ad (bezwodna adenina), Adh (adenina
trójwodna), AdS (siarczan adeniny, bezwodny), AdSh (siarczan adeniny
dwuwodny), Ado (adenozyna), mT (meta-topolin)

G

e l

1. wydłużanie

pędów

2. przerywanie

spoczynku
nasion, zrodków
somatycznych,
pąków
wierzchołkowych
i cebul

3. hamowanie

powstawania
korzeni
przybyszowych

kwas giberelinowy
(GA

3

)

346,4

0,01 -
5,0

etanol

A/F

Paclobutrazol,
ancymidol, CCC, 1-
TRIACONTANOL
hamują syntezę giberelin
i wywołują tym samym:

1. zahamowanie

wydłużania
pędów

2. rozwój korzeni,

bulw i cebul

3. aklimatyzację

roślin do
niesprzyjających

giberelina (GA

4

)

332,4

0,01 -
5,0

etanol

F

giberelina (GA

7

)

330,0 0,01 -

5,0

etanol

F

warunków

Tabela 3C. Fitohormony rzadziej stosowane do kultur in vitro

Przykłady

Efekty działania

Substancje modyfikujące działanie fitohormonu
(wpływające na szybkość jego biosyntezy,
transportu, rozkładu, lub blokujące receptory)

etylen

1. starzenie się liści
2. dojrzewanie

owoców

3. hamowanie

tworzenia
organów
przybyszowych (w
stopniu zależnym
od genotypu
rośliny i czasu
działania
regulatora)

1. ACC (kwas 1-aminocyklopropano-1-

karboksylowy) jest prekursorem etylenu
(przekształca się w tkankach w etylen)

2. AVG (aminoetoksyglicyna) hamuje

syntezę etylenu.

3. Jony srebra hamują działanie etylenu.

Zazwyczaj stosuje się je w postaci
tiosiarczanu srebra (STS).

kwas
abscysynowy
(ABA)

1. dojrzewanie

zarodków
somatycznych

2. ułatwianie

aklimatyzacji

3. tworzenie cebul i

bulw

4. wywoływanie

spoczynku nasion
i in. organów

Fluridon i paclobutrazol hamują syntezę ABA;
fluridon działa poprzez blokowanie wczesnego
etapu syntezy karotenoidów, wydaje się jednak,
że nie jest toksyczny

poliaminy:
putrescyna (PUT)
spermina
spermidyna

1. tworzenie

przybyszowych
korzeni

2. tworzenie pędów
3. tworzenie

zarodków
somatycznych

1. DL-α-difluorometyloarginina (DFMA) i

α-difluorometyloornityna (DFMO)
blokują syntezę putrescyny

2. Metyloglioksalo-bis-guanylohydrazon

(MGBG) i cykloheksyloamina blokują
syntezę sperminy i spermidyny

3. 3-aminoguanidyna (AG) blokuje rozpad

putrescyny

brassinosteroidy
ergosterol
brassinolid (BL)
dolichosteron

1. pobudzanie

wydłużania
komórek

2. pobudzanie

histogenezy

3. wspomaganie

adaptacji do stresu

(termicznego)

kwas jasmonowy
(JA) i jego
pochodne

1. powstawanie bulw

i cebul

2. zawiązywanie się

merystemów

metylowy ester (MeJA), kwas
dihydrojasmonowy (HJA), kwas tuberonowy,
glikozyd kwasu tuberonowego (TAG)
kwas kukurbitowy (CA)

kwas salicylowy i
jego acetylowana
pochodna
(aspiryna)

1. zwiększanie

trwałości kwiatów

2. pobudzanie

powstawania
zarodków
somatycznych

Wszystkie wymienione dotąd składniki pożywek są substancjami o ściśle określonym składzie.
Pożywki, które zawierają tylko takie substancje nazywa się syntetycznymi. Czasami wzbogaca się
jednak pożywki niejednorodnymi substancjami, które mają bardzo złożony skład chemiczny, nie w
pełni znany badaczowi i w niewielkim stopniu przez niego kontrolowany. Dodatkami takimi mogą
być: hydrolizat kazeiny, peptony, ekstrakt drożdżowy, mleczko kokosowe, a sporadycznie mleczko
kukurydziane, sok pomidorowy itp. Te mieszaniny są zwykle źródłem aminokwasów, witamin lub
fitohormonów i gdy tylko to możliwe badacze dążą do zastępowania ich związkami chemicznymi w
ściśle określonej postaci i ilości. Hydrolizat kazeiny i ekstrakt drożdżowy mogą pobudzać wzrost
eksplantatów, ale bardzo ułatwiają też rozwój drobnoustrojów, stąd czasami dodawane są do
pożywki po prostu dla sprawdzenia skuteczności odkażania materiału roślinnego użytego do
zapoczątkowania hodowli. Hydrolizat kazeiny wzmacnia działanie cytokinin, zwłaszcza w
obecności IAA.
Czynnikiem żelującym jest najczęściej agar, znacznie rzadziej agaroza, κ-karagen (kappa-karagen;
ang. κ-karrageenan) itp. Agar jest substancją polisacharydową budującą ściany komórkowe
morskich krasnorostów (Gelidium sp. i Gracilaria sp.), i zawierającą dwie frakcje: niepolarny
polimer, zwany agarozą, oraz bardzo zmienną domieszkę polarnych podstawników. Można
stosować typowy agar mikrobiologiczny, ale istnieją też w handlu agary przygotowywane
specjalnie z myślą o kulturach roślinnych. W takim przypadku wytwórca gwarantuje, że jego
produkt nie zawiera żadnych zanieczyszczeń hamujących wzrost roślin. Agary różnych
producentów różnią się stopniem czystości i zdolnością żelowania (wytrzymałością mechaniczną
galaretki otrzymanej z agaru o danym stężeniu). Przy zakładaniu niektórych, szczególnie
wrażliwych hodowli (np. komórek glonu zawłotni) zaleca się przemywanie agaru przed dodaniem
go do pożywki, ale takie środki ostrożności stosuje się bardzo rzadko.
Jakkolwiek agar znalazł bardzo szerokie zastosowanie jako czynnik żelujący, spotyka się też w
handlu jego zamienniki. Należy do nich Phytagel (czyt. fajtadżel), polimer otrzymywany z bakterii,
a zbudowany z reszt glukozy, ramnozy oraz kwasu glukuronowego. Agargel (czyt. agardżel) jest
mieszaniną agaru i Phytagelu. Karagen jest polisacharydem złożonym z podjednostek
galaktozowych. Otrzymywany jest ze ścian komórkowych krasnorostów. Gelrite (czyt. dżelrajt) jest
polimerem otrzymywanym z bakterii Pseudomonas eloda.
Czynniki żelujące są zwykle dobierane jako substancje nieprzyswajalne dla roślin, a więc pełniące
funkcje mechaniczne oraz osmotycznych regulatorów, ale nie wpływające bezpośrednio na

metabolizm roślinnych komórek. Mimo to stężenie czynnika żelującego w pożywce może wywierać
silny wpływ na wynik hodowli. Na przykład w hodowlach cienkich skrawków łodygi tytoniu,
prowadzonych na poż. z 1% agarem, otrzymywano zawiązki kwiatów, a przy niższych stężeniach
agaru - pąki wegetatywne. Czasami w kulturach in vitro dostrzec można zaburzenia związane z
gospodarką wodną tkanek i dostępnością wody w pożywce. Typowym objawem takich zaburzeń
jest nadmierne uwodnienie tkanek i związany z tym przejrzysty, szklisty wygląd (zaburzenia te
nazywa się właśnie szklistością lub witryfikacją). Prawdopodobnie wynikiem nieprawidłowej
gospodarki wodnej roślin jest obserwowane czasami zamieranie wierzchołków pędów.
Rozwiązaniem takich problemów może być zmiana stężenia lub rodzaju środka żelującego, a także
zapewnienie roślinom lepszej wymiany gazowej (np. poprzez zastosowanie odpowiednich
pokrywek naczyń hodowlanych).
W przypadku gdy do pożywki nie dodaje się żadnego czynnika żelującego, a hodowany obiekt
zanurzony jest w płynnej pożywce, konieczne jest stałe napowietrzanie hodowli, w przeciwnym
razie komórki roślinne uległyby zatruciu produktami fermentacji. Najczęściej hodowle na płynnych
pożywkach prowadzone są w kolbach stożkowych, a napowietrzanie pożywki uzyskuje się przez
szybkie poruszanie kolb na specjalnych wstrząsarkach. Jeśli eksplantat użyty do takiej hodowli
stanowi luźne skupisko komórek, np. kalus to wynikiem wstrząsania kultury może być jego
rozpadnięcie się na pojedyncze komórki i drobne skupiska komórek. W ten sposób powstają tzw.
hodowle zawiesinowe.
Dobór pożywki jest w dużej mierze sztuką opartą na metodzie prób i błędów. Ze względu na dużą
liczbę składników pożywki i wynikającą stąd ogromną liczbę możliwych kombinacji ich stężeń, w
większości prac badacze skupiają się na optymalizacji zawartości jednego do kilku składników, dla
pozostałych dobierając wstępnie standardowe, niezmienne stężenia. Ponieważ o kierunku procesów
rozwojowych przebiegających w kulturach in vitro decydują głównie fitohormony i (w mniejszym
stopniu) witaminy, najczęściej optymalizuje się zawartość tych właśnie składników, natomiast
dobór soli mineralnych można zwykle ograniczyć do porównania kilku "klasycznych" zestawów,
np. składniki mineralne MS i B5. Porównując działanie kilku, np. czterech, stężeń wybranej
auksyny i takiej samej liczby stężeń cytokininy (a więc w podanym przykładzie analizując działanie
16 wariantów pożywki) można wstępnie dobrać optymalny zestaw fitohormonów (warto potem
powtórzyć doświadczenie dla innego rodzaju auksyny i cytokininy). Po znalezieniu zadowalającej
kombinacji fitohormonów, można sprawdzić, czy dobrana wstępnie pożywka ma
najodpowiedniejszy potencjał osmotyczny. W tym celu porównuje się hodowle na pożywkach
zawierających zoptymalizowany zestaw fitohormonów i (ewentualnie) witamin, natomiast składniki
mineralne w standardowym stężeniu, albo rozcieńczone 2 do 4-krotnie. Warto w końcu porównać
także działanie kilku stężeń sacharozy (np. 1 - 6%) i ewentualnie innych cukrów.
Bardziej systematyczne podejście do optymalizacji składu pożywki stanowi system DeFossarda.
Badacz ten zaproponował po 3 zestawy składników mineralnych, auksyn, cytokinin i innych
substancji organicznych (zestaw bogaty, średni i ubogi). Każdy z nich łączy się z wszystkimi
możliwymi kombinacjami pozostałych zestawów, uzyskując w ten sposób 3x3x3x3 = 81 pożywek
do przeanalizowania. Po wybraniu najodpowiedniejszej, można rozważyć dalsze próby
optymalizacji jednego do kilku składników uznanych za najważniejsze dla osiągnięcia założonego
celu hodowli.

Ostatnia aktualizacja: 11.01.2008

1.3 Odkażanie