Podłoża bakteriologiczne (pożywki)

i warunki wzrostu

Liczne, niezbyt wymagające mikroorganizmy, jak na przykład niektóre

bakterie z rzędu Pseudomonadales zamieszkujące glebę lub wodę, a także

Escherichia coli, mogą dobrze rosnąć w płynnym podłożu o składzie

podanym .. Wiele mikroorganizmów wymaga czasem jakiegoś

śladowego pierwiastka, witaminy lub innego dodatku. Kiedy podłoże jest

wykonane wyłącznie z określonych związków chemicznych, jest ono

nazywane podłożem syntetycznym lub zdefiniowanym. Dobrze jest

poznać minimalne wymagania odżywcze każdego mikroorganizmu i za-

projektować podłoże minimalne zawierające tylko te komponenty, które

są naprawdę niezbędne do wzrostu. Wymagające gatunki mogą potrzebować

wielu dodatkowych związków. Tak więc np. podłoże minimalne

dla Leuconostoc mesenteroides zawiera 40 składników.

Podłoża złożone. W przypadku wielu bakterii o dużych wymaganiach

odżywczych nie zostały w pełni poznane niezbędne uzupełnienia. Organizmy

te są więc hodowane na podłożach zawierających ekstrakty drożdżowe,

autolizaty drożdżowe, peptony lub ekstrakty mięsne. Dla pewnych

grup mikroorganizmów stosuje się też takie dodatki jak ekstrakt słodowy,

namok siana, sok śliwkowy, sok z marchwi, mleko kokosowe, a dla

koprofilnych grzybów nawet wyciąg z końskiego nawozu. Bardzo często,

także ze względów ekonomicznych, podłoża są przygotowywane nie

z czystych związków chemicznych, lecz z takich złożonych preparatów

jak melasa, syrop kukurydziany, ekstrakty sojowe i pszeniczne, które są

tanimi półproduktami lub odpadami przemysłowymi.

Podłoża stałe. Aby otrzymać podłoże stałe, do płynnej pożywki należy

dodać jakiś czynnik zestalający, który nadaje jej galaretowatą konsystencję.

Żelatyna, która była pierwszym czynnikiem zestalającym, jest obecnie

mało używana, ponieważ ulega upłynnieniu w temperaturze 26-30°C,

a także wiele mikroorganizmów może ją rozkładać. Prawie idealnym

czynnikiem zestalającym jest agar wprowadzony do praktyki bakteriologicznej

przez W. Hessego, jednego ze współpracowników Roberta

Kocha. Jest to silnie rozgałęziony, złożony wielocukier otrzymywany

z glonów. Dodaje się go do wodnych roztworów związków odżywczych

w ilości 15-20 g/litr. Agar ulega upłynnieniu dopiero w temperaturze

100°C, lecz pozostaje płynny do temp. 45°C lub niższej. Bardzo niewiele

bakterii jest zdolnych do jego rozkładania. Jeżeli wymagane jest podłoże

stałe nie zawierające żadnych organicznych składników, wówczas jako

czynnik zestalający stosuje się żel krzemionkowy.

Czysta kultura. Czystą kulturę definiuje się jako potomstwo pojedynczej

komórki (klon).

Podłoża bakteriologiczne

Podłoże (pożywka) to każdy płyn przygotowany do hodowania, przechowywania

lub przenoszenia bakterii. Płyn taki może być zestalony, tworząc podłoże stałe.

Podłoże zwykle zawiera wszystkie niezbędne składniki odżywcze. Przed użyciem

podłoże musi zostać wysterylizowane, to znaczy nie może zawierać żywych organizmów.

Przed omówieniem poszczególnych podłoży pomocne będzie wyjaśnienie

znaczenia kilku terminów często stosowanych w bakteriologii. Najlepiej to

uczynić posługując się opisem prostej czynności laboratoryjnej. Aby wyhodować

taki organizm jak E. coli, bakteriolog stosuje odpowiednie sterylne podłoże

i dodaje do niego małą ilość materiału składającego się, lub zawierającego, żywe

komórki tego gatunku. Ta „mała ilość materiału" nazywana jest inokulum,

a proces dodawanie jej do podłoża — inokulacją lub szczepieniem. Zaszczepione

podłoże jest następnie inkubowane, to jest trzymane przez pewien czas

w odpowiedniej temperaturze, wilgotności itp. Inkubację zwykle przeprowadza

się w termostatowej szafce, zwanej po prostu termostatem. Podczas inkubacji

bakterie rosną i dzielą się tworząc hodowlę. Zatem hodowla to podłoże zawierające

bakterie, które wyrosły (i nadal rosną) na lub wewnątrz tego podłoża.

Podłoże płynne można stosować w probówce (zamkniętej korkiem ze sterylnej

waty lub metalowym kapturkiem) lub w szklanej

butelce z zakrętką. Butelka uniwersalna ) jest cylindryczna, o pojemności

około 25 ml, podczas gdy tzw. bijou ma pojemność 5-7 ml.

Większość podłoży stałych to galaretowate substancje składające się z roztworu

substancji odżywczych „zestalonych" agarem (złożony wielocukier uzyskiwany

z pewnych glonów). Do podłoży zazwyczaj używa się plastykowe szalki

(płytki) Petriego o średnicy wieczka około 9 cm. Podłoże w stanie

ciekłym (rozpuszczonym) rozlewa się do szalek Petriego, w których następnie

krzepnie. (Przewietrzana płytka Petriego ma trzy małe uwypuklenia w równych

odstępach na wewnętrznej krawędzi wieczka, które utrzymują wieczko

zamkniętej płytki nieco nad denkiem, pozwalając na utrzymanie równowagi

między powietrzem/gazami wewnątrz i na zewnątrz płytki.

Rodzaje podłoży (pożywek)

Dla wielu bakterii chemolitoautotroficznych podłożem może być prosty roztwór

soli nieorganicznych (źródłem węgla jest CO2).

Heterotrofom o niezbyt dużych wymaganiach pokarmowych (jak E. coli)

wystarczają powszechnie występujące związki organiczne w najczęściej stosowanych

podłożach. Wiele bakterii nie rośnie w podłożach podstawowych,

dopóki nie zostaną uzupełnione takimi substancjami, jak żółtko jaja, krew

lub surowica. Tego typu podłoża nazywane są wzbogaconymi.

Podłożem selekcyjnym jest takie, które podtrzymuje wzrost pewnych bakterii

w przeciwieństwie do pozostałych. Przykładem jest bulion MacConkeya

w którym sole żółci hamują wzrost bakterii niejelitowych, lecz nie

hamują wzrostu gatunków jelitowych. Podłoże to może być stosowane do izolacji

bakterii jelitowych z mieszaniny bakterii jelitowych i niejelitowych w inokulum.

(W pewnym sensie wszystkie podłoża są selektywne, gdyż nie ma takiego

podłoża, które w równym stopniu podtrzymywałoby wzrost wszystkich rodzajów

bakterii. )

Podłoże wzbogacające pozwala, by pewne gatunki bakterii rosły szybciej niż

inne, albo poprzez sprzyjanie wzrostowi danego gatunku, albo poprzez hamowanie

wzrostu innych. Jeśli zatem inokulum zawiera tylko kilka komórek interesującego

nas gatunku (w dużej populacji organizmów zbędnych), wzrost

w odpowiednim podłożu wzbogacającym może zwiększyć proporcję danego

gatunku (wzbogacić go) w stosunku do pozostałych. Na przykład, bulion z selenianem

hamuje wiele rodzajów bakterii jelitowych (w tym E. coli), lecz nie

hamuje Salmonella typhi, bakterii powodującej dur brzuszny. Przypuśćmy, na

przykład, że chcemy wykryć S. typhi w próbce kału od pacjenta z podejrzeniem

duru. Próbka może zawierać jedynie kilka komórek S. typhi, które trudno wykryć

wśród ogromnych ilości niepatogennych bakterii jelitowych. Jeśli jednak inokulum

próbki zostanie wsiane do bulionu z selenianem, procent komórek S. typhi

wzrośnie do poziomu, w którym będą znacznie łatwiej wykrywane.

Podłoże stałe używane jest, na przykład, by uzyskać kolonie

danego gatunku. Wiele podłoży stałych to po prostu podłoża płynne, które

zostały zestalone przez dodatek czynnika żelującego, takiego jak żelatyna czy

agar. Agar jest najczęściej używanym związkiem żelującym, gdyż zdecydowana

większość bakterii nie rozkłada go, nie topi się w 37°C, w której to temperaturze

inkubuje się wiele rodzajów bakterii. (Żelatyna natomiast w tej temperaturze

staje się płynna, a ponadto rozkładają ją niektóre bakterie. ) Jednym z często stosowanych

podłoży jest agar odżywczy podłoże ogólnego przeznaczenia,

które wykorzystuje się do hodowania wielu typów bakterii. Można również

wzbogacać i czynić selektywnym dodając do niego różne substancje.

Agar z krwią jest podłożem z dodatkiem 5-10% krwi, zestalone agarem.

Wykorzystywane jest do wzrostu bakterii o dużych wymaganiach odżywczych,

jak Bordetella pertussis (powoduje krztusiec), oraz do wykrywania hemolizy ). Agar „czekoladowy" uzyskuje się po podgrzaniu agaru z krwią

w temp. 70-80°C do barwy czekoladowobrązowej. Agar taki lepiej nadaje się do

hodowli niektórych patogenów (np. Neisseria gonorrhoeae) niż zwykły agar z krwią.

Agar MacConkeya jest przykładem podłoża różnicującego, to jest takiego,

na którym różne gatunki bakterii można od siebie odróżnić na podstawie

wyglądu ich kolonii itp. Na podłożu MacConkeya bakterie jelitowe (jak E. coli)

zdolne do wykorzystywania laktozy tworzą czerwone kolonie, gdyż wytwarzają

kwaśne produkty (z laktozy), na które reaguje wskaźnik pH w podłożu. Kolonie

bakterii jelitowych nie wykorzystujących laktozy (np. większość szczepów Salmonella)

są bezbarwne.

Agar MacConkeya z sorbitolem, przypomina agar McConkeya, lecz zamiast

laktozy zawiera sorbitol. Używa się go do wykrywania patogennego szczepu

O157 E. coli (EHEC/VTEC), który nie fermentuje sorbitolu, a zatem na tym

podłożu tworzy bezbarwne kolonie. (Większość szczepów E. coli fermentuje sorbitol

i kolonie są różowe. ) Dodatek cefuksymu (cefalosporyny trzeciej generacji)

oraz telurynu potasu zwiększa częstość izolacji szczepu O157, gdyż zahamowany

jest wzrost innych bakterii nie fermentujących sorbitolu (jak Proteus).

Niektóre podłoża stałe nie zawierają ani agaru, ani żelatyny. Na przykład,

podłoże jajowe Dorseta uzyskuje się przez podgrzanie (i skoagulowanie) homogenizowanych

jaj kurzych w soli fizjologicznej. Podłoże to wykorzystywane jest

do namnażania, a następnie „przechowywania" danego organizmu. Podłoże

Dorseta powszechnie stosuje się do przechowywania Mycobacterium tuberculosis.

Wiele podłoży zawiera substancje (np. pepton, woda wodociągowa), których

dokładny skład jest zwykle nieznany. Czasami zachodzi potrzeba stosowania

podłoża, którego wszystkie składniki, łącznie z tymi, które występują w śladowych

ilościach, są określone ilościowo. Tego typu podłoże zdefiniowane przygotowywane

jest ze znanych ilości czystych substancji, np. soli nieorganicznych,

glukozy, aminokwasów itp. w wodzie destylowanej lub dejonizowanej. Podłoże

zdefiniowane może być użyte do określenia wymagań pokarmowych danego

gatunku bakterii.

Podłoże transportowe stosuje się do przenoszenia (lub tymczasowego

przechowania) danego materiału (np. wymazu), które ma być zbadane pod

kątem obecności konkretnego organizmu(ów). Zadaniem takiego podłoża jest

jedynie utrzymanie drobnoustrojów przy życiu, gdyż ich wzrost bywa przeszkodą

w przetrwaniu z powodu powstających zbędnych produktów. Jedno

z takich podłoży, podłoże transportowe Stuarta (tab. 14. 1) nadaje się dla bakterii

zaliczanych do beztlenowych oraz dla „delikatnych" bakterii, jak Neisseria

gonorrhoeae.

Pożywki wybiórczo-namnażające (selekcyjne)

Są to pożywki, na których rośnie ograniczona ilość bakterii, a wzrost innych jest hamowany. Wykorzystywane są w nich cechy charakterystyczne szukanego szczepu: jeśli na przykład gatunek X rośnie przy wysokim stężeniu jakieś substancji, których dla innych gatunków jest śmiertelny, można zastosować pożywkę z daną substancją. W większości wypadków nie da się ograniczyć wzrostu tylko do jednego szczepu, można jednak znacznie zawęzić zakres.

Pożywki wybiórczo-różnicujące (elekcyjne)

Są to podłoża, na których różnicuje się bakterie ze względu na ich metabolizm. Jeżeli jeden z gatunków wytwarza enzym, którego nie wytwarza inny szczep rosnący na danym podłożu, można je zróżnicować ze względu na obecność (lub brak) katalizowania reakcji przez ten enzym. Jeśli wyników reakcji nie widać gołym okiem, stosowany jest dodatkowo wskaźnik informujący o zajściu przemiany chemicznej. Bardzo często dane podłoże jest równocześnie pożywką wybiórczo-namnażającą.

Pożywki hodowlane, nazywane też podłożami mikrobiologicznymi, są mieszaninami odpowiednio dobranych składników. Służą do hodowli mikroorganizmów w warunkach laboratoryjnych, w naczyniach (czyli hodowlach in vitro - dosłownie w szkle). Stosuje się je do izolacji, różnicowania, namnażania i identyfikacji mikroorganizmów, poznawania ich cech morfologicznych, fizjologii czy budowy chemicznej komórek. Pożywki mikrobiologiczne są również wykorzystywane w procesach biotechnologicznych do otrzymywania biomasy oraz określonych produktów metabolizmu mikroorganizmów. Tak też hodowle na pożywkach stanowią podstawę nieomal każdego zabiegu w bakteriologii i mikologii oraz dziedzinach na nich opartych.

Sterylizacja podłoży

Sterylizacja podłoży ma na celu zabicie zarówno ich form wegetatywnych jak i zarodników lub przetrwalników drobnoustrojów, które przedostały się do pożywki w czasie jej sporządzania.

Sterylizację podłoży przeprowadza się parą wodną pod ciśnieniem (aparat ciśnieniowy, autoklaw), ew. w parze bieżącej w temp.100ºC (aparat Kocha – forma dezynfekcji).

Podłoża bakteriologiczne sterylizuje się najczęściej w temp.121ºC w ciągu 20 min. lub w temp.117ºC w ciągu 30 min. W temp.117ºC sterylizuje się podłoża, które zawierają składniki ulegające zmianom pod wpływem wyższej temperatury jak np. mleko, cukry, żelatynę, preparaty drożdżowe, witaminy. Czas sterylizacji pod ciśnieniem zależy od ilości i wielkości materiały sterylizowanego.

Sterylizację można przeprowadzić w aparacie Kocha (np. w przypadku zepsucia się autoklawu, w stosunku do ulegających rozkładowi składników). Temperatura 100ºC powoduje zabicie form wegetatywnych, nie zabija natomiast przetrwalników. Dlatego sterylizacja w aparacie Kocha prowadzi się przez 3 dni, poprzez ogrzewanie przez 30 min. w odstępach 24-godzinnych. Pierwsze ogrzewanie zabija tylko formy wegetatywne oraz pobudza do rozwoju przetrwalniki, które kiełkują w czasie przerwy, w temperaturze pokojowej w formy wegetatywne, następnie zostają zabite podczas drugiego ogrzewania. Trzecie ogrzewanie zapewnia całkowitą jałowość podłoża. Metoda ta nosi nazwę tyndalizacji lub sterylizacji w parze bieżącej.

Podobną sterylizację stosuje się w inspissatorze (ścinarka, koszarka), służącym do sterylizacji np. pożywek jajowych czy surowicy Loefflera. Zabijanie materiału zakaźnego (próbki materiału, wykorzystane do posiewów podłoża, itp.) należy przeprowadzać w autoklawie stosując wyższą temperaturę lub dłuższy czas zabijania, aby mieć pewność, że sterylizacja była skuteczna lub spalać w spalarni. Należy pamiętać, że im większe jest stężenie drobnoustrojów w hodowlach, tym oporność ich na temperaturę jest wyższa i możliwość przeżycia większa.

Nasycona para wodna powoduje gwałtowną hydrolizę, denaturację i koagulację enzymów oraz struktur komórkowych. Wyjaławianie jest efektem zarówno wysokiej temperatury, jak i aktywności cząsteczek wody. Zwykle stosowane temperatury sięgają 108–134 °C, zaś czas wyjaławiania wynosi 15-30 minut. Aby osiągnąć taką temperaturę pary, podnosi się ciśnienie o wartość od jednej atmosfery w górę. Wzrost ciśnienia o jedną atmosferę powoduje podniesienie temperatury wrzenia wody o około 10 stopni. Autoklawy wyposażone są w przyrządy do pomiaru temperatury i ciśnienia oraz odpowiednie elementy zabezpieczające (zawory).

Wyjaławianie hermetycznie zamkniętych pojemników z roztworami możliwe jest dzięki temu, że doprowadzona do autoklawu nasycona para wodna oddaje im swoje ciepło utajone, ogrzewając je do własnej temperatury. Roztwór w pojemniku paruje, wytwarzając "własną" parę, która jest faktycznym czynnikiem sterylizującym.

Proces sterylizacji parą wodną składa się z następujących etapów:

- czas nagrzewania – ciepło przenika w głąb materiału, jest on różny dla różnych obiektów - różne rodzaje pojemników należy wyjaławiać oddzielnie

czas wyrównania temperatury – para wodna oddaje swoje ciepło utajone materiałowi aż do chwili, gdy temperatury wyrównają się i wymiana ciepła ustąpi

- czas wyjaławiania – właściwa sterylizacja, staramy się utrzymywać temperaturę przez odpowiedni okres, zwykle dla bezpieczeństwa wydłuża się go o połowę

- czas schładzania autoklawu – czas od chwili przerwania ogrzewania do momentu, gdy manometr wskaże, że ciśnienie wewnątrz autoklawu jest równe atmosferycznemu.

Wyjaławianie parą wodną nie może być stosowane do płynów niebędących układami wodnymi oraz do pustych pojemników, gdyż nie ma w nich z czego powstawać para.

Ważne uwagi:

W hermetycznie zamkniętych pojemnikach wytwarza się nadciśnienie, którego wielkość zależy od stopnia wypełnienia - jeśli roztwór zajmuje ponad 90% pojemności, ciśnienie może rozerwać pojemnik. Dlatego, pojemnik nie był wypełniony w więcej niż 85 procentach, zaś każda osoba obsługująca autoklaw musi mieć odpowiednie przeszkolenie.

Drugie istotne zjawisko - płyn w pojemniku stygnie wolniej, niż komora autoklawu, powstaje więc nadciśnienie, które grozi implozją pojemnika. Aby się przed nią ustrzec, nie należy wyjmować

zawartości autoklawu tuż po jego otwarciu. Można też zastosować chłodzenie cieczą, aby temperatury wyrównywały się szybciej.

Nasyconą parą wodną możemy wyjaławiać zarówno roztwory wodne, jak i odzież ochronną, opatrunki, narzędzia. Materiały należy zabezpieczyć przed powtórnym skażeniem.

Każdy cykl sterylizacji musi być na bieżąco monitorowany i nadzorowany, a otrzymane dane dokumentowane (szczególnie w warunkach medycznych, produkcji gotowych wyrobów medycznych, leków itp.). Do kontroli i monitorowania procesu służą wskaźniki chemiczne (taśmy, nalepki, przyklejane na zewnątrz pakietów – osiągnięcie prawidłowych parametrów procesu sterylizacji) oraz wskaźniki biologiczne (kontrola wsadu) – Sporal A (Geobacillus stearothermophilus) Attest (zawiera przetrwalniki + pożywka, inkubacja w podręcznym inkubatorze, zmiana koloru na żółty wskazuje na nieprawidłowy proces sterylizacji)

Sterylizacja przez sączenie

Sterylizację drogą filtracji stosuje się do podłoży, które pod wpływem temperatury zmieniają się czy to pod względem fizycznym czy chemicznym.

Aktualnie stosuje się w bakteriologii:

- filtry azbestowe do aparatu Seitza

- sączki membranowe (wykonane z estrów nitrocelulozy) o średnicy mniejszej niż 0,2 μm.

Inne filtry: porcelanowe świece Chamberlanda, krzemionkowe świece Berkefelda, filtry Scotta ze szkła porowatego.

Zalety filtracji: nie zmienia się pH roztworu, nie rozpadają się jego składniki wrażliwe na temperaturę związki, np. witaminy, hormony, enzymy, surowica), substancje nie ulegają adsorpcji na materiale sączka.

Zestawy do sączenia należy najpierw wyjałowić za pomocą pary wodnej lub suchego gorącego powietrza. Jałowy musi być też pojemnik, do którego zbieramy roztwór, a dozowanie do opakowań jednostkowych musi odbywać się w warunkach aseptycznych.

Metodą sączenia wyjaławia się również powietrze – rolę filtra pełnią arkusze z włókien szklanych (filtry HEPA)

Przygotowanie pożywki

W skład pożywek wchodzi woda destylowana (nie może zawierać domieszek metali) oraz sole w stężeniu zapewniającym izotoniczność środowiska. pH musi być odpowiednie dla wzrostu, ponieważ bakterie są wrażliwe na jego wahania. Najczęściej stosowaną dziś pożywką jest bulion odżywczy, który składa się z peptonu, wodnego wyciągu mięsnego oraz soli kuchennej, umożliwiającej zachowanie izotoniczności podłoża w stosunku do wnętrza komórek bakteryjnych. Niektórym samożywnym (autotroficznym) bakteriom obecność związków organicznych może zaszkodzić. Z tego powodu podłoża przeznaczone do ich hodowli zestala się krzemionką, tworząc dość twardy i elastyczny żel. Po przygotowaniu pożywkę wyjaławia się w wysokiej temperaturze.