Podstawowe metody barwienia bakterii

W mikroskopach można oglądać bakterie żywe lub utrwalone.

Żywe ogląda się:

w ciemnym polu widzenia

w kropli wiszącej

w mikroskopie kontrastowo-fazowym.

Bakterie można zabarwić bez utrwalania, przyżyciowo, ale robi się to bardzo rzadko.

Barwienie umożliwia obejrzenie układu przestrzennego, morfologii i anatomii komórek. Celem barwienia jest

wykazanie bakterii w badanym preparacie.

Metody barwienia bakterii

Barwniki dzielą się na 2 grupy: zasadowe i kwaśne. Ze względu na kwaśne pH składników komórki bakteryjnej,

w bakteriologii maja zastosowanie głównie barwniki zasadowe, takie jak:

fiolet krystaliczny

fiolet metylowy

fuksyna

błękit metylenowy

zieleń metylenowa

zieleń malachitowa

safranina

Z barwników kwaśnych używane są eozyna i fuksyna kwaśna.

Podział metod barwienia

Barwienie dzieli się na:

Negatywne
Pozytywno-negatywne
Pozytywne

o proste
o

złożone

Barwienie negatywne – do kropli żywych bakterii na szkiełku dokłada się kroplę grubo dyspersyjnego barwnika,

jak np. tusz chiński lub nigrozyna. Drugim szkiełkiem o oszlifowanych brzegach wykonuje się rozmaz obu

zmieszanych kropli. Po wysuszeniu na ciemnym tle podłoża widoczne są bezbarwne kształty komórek bakteryjnych.

Barwniki nie wnikają do wnętrza komórki, lecz zabarwiają tło.

Barwienie pozytywno-negatywne – za pomocą tej metody można wykazać obecność otoczek u bakterii. W 1 ml soli

fizjologicznej zawiesza się ok. 10

9

bakterii, dodaje się kroplę fuksyny karbolowej. Zawiesinę ogrzewa się

do 70 stopni przez 1-2 min. Jest to faza pierwsza barwienia – pozytywna.

Następnie krople zawiesiny kładzie się na szkiełko i dodaje się druga kroplę barwnika grubodyspersyjnego.

Szkiełkiem o oszlifowanych brzegach robi się rozmaz. Preparat suszy się w temperaturze pokojowej Jest to

faza negatywna.

W mikroskopie widoczne są czerwono zabarwione komórki na ciemnym tle. Jeśli bakterie maja otoczki, to dookoła

czerwono zabarwionej komórki są dobrze widoczne bezbarwne otoczki na ciemnym tle.

Barwienie pozytywne – w tej metodzie bakterie barwią się i są widoczne na bezbarwnym tle. Po przygotowaniu

preparatu na szkle można go zabarwić metodą prosta lub złożoną.

Barwienie proste – w barwieniu tym można stosować dowolnie wybrany barwnik bakteriologiczny.

Najczęściej używany jest błękit metylenowy wg Lofflera. Na utrwalony preparat nalewa się barwnik

na 10 min. Spłukuje się wodą. Bakterie barwią się na niebiesko. Do barwienia prostego można tez użyć

rozcieńczonej w wodzie fuksyny karbolowej.

Barwienie złożone – najczęściej stosowane są metody:

Grama – fiolet krystaliczny + płyn Lugola + etanol + fuksyna: bakterie Gram+ barwią się na

ciemnofioletowo (kwasy tejchojowe), a Gram- na kolor czerwony.

Ziehla-Neelsena – fuksyna karbolowa + grzanie + kwaśny alkohol + błękit metylenowy: prątki,

przetrwalniki i zarodniki grzybów barwią się na czerwono, reszta preparatu na niebiesko

Neissera – barwnik Neissera I+II + chryzoidyna: widoczne ciałka Ernsta-Babesa (na granatowo –

u maczugowców), komórki na żółto

Giemsy – utrwalony preparat barwi się barwnikiem Giemsy

Pożywki

Pożywkami lub podłożami nazywamy płynne, półpłynne lub stałe mieszaniny różnych związków chemicznych,

w których lub na których rozmnażają się bakterie lub inne drobnoustroje.

Właściwości pożywek

W skład pożywek wchodzi woda, którą należy destylować, aby nie zawierała domieszek metali. Do niektórych

pożywek wyjątkowo stosuje się wodę wodociągową.

Pożywka powinna być:

1. Izotoniczna dla danego gatunku

2. Jałowa – wyjaławia się je przez stosowanie temperatury i przez sączenie. Przeprowadza się tyndalizację,

gotowanie w aparacie Kocha, wyjaławianie w sterylizatorach parowych oraz sączenie przez filtry

Berkfelda lub Seitza.

3. Świeża – przechowuje się je w lodówkach lub zamrażarkach, rzadziej w temperaturze pokojowej.

Najwłaściwsza temperatura to 4 stopnie. Gotowych pożywek nie przechowujemy dłużej niż 5-7dni.

4. W szkle obojętnym – szkło myje się w detergentach, kilkakrotnie płucze się w wodzie destylowanej,

zatyka się korkami z ligniny, pakuje w papier i tak przygotowane wyjaławia się w sterylizatorach

na suche powietrze.

5. Skontrolowana – zawsze po wykonaniu serii danej pożywki trzeba skontrolować jej właściwości

fizjologiczne i biochemiczne. Należy do tego dobrać jeden lub kilka szczepów wzorcowych.

Podział pożywek:

PROSTE – bakterie mniej wybredne:

o

płynne

 bulion zwykły
 woda peptonowa

o

półpłynne – bulion zwykły + agar

 zwykła
 wzbogacona

o

stałe

 agar zwykły
 żelatyna

WZBOGACONE – bakterie bardziej wymagające:

o

płynne

 bulion wzbogacony
 bulion z krwią

o

stałe

 agar wzbogacony
 agar z krwią
 agar cukrowy (Brauna)
 pożywka Mullera-Hintona – do antybiogramów

WYBIÓRCZE – selektywnie wybierane bakterie

o

wybiórczo-namnażające – pożywki, w których niektóre bakterie chorobotwórcze ulegają

namnożeniu, a wzrost innych jest hamowany lub niemożliwy:

 bulion z żółcią (Salmonella)
 pożywka SF wg Leifsona (Salmonella, Shigella)
 pożywka z żółcią i zielenią brylantową (E. coli, Enteriobacteriaceae)

o

wybiórczo-różnicujące – pożywki stałe, na których kolonie poszczególnych drobnoustrojów wykazują

charakterystyczne cechy:

 pożywka Levine’a (Enterobacteriaceae)
 pożywka Chapmana (S. aureus, zwłaszcza z kału) – na pożywce rosną tylko halofity, oporne

na działanie 7,5% NaCl. Gronkowce wykorzystują mannitol, zakwaszają pożywkę i barwią
kolonie na żółto. Gronkowce koagulazoujemne tworzą znacznie mniejsze i niezabarwione
kolonie

 agar SS (Salmonella, Shigella)

RÓŻNICUJĄCE – pozwalają na wykrycie cech fizjologicznych i biochemicznych, jak enzymy, katabolity

i anabolity u izolowanych gatunków bakterii:

o

stałe

 pożywka Krumwieda (różnicowanie Salmonella, Shigella, Escherichia, Klebsiella)
 pożywka Kliglera (różnicowanie Salmonella, Shigella flexneri, Escherichia, Proteus,

wykrywanie H

2

S u innych bakterii)

o

płynne – barwny szereg pożywek do wykrywania pojedynczych cech:

 podłoża do wykrywania zdolności rozkładu cukrów, alkoholi, glikozydów
 pożywka laktozowa z purpurą bromokrezolową (LPB)
 woda peptonowa 10% (wykrywanie indolu)
 pożywka Clarka (testy Metyl Red i Vogesa-Proskauera)
 zmodyfikowana pożywka Christensena (wykrywanie ureazy)
 pożywka Simmonsa (z cytrynianem sodu)
 pożywka żelatynowa (wykrywanie żelatynazy)
 agar półpłynny zwykły lub wzbogacony (badanie ruchliwości)

SPECJALNE – bardzo wymagające gatunki bakterii i mikoplazm

o

do hodowli beztlenowców

 pożywka Tarrozziego-Wrzoska (beztlenowce ogólnie)
 pożywka z tioglikolanem sodowym (Clostridium)
 bulion z farszem mięsnym (Clostridium)

o

do hodowli prątków gruźlicy

 pożywka Loewensteina-Jensena
 pożywki płynne – syntetyczne

o

pożywka Lofflera (C. diphtheriae)

o

pożywka Fletchera (Leptospira)

o

agar czekoladowy (pałeczki krztuśca)

o

podstawowa pożywka do hodowli mikoplazm

o pożywki do hodowli grzybów:

 pożywka Sabourauda

stała

deficytowa
plynna

TRANSPORTOWE – służą do przechowywania i przewozu pobieranych materiałów

Podstawowe czynności przy pobieraniu materiałów do badań
mikrobiologicznych

Podstawowe znaczenie w diagnostyce mikrobiologicznej ma okres choroby, w którym pobiera się materiał.

Procentowo największą wykrywalność (izolację) osiąga się w materiałach pobranych w pierwszych dniach

zachorowania, w ostrej fazie choroby. W chorobach przewlekłych materiały należy pobierać w okresie zaostrzenia

lub pobierać wielokrotnie w krótkich odstępach czasu.

Zależnie od jednostki chorobowej pobiera się:

krew

wymazy z nosa, gardła, spojówek, narządów moczowo-płciowych i ran

ślinę,

płyn mózgowo-rdzeniowy,

kał,

mocz,

ropę, zawartość ropni,

płyn opłucnowy i otrzewnowy

włosy, paznokcie

strupy i zeskrobiny skóry

szpik kostny

Zasady pobierania materiałów

1. Próbki do badań pobiera się przed podaniem antybiotyków

2. Lekarz osobiście pobiera lub nadzoruje pobranie materiału

3. Próbki pobiera się do jałowych pojemników

4. Pojemnik musi być opisany przed pobraniem materiału

5. Miejsca pobrania nie można myć, przecierać, przepłukiwać. Wyjątek stanowią nakłucia, podczas których

skórę w miejscu nakłucia należy zdezynfekować

6. Bezpośrednio po pobraniu materiały wysłać go do pracowni mikrobiologicznej

Interpretacyjny podział materiałów

Zależnie od miejsca pobrania z organizmu, materiały można podzielić na 3 duże grupy:

1. Materiały pobrane z zamkniętych miejsc organizmu – bez kontaktu ze środowiskiem zewnętrznym

jak krew, płyn M-R, ropa z zamkniętych ropni, płyny z jam surowiczych, szpik kostny, żółć podczas operacji

chirurgicznych, mocz pobrany podczas cystoskopii, wycinki tkanek podczas zabiegów.

Jeżeli w preparatach z tych materiałów znajdą się bakterie lub inne drobnoustroje, to są one czynnikami

etiologicznymi obserwowanej choroby.

2. Materiały pobrane z otwartych miejsc organizmu – mających pośredni lub bezpośredni kontakt ze

środowiskiem poza organizmem, jak: plwocina, wymazy z jam nosa, gardła, migdałków, jamy ustnej

i zębodołów, otwartych ropni i przetok, wymazy i zeskrobiny ze zmian skórnych i paznokci, wymazy z ucha

i ze spojówek, mocz pobrany metodą środkowego strumienia, wymazy z narządów moczowo-płciowych, treść

żołądkowa i wymiociny, żółć pobrana przez sondę, kał i wymazy z odbytnicy.

Jeżeli w preparatach z tych materiałów znajda się bakterie lub inne drobnoustroje to trzeba określić, czy są

one odpowiedzialne za istniejące objawy chorobowe, czy też znajdują się jako flora normalna, albo dostały

się do materiały przypadkowo.

3. Materiały pobrane w czasie sekcji zwłok – należy pamiętać, że tylko sekcja wykonana kilka godzin po

zgonie daje możliwość izolowania właściwych bakterii.

Krew – badania serologiczno-immunologiczne

Do odczynów serologicznych (OWD, aglutynacja probówkowa, odczyn neutralizacji, odczyny precypitacyjne,

odczyny immunoenzymatyczne i radioimmunologiczne, ASO i in.), wystarczy pobrać do jałowej probówki 3-4 ml

krwi bez cytrynianu sodowego.

Krew – posiewy

Jeden z najtrudniejszych działów diagnostyki mikrobiologicznej. Należy przygotować odpowiednie podłoża i zestaw

do pobierania krwi oraz wyjałowić jodyną skórę nad żyłą, z której pobiera się krew w odpowiednim okresie choroby.

Stosuje się ścisłą a- i antyseptykę, 3 sterylne igły (wkłucie do żyły, odpowietrzenie pojemnika z podłożem oraz

wkłucie do pojemnika) oraz zabezpiecza się podłoże przed zanieczyszczeniem bezpośrednio po pobraniu.

Posiew krwi od jednego chorego wykonuje się kilkakrotnie, najlepiej na 60 minut przed lub w czasie wystąpienia

szczytu gorączki.

Płyn MR

Do badań pobiera się 4-5 ml płynu. Najczęstsze błędy to niezachowanie pełnej jałowości. Płyn należy przenosić

i przechowywać w temperaturze 30 stopni. Płyn MR zawierający ewentualne meningokoki należy utrzymywać

w temp 26-40 stopni. W niskich temperaturach meningokoki giną.

Mocz

Pobieramy 7-10 ml. Powinno się pobierać przez cewnik, ale wtedy często dochodzi do zakażeń Proteus,

Pseudomonas, Escherichia. Obecnie po umyciu narządu moczowo-płciowego pobiera się środkowy strumień

moczu. Do badania w kierunku obecności prątków gruźlicy pobiera się 500 ml.

Gardło

Pobieramy rano, na czczo i bez mycia zębów

Rękawiczki jednorazowe i maseczka

Pobieramy materiał ze zmian chorobowych pręcikiem zanurzonym w jałowej soli fizjologicznej,

bez dotykania okolicznych tkanek, zwłaszcza języka

W nosie analogicznie – pobieramy z przedsionka nosa, z obu stron. Albo z przewodów nosowych, głębiej.

Plwocina

Pobiera się rano, na czczo, po przepłukaniu jamy ustnej i gardła przegotowaną wodą.

W diagnostyce gruźlicy zbiera się plwocinę przez cały dzień, przez odkrztuszanie.

W przypadku trudności można zastosować leki wykrztuśne albo inhalację prowokacyjną za pomocą

mieszaniny roztworów NaCl i glikolu propylenowego.

Inne informacje

Wszelkie wymazy szybko wysychają, co powoduje obumarcie wrażliwych bakterii. W razie konieczności

przechowywania wymazów należy na dno probówki nalać kilka kropli jałowego izotonicznego NaCl.

Posiew kału w kierunku pałeczek czerwonki wykonuje się przy łóżku chorego.

W skierowaniu oprócz danych szpitala, lekarza, chorego i rodzaju badań należy uwzględnić leki zażywane

przez pacjenta, a także wrażliwość na rzadko stosowane antybiotyki.