Ćwiczenie1,2.
Podstawowe zasady działania układu immunologicznego. Odporność nieswoista.
A/ Ocena układu dopełniacza
Dopełniacz pośredniczy w wielu reakcjach ogólnoustrojowych jak: odczyn zapalny,
fagocytoza, fibrynoliza, wykrzepianie wewnątrznaczyniowe, cytoliza. Prawidłowa funkcja
układu dopełniacza zależy od poszczególnych jego składowych oraz inhibitorów. Ocenę
układu dopełniacza przeprowadza się celem wykrycia wrodzonych niedoborów składników
dopełniacza oraz w diagnostyce chorób, w których dochodzi do jego pobudzenia. Określa się
poziom poszczególnych składników dopełniacza oraz jego aktywność, nie mniej prawidłowy
poziom składowych nie przesądza o ich funkcjonalnej aktywności.
Oznaczanie całkowitego stężenia składowych w surowicy - najczęściej C3, C4, C1
inhibitora, czynnika B, czynnika P (properdyna).
Wykorzystuje się metody serologiczne z wykorzystaniem swoistych przeciwciał:
immunodyfuzja radialna, ELISA, RIA lub metody turbidymetryczne i nefelometryczne.
Studenci oznaczają poziom C3c i C4 metodą immunodyfuzji radialnej (płytki NOR Partigen):
mierzą średnicę i ustalają poziom w g/l wg tablic.
Poziomy
Znaczne obniżenie C3c jest obserwowane w chorobach autoimmunizacyjnych (lupus
erythematosus, glomerulonephritis), niewielki spadek w schorzeniach wątroby (przewlkełe
zapalenie, marskość poalkoholowa), wzrost u chorych w ostrych i przewlekłych zakażeniach.
C4 (wchodzi w skład konwerttazy C5) jest obniżony w lupus erythematosus i wrodzonym
obrzęku naczyniowym.
Wrodzony brak C1inhibitora (reguluje klasyczną drogę aktywacji  hamuje aktywność
proteazy serynowej C1s i C1r) prowadzi do obrzęku naczynioruchowego, nabyty występuje w
zaburzeniach B limfocytów (przewlekłe białaczki, szpiczak mnogi).
Oznaczanie aktywności dopełniacza
*Metoda 50% hemolizy CH50
Określa ona aktywność hemolityczną surowicy i pozwala ocenić całkowity przebieg
klasycznej drogi aktywacji dopełniacza. Ustala się stężenie surowicy, przy którym dochodzi
do lizy 50% wystandaryzowanej zawiesiny erytrocytów barana opłaszczonych swoistymi
przeciwciałami królika (amboceptor). Test ten wykonuje się w probówkach lub w
mikrostudzienkach. Mniej dokładna jest metoda 100% hemolizy  CH100, oparta na tej samej
zasadzie.
Studenci oglądają metodę probówkową CH100. Prawidłowa aktywność 20 j.
*Hemoliza radialna
W płytce z agarem, który zawiera erytrocyty opłaszczone przeciwciałami wycina się
studzienki, do których dodaje się surowicę badaną. Wokół dołków powstają strefy hemolizy,
których średnice są proporcjonalne do ilości dopełniacza. Jeżeli stwierdza się obniżoną
aktywność można określić, którego składnika brakuje. Wykorzystuje się wtedy krwinki
opłaszczone przeciwciałem i tzw. odczynnikiem dopełniaczowym. Jest to surowica świnki
morskiej czy myszy, w której brakuje składowej dopełniacza będącej przedmiotem testu.
Następnie oddajemy surowicę badaną. Jeżeli wystąpi hemoliza, to oznacza, że składowa jest
obecna. Brak hemolizy wskazuje na niedobór tego składnika dopełniacza w badanej surowicy.
B/ Ocena funkcji komórek fagocytujących
Granulocyty, monocyty i makrofagi stanowią pierwszą linię obrony organizmu przed obcymi
antygenami. Biorą udział w odporności nieswoistej a także w wielu mechanizmach swoistej
odpowiedzi immunologicznej. Podstawowe funkcje biologiczne to: zdolność chemotaksji,
fagocytozy (pochłaniania) i wewnątrzkomórkowego zabijania.
Ocena chemotaksji
Zdolność do chemotaksji tj. ukierunkowanego ruchu w odpowiedzi na bodziec
chemotaktyczny (składowe C3a, C5a, C567; produkty mikororganizmów: endotoksyna,
peptydopglikan, kwasy tejchojowe, zymozan; fibrynogen, PAF, LTB4, IL 1, IL 8) można
badać:
*metoda agarozowa. Na płytkę Petriego (podłoże odżywcze z 0,75% agarozą) do
odpowiednio wyciętych studzienek nanosi się zawiesinę badanych komórek, do innych
chemoatraktanty. Po 2,5 godz. inkubacji, w temp. 37o C i w 5% CO2i płytki utrwala się
formaliną. Po zdjęciu agarozy i wybarwieniu przyklejonych do szkła komórek, mierzy się
zasięg (w mm) migracji komórek w kierunku czynnika chemotaktycznego i migrację
spontaniczną do medium kontrolnego i oblicza indeks chemotaktyczny.
*metoda Boydena. Stosuje się specjalne komory z filtrem miliporowym (błona
nitrocelulozowa) o wielkości porów 3  5 um (dla granulocytów) i 8 um (dla makrofagów).
Po inkubacji i zabarwieniu liczy się komórki, które przechodzą przez błonę w kierunku
bodz
ca chemotaktycznego.
Ocena zdolności fagocytarnych
Ważnym etapem fagocytozy jest rozpoznanie cząsteczki fagocytowanej przez receptory
fagocyta: FcR (dla przeciwciała) i CR (dla C3b dopełniacza). Zdolność fagocytarną komórek
żernych najczęściej określa się w stosunku do bakterii (Staphylococcus aureus, pałeczki
Gram-ujemne) lub grzybów (Candida), rzadziej cząstek mineralnych (lateks).
*metoda Wrighta (probówkowa)  do 1 ml pełnej krwi (zawiera opsoniny) pobranej na
cytrynian sodu dodaje się odpowiedniej gęstości zawiesinę bakterii lub grzybów (mogą być
żywe lub zabite). Inkubuje 30 min. w temp. 37o C, odwirowuje, z kożuszka krwinek białych
sporządza rozmaz na szkiełku podstawowym, barwi metodą Giemsy i w mikroskopie
świetlnym oblicza: odsetek komórek fagocytujących (liczy się granulocyty obojętnochłonne,
ale fagocytują też monocyty) oraz indeks fagocytarny tj. średnią liczbę drobnoustrojów
sfagocytowanych przez jeden fagocyt. Wyższe wskaz
niki fagocytarne uzyskuje się stosując
żywe zawiesiny drobnoustrojów. W modyfikacji można zastosować izolowane np. na
Gradisolu fagocyty oraz inkubowane wcześniej z surowicą drobnoustroje.
Studenci oglądają preparaty barwione z fagocytozą gronkowców. Fagocytują przede
wszystkim granulocyty obojętnochłonne (PMN) oraz monocyty.
Wartości u zdrowych dorosłych osób: odsetek fagocytujących PMN  60  80%, indeks
fagocytarny 5-10 gronkowców sfagocytowach przez jeden PMN.
Wartości podwyższone występują w ostrych zakażeniach bakteryjnych, obniżone występują w
niedoborach układu fagocytarnego, w przewlekłych zakażeniach bakteryjnych.
Ocena wewnątrzkomórkowego zabijania (killing)
Do badania stosuje się tylko żywe zawiesiny. Testy pozwalają określić kinetykę zabijania.
*metoda biologiczna  zawiesinę leukocytów inkubuje się z opsonizowanymi bakteriami. Po
np. 15, 30, 60 min. doprowadza się do lizy fagocytów i uwolnione nie zabite bakterie
wysiewa na agar a następnie liczy wyrośnięte kolonie  c.f.u. (colony forming units). Znając
ilość wyjściowej zawiesiny można obliczyć % zabijania. Metoda bardzo pracochłonna.
*z oranżem akrydyny  po inkubacji fagocytów z żywymi bakteriami dodaje się oranżu
akrydyny i w mikroskopie fluorescencyjnym liczy % zabitych (czerwone) i żywych (zielone)
bakterii wewnątrz fagocyta. Metoda pozwala ocenić zdolność pochłaniania i zdolność
zabijania.
*metoda izotopowa  opiera się na wiązaniu znakowanej trytem tymidyny przez bakterie
niepochłonięte przez fagocyty. W teście można oceniać fagocytozę i zabijanie. W liczniku
scyntylacyjnym mierzy się stopień radioaktywności samych bakterii oraz sfagocytowanych i
oblicza indeks fagocytarny oraz indeks zabijania.
Ocena wewnątrzkomórkowego metabolizmu fagocytów
Wewnątrzkomórkowe zabijanie i degradacja pochłoniętych cząstek odbywa się na drodze
zależnej od tlenu, związanej z wybuchem tlenowym komórki żernej (generacja rodników
ponadtlenkowych) i tlenowo niezależnej.
Do oceny służą następujące testy:
* Test NBT  w przebiegu procesów tlenowych wzrasta poziom nukleotydów NADH i
NADPH. Nukleotydy wykazują zdolność redukcji pochłoniętego błękitu nitrotetrazoliowego
(NBT) do formazanu. Przy prawidłowej funkcji metabolicznej w fagocytach odkładaja się w
cytoplazmie nierozpuszczalne ciemnoniebieskie złogi formazanu.
- Test spontaniczny  roztwór NBT dodaje się do heparynizowanej krwi żylnej, 20 min.
inkubuje, wykonuje rozmazy, barwi Giemsą lub safraniną i oblicza w mikroskopie liczbę
komórek NBT (+). Wartości prawidłowe: 0  14% komórek NBT (+). Wartości podwyższone
przemawiają za toczącą się infekcją bakteryjną (pasożyty zewnątrzkomórkowe), wartości
obniżone wymagają wykonanie testu pobudzonego.
- Test pobudzony  do pobudzenia możemy użyć zawiesinę lateksu, bakterii, endotoksynę.
Wartości poniżej 40% mogą wskazywać na defekt metaboliczny lub obecność zakażenia
przebiegającego z uszkodzeniem granulocytów.
Studenci oglądają preparaty i szukają formazano-dodatnich komórek.
* chemiluminescencja  zjawisko chemiluminescencji (Cl) polega na emisji fotonów przez
nietrwałe wzbudzone cząsteczki, np. wolne rodniki tlenowe. Liczbę emitowanych fotonów
można mierzyć przy użyciu chemiluminometru lub licznika scyntylacyjnego i wyraża się jako
liczbę zliczeń przypadających na jednostkę czasu lub w postaci krzywych. Ponieważ
naturalna Cl jest mało wydajna, celem jej wzmocnienia stosuje się tzw. luminofory (luminol,
lucygenina, estry forbolu, opsonizowane bakterie...). Luminol odzwierciedla reakcje zależne
od mieloperoksydazy, lucygenina  poziom aniomu ponadtlenkowego.
Studenci oglądają wykresy chemiluminiscencji makrofagów otrzewnowych. Wykresy są
zależne od odpowiednich proporcji komórek fagocytujących, luminolu,substancji
aktywujących.
Krzywe CL układają się indywidualnie u poszczególnych chorych i nie zawsze korelują z
innymi testami., np. NBT, fagocytarnymi czy killing. Poszczególne testy badają nieco
odmienne mechanizmy. Dla pełnej oceny wydolności układu fagocytarnego powinno się
wykonać kilka testów równolegle a interpretacja powinna być ściśle powiązana z danymi
klinicznymi pacjenta.
Uwaga!!! Brak jest ścisłych norm dla większości testów. Laboratoria winny dysponować
własnymi normami opracowanymi dla poszczególnych grup wiekowych.
ĆWICZENIE 3
Swoista odpowiedz
immunologiczna  komórkowa
Komórki biorące udział w odpowiedzi immunologicznej tzw. komórki immunologicznie
kompetentne najczęściej uzyskuje się z krwi obwodowej, rzadziej z płynów ustrojowych i
tkanek litych (migdałki, węzły). Krew wciąż zasilana jest komórkami pochodzącymi ze
szpiku i stanowi drogę stałej migracji komórek pomiędzy narządami limfatycznymi. Należy
jednak pamiętać, że układ odpornościowy reaguje kompleksowo, posiada szereg
mechanizmów regulujących i miarodajna ocena komórek wymaga zarówno badania składu
ilościowego jak i poszczególnych funkcji.
Wstępnym badaniem komórek układu immunologicznego jest określenie liczby krwinek
białych w 1 mm3 (leukocytoza) i ocena wzoru Schillinga  odsetkowy skład krwinek białych
(limfocyty, monocyty, neutrofile, eozynofile, bazofile, ewentualnie inne)
Metody izolacji komórek
Najczęściej pobiera się krew z żyły łokciowej na antykoagulanty: heparyna (20-50 IU/ml
krwi), 3,8% cytrynian sodu, 4mM wersenian sodu (EDTA), rzadziej na perełki szklane (krew
odwłókniona).
*metoda spontanicznej sedymentacji - najprostsza, wykorzystuje zróżnicowaną szybkość
opadania różnych krwinek, 1  2 godz. 37o C. Opadanie można przyspieszyć dodając roztwór
dekstranu czy 3% żelatyny lub poprzez wirowanie na niewielkich obrotach. Uzyskujemy: w
osadzie krwinki czerwone, w supernatancie (nadsączu) krwinki białe, które można dalej
izolować celem uzyskania czystych populacji, np. limfocytów, granulocytów, eozynofili....
* metoda izolacji w gradientach gęstości  wykorzystuje różnice w wielkości i ciężarze
właściwym poszczególnych komórek. Stosuje się mieszaniny rozdzielające: Ficoll (Percoll) 
Isopaque (Uropolina)  [metoda Boyum,a] , Limfoprep, Gradisol (mieszanina Uropoliny i
dekstranu) o różnej gęstości.
Krew z antykoagulantem nawarstwia się na warstwę gradientu w probówce plastikowej.
Probówkę wiruje w temp. pokojowej, 400xg, 20 min. i zbiera w interfazie komórki. W
wielostopniowym, odpowiednio przyrządzonym gradiencie można izolować różne populacje
komórek, np. limfocyty T i B, granulocyty, eozynofile, monocyty, NK.
Studenci nawarstwiają bardzo delikatnie po 2 ml krwi pobranej na EDTA na Gradisol G (2
probówki), oglądają sedymentację spontaniczną a z drugiej po odwirowaniu i próbują zebrać
krwinki białe z interfazy.
*metoda adherencji  służy do izolacji komórek adherujących do szkła: monocyty,
granulocyty.
Niezależnie od metody izolacji zawsze należy sprawdzić żywotność komórek w mikroskopie
(wykorzystuje się przepuszczalność błony komórkowej po dodaniu np. 0,1% błękitu trypanu 
martwe komórki są niebieskie), czystość frakcji (np. metoda Giemsy) oraz wielkość odzysku
komórek (liczy się komórki w komorze  w stosunku do zawiesiny wyjściowej).
Oznaczanie markerów powierzchniowych
Celem zróżnicowania komórek immunologicznie kompetetnych (rodzaj, odsetek)
izolowanych z krwi obwodowej (najczęściej dotyczy to limfocytów) określa się za pomocą
przeciwciał monoklonalnych obecne na komórkach antygeny różnicowania  CD (cluster of
differentiation). Należy jednak pamiętać, że ekspresja na błonie komórkowej markera nie
zawsze odpowiada funkcji komórki. Dodatkowe markery mogą się ujawniać w czasie
aktywacji komórki, dlatego ostrożnie należy interpretować uzyskane wyniki.
* testy rozetkowe  mają już dzisiaj znaczenie historyczne. Różnicowały limfocyty T, które
charakteryzują się zdolnością tworzenia rozetek z erytrocytami barana  test E (wiązanie
poprzez CD2) oraz limfocyty B  test EA (erytrocyty opłaszczone przeciwciałem wiązały się
poprzez receptor Fc na limfocycie B) oraz test EAC (erytrocyty opłaszczone przeciwciałem i
dopełniaczem wiązały się poprzez receptor C3). U dorosłej osoby wartości testu E: 60  75%,
testów EA i EAC: 20  25%.
Studenci oglądają test E przygotowany wcześniej w mikroskopie oraz na zdjęciach.
* metody immunofluorescencyjne  pozwalają określić antygeny powierzchniowe (molekuły
o różnym ciężarze cząsteczkowym) żywych komórek ocenia się metodą IF bezpośredniej
wykorzystując swoiste przeciwciała monoklonalne mysie lub IF pośredniej (dodatkowo
dodaje się surowicę antyglobulinową mysią), np.
- anty-CD3  wykrywa limfocyty T CD3(+), tj. receptor odpowiedzialny za
przekazywanie sygnału antygenowego do limfocytów T,
- anty-CD4  wykrywa limfocyty Th CD4(+)  receptor dla MHC kl.II i HIV
- anty-CD8  wykrywa limfocyty Tc/Ts CD8(+)  oraz niektórych NK
- anty-CD19  wykrywa limfocyty B i pre-B, receptor odpowiedzialny za aktywację i
proliferację B
Normy w krwi obwodowej:
T CD3 70 - 75%
T CD4 50 - 55%
T CD8 20 - 25%
B CD19 20 - 25%
Wskaz
nik CD4/CD8 1,7  2,0
Studenci oglądają prospekty z przeciwciałami monoklonalnymi mysimi oraz wykrywanie
subpopulacji limfocytów metodą IF pośredniej. Świecenie, w zależności od stosunków
biochemicznych w komórce może być regularne pierścieniowe (równomierne rozmieszczenie
antygenu, duże stężenie przeciwciał), kropkowe (duże rozcieńczenie przeciwciał, najczęściej
występuje) lub obraz czapeczki (capping  antygeny zgrupowane na biegunie komórki).
Ocena funkcji limfocytów
Rozwój odpowiedzi immunologicznej związany jest z proliferacją określonej subpopulacji
limfocytów, które normalnie znajdują się w stanie spoczynku. Dochodzi do przeniesienia
sygnału prze błonę cytoplazmatyczną i aktywacji wewnątrzkomórkowych przemian
enzymatycznych. Morfologicznie małe limfocyty przekształcają się w duże komórki
blastyczne (duże jądro o luz
nej chromatynie, widoczne jąderka, podziały mitotyczne,
chromosomy, rzadsza cytoplazma..). Pobudzone limfocyty syntetyzują i uwalniają do
środowiska różne cytokiny.
*test transformacji blastycznej  ocenia zdolność limfocytów do proliferacji. Limfocyty
stymuluje się swoistymi antygenami, np. oczyszczona tuberkulina - PPD, anatoksyna
tężcowa, drożdżaki, gronkowce... (w przypadku pierwotnej stymulacji transformuje kilka %
limfocytów, przy wtórnej  ok. 15%) lub tzw. nieswoistymi mitogenami, które mogą być
pochodzenia roślinnego (lektyny) lub bakteryjnego, np. fitohemaglutynina (PHA  stymuluje
limfocyty T i B), konkanawalina A (ConA  limfocyty T), mitogen szkarłatki  PWM
(limfocyt B), lipopolisacharyd (LPS  limfocyty B), białko A gronkowca (limfocyty B). Pod
wpływem mitogenów transformuje 70  90% komórek. Stosuje się:
* metoda morfologiczna  odsetek komórek blastycznych ocenia się w mikroskopie
świetlnym, w preparacie wykonanym z osadu 3-5 dniowej hodowli izolowanych limfocytów
z mitogenem lub antygenem.
Studenci oglądają preparaty z tranformacji blastycznej limfocytów pod wpływem PHA
barwione metodą May-Grunwalda-Giemsy , zwracając uwagę na odsetek i wygląd
transformowanych komórek.
* metoda izotopowa  proliferację ocenia się przez pomiar włączania tymidyny znakowanej
trytem do DNA jąder dzielących się intensywnie komórek blastycznych po stymulacji
mitogenem czy antygenem. Określa się indeks stymulacyjny w stosunku do kontroli (hodowla
limfocytów bez stymulacji).
* test mieszanej hodowli limfocytów  limfocyty pochodzące od różnych genetycznie
dawców, hodowane razem, ulegają proliferacji ze względu na różnice w składzie antygenów
zgodności tkankowej. Im większa zgodność, tym mniejsza proliferacja. (przy przeszczepie
szpiku).
* test hamowania migracji leukocytów  MIF - ocenia on zdolność limfocytów do produkcji
pod wpływem mitogenu lub antygenu cytokin (głównie IFN- ), które hamują migrację
komórek fagocytujących (makrofagi, granulocyty). Określa się wskaz
nik zahamowania
migracji w stosunku do kontroli.
Proliferacja oraz zahamowanie migracji może być upośledzone w niedoborach pierwotnych i
wtórnych, oparzeniach, chorobach autoimmunizacyjnych, immunosupresji, zakażeniach HIV.
Laboratoria powinny mieć swoje normy.
* pomiar stężenia cytokin  stosuje się komercyjne testy ELISA, zawierające swoiste
przeciwciała monoklonalne przeciwko danej cytokinie, np. Il-2, IFN- (charakterystyczne dla
odpowiedzi komórkowej), Il-4, Il-6 (charakterystyczne dla odpowiedzi humoralnej), TNF-
(pobudzenie makrofagów). W chorobach o podłożu autoimmunologicznym czy alergicznym
dochodzi do zaburzonego uwalniania cytokin. Brak jest jednak uniwersalnego zakresu norm
dla poszczególnych cytokin i badania są wykonywane głównie w celach naukowych.
Studenci oglądają prospekty do oznaczania cytokin oraz oznaczanie cytokin metodą ELISA i
ocenę stężenia w komputerze.
* testy cytotoksyczne  wykorzystywane są do oceny bezpośredniej cytotoksyczności
limfocytów T i NK oraz w mechaniz
mie ADCC (komórki cytotoksyczne musza posiadać
receptor Fc). Komórki efektorowe inkubuje się z  celem (inne limfocyty, komórki
nowotworowe, przeszczepu, zakażone wirusem, komórki opłaszczone przeciwciałem 
mechanizm ADCC). Po kilkugodzinnej inkubacji (ok. 4 godz. dla limfocytów, 18-48 godz.
dla makrofagów) dodaje się barwnika, np. eozyny czy błękitu trypanu, który wnika do
martwych komórek  liczy się odsetek martwych komórek pod mikroskopem. Ocenę
martwych komórek można ocenić stosując chrom 51 i mierząc radioaktywność.
Studenci oglądają testy limfocytotoksyczne w układzie: komórki Tc zabijające komórki
białaczki limfatycznej L-1210 (na płytkach Terasaki).
Cytometria przepływowa  wykorzystuje się aparat o nazwie FACS (aktywowany
fluorescencyjnie sorter komórek  fluorescence-activated cell sorter). Stosując laser argonowy
o długości fali 488 nm jako z
ródło światła oraz detektor rozpraszania światła i detektor
fluorescencji, analizuje się i rozdziela przepływające komórki. Poszczególne komórki
wykazują zróżnicowaną autofluorescencję i rozproszenie światła. W zależności od
stosowanych przeciwciał monoklonalnych znakowanych fluorochromami oraz typu analizy
(mogą być wieloparametrowe) można badać zaburzenia ilościowe i jakościowe w
subpopulacjach, obecność i gęstość pojedynczych epitopów na komórce, współzależności,
monitorować leczenie a także przeprowadzać badania czynnościowe komórek układu
odpornościowego (odpowiedz
proliferacyjną pod wpływem mitogenów, stan aktywacji
limfocytów poprzez określanie ekspresji antygenów charakterystycznych tylko dla
pobudzonych komórek, np. receptora dla Il-2 (CD25), zdolność produkcji i uwalniania
cytokin, cytotoksyczność T i NK, apoptozę, fagocytozę i wybuch tlenowy granulocytów).
Badanie można przeprowadzić z krwi, szpiku, węzłów chłonnych, guzów nowotworowych,
płynów ustrojowych itp. Cytometria najczęściej jest wykorzystywana do diagnostyki i
monitorowania chorób limfoproliferacyjnych, a także w diagnostyce pierwotnych niedoborów
immunologicznych, chorób autoimmunizacyjnych, chorych HIV(+), w transplantologii,
Koszty badania są jednak bardzo wysokie, wymuszają jednakowe zasady pracy i
standaryzację stosowanych metod celem ustalenia norm w zależności od wieku, płci.
ĆWICZENIE 4
Swoista odpowiedz
immunologiczna  humoralna
Odpowiedz
humoralna wiąże się z aktywacją i klonalną proliferacją limfocytów a następnie
produkcją swoistych przeciwciał przez komórki plazmatyczne. W ocenie odpowiedzi
humoralnej bada się więc poziom limfocytów B (na podstawie markerów powierzchniowych)
i ich zdolność do proliferacji (pod wpływem mitogenów), stężenie immunoglobulin i ich
podklas a także oznacza poziomy swoistych przeciwciał dla różnych antygenów. Do oceny
poziomu immunoglobulin oraz poziomów swoistych przeciwciał wykorzystuje się różne
odczyny serologiczne (przebiegające in vitro) oparte na reakcji antygen-przeciwciało.
(Generalnie reakcje antygen-przeciwciało są szeroko wykorzystywane w diagnostyce
klinicznej i służą do identyfikacji oraz oznaczeń ilościowych zarówno antygenów jak i
przeciwciał. W zależności od stanu fizycznego antygenu (komórka bakteryjna, krwinka,
fragmenty komórki, białko, polisacharyd...) i charakteru interakcji wyróżnia się dwie
zasadnicze grupy metod: oparte na aglutynacji i precypitacji. Poszczególne metody mają
różną czułość i swoistość.
Reakcje antygen-przeciwciało, które zachodzą in vivo lub można badać tylko w organizmie
żywym (żywa komórka)to: opsonizacja, neutralizacja toksyny, neutralizacja virusa.
Metody oparte o zjawisko aglutynacji
Przeciwciała łączą się z nierozpuszczalnym antygenem/antygenami znajdującymi się na
powierzchni cząstki stałej (komórka bakteryjna, krwinka, cząstki lateksu), prowadzą do
zlepiania się tych cząstek i powstawania widocznych gołym okiem tzw. aglutynatów.
Mówimy o aglutynacji bakteryjnej, lateksowej, hemaglutynacji. Odmiany testów:
* aglutynacja szkiełkowa  test jakościowy, najczęściej służy do wykrywania nieznanych
antygenów przy pomocy znanych przeciwciał swoistych. Stosowany jest rutynowo w
identyfikacji szczepów, tzw. typowaniu serologicznym, np. Salmonella, Shigella, E. coli.
Pozwala określić gatunek lub serotyp. Wykonanie: na szkiełko podstawowe daje się kroplę
surowicy zawierającej swoiste przeciwciała, następnie rozprowadza ezą identyfikowany
szczep bakterii. W ciągu 1  2 min. powstaje aglutynacja. Obowiązkowo należy zrobić
kontrolę szczepu w fizjologicznym roztworze NaCl  nie powinna powstać aglutynacja
(szczep gładki), jeżeli powstaje  jest to szczep szorstki, z którym nie można wykonać
aglutynacji, bo daje tzw. pseudoaglutynację. W przypadku użycia krwinek (oznaczanie grup
krwi) mówimy o hemaglutynacji.
Studenci wykonują aglutynację szkiełkową  typują enteropatogenne szczepy E. coli oraz
krwinki barana
*aglutynacja probówkowa  służy najczęściej do wykrycia i ustalenia miana przeciwciał w
surowicy przy pomocy znanych antygenów. Wykonuje się kolejne rozcieńczenia surowicy w
fizjologicznym roztworze NaCl, np. 1:10, 1:20, 1:40, 1:80....(rozcieńczenia ustala się w
zależności od spodziewanego miana). Następnie do probówek dodaje się stałą zawiesinę
antygenu, inkubuje 18 godz. w temp. 37o C i odczytuje w aglutynoskopie. Miano przeciwciał
jest to najwyższe rozcieńczenie surowicy, w której stwierdza się jeszcze aglutynację.
Klasycznym przykładem wykorzystania aglutynacji probówkowej jest odczyn Widala,
stosowany w diagnostyce duru brzusznego i paradurów. Wykrywamy przeciwciała przeciwko
antygenom somatycznym O (aglutynacja grudkowa) i antygenom rzęskowym H (aglutynacja
obłoczkowa). Inne odczyny: Wrighta  w diagnostyce brucelozy, Wiel-Felixa  w
diagnostyce duru plamistego.
Studenci oceniają aglutynację probówkową, grudkową i rzęskową S. typhi oraz miano
przeciwciał (odczyn Widala)
*aglutynacja pośrednia  polega na reakcji przeciwciał z antygenem opłaszczonym na
nośniku, którym może być lateks. W przypadku opłaszczenia lateksu przeciwciałami
możemy wykryć antygen  na tej zasadzie oparte są testy lateksowe, służące do różnicowania
paciorkowców hemolizujących (Strepto-kit).
*hemaglutynacja bierna  odczyn wykonuje się na płytkach z zagłębieniami, do których
najpierw daje się rozcieńczenia surowicy a następnie krwinki opłaszczone antygenem. Po 2
godz. inkubacji w temp. pokojowej występuje hemaglutynacja i można określić miano.
Odmianą tego odczynu jest zahamowanie hemaglutynacji biernej, kiedy wstępnie materiał
inkubuje się z surowicą wzorcową zawierającą przeciwciała a następnie dodaje krwinek
opłaszczonych homologicznym antygenem. Metody te są stosowane do wykrywania
antygenów wirusowych, hormonów.
*odczyn Coombsa  służy do wykrycia tzw. przeciwciał niekompletnych (zwykle IgG), które
są zbyt krótkie i nie mogą przyłączyć antygenów na różnych komórkach i wytworzyć
widocznej sieci, opłaszczają tylko pojedyncze komórki. Aby uwidocznić reakcję dodaje się
surowicy antyglobulinowej, zawierającej przeciwciała przeciwko białkom
immunoglobulinowym (stanowią antygen), które doprowadzają do aglutynacji. Odczynem
tym (pośredni) wykrywa się przeciwciała anty-RhD w surowicy matki w przypadku konfliktu
serologicznego. Natomiast u dziecka wykonuje się tzw. bezpośredni odczyn Coombsa 
dodaje się surowicy antyglobulinowej do krwinek dziecka, ponieważ są one już opłaszczone
przeciwciałami. W niektórych chorobach, np. w brucelozie powstają przeciwciała
niekompletne, które można wykryć pośrednim odczynem Coombsa.
Metody oparte o zjawisko precypitacji
Metody te oparte są o zasadę, że tzw. antygeny rozpuszczalne (białka, polisacharydy,
glikoproteiny..) łączą się z wolnym przeciwciałem i tworzą agregaty/strąt/precypitat. W
zależności stężenia antygenu i przeciwciał powstają większe lub mniejsze kompleksy
antygen-przeciwciało. Wpływa to na intensywność reakcji  największe kompleksy powstają
w tzw. strefie równowagi. Ma to istotne znaczenie również w organizmie, kiedy dochodzić
może do odkładania się kompleksów w tkankach i niekorzystnych reakcji zapalnych.
*precypitacja pierścieniowa  wyłącznie jakościowy odczyn, na surowicę zawierającą
przeciwciała nawarstwia się delikatnie antygen lub odwrotnie. W miejscu zetknięcia się i
równowagi (strefa ekwiwalencji) powstaje pierścień precypitacyjny.
Studenci wykonują delikatnie precypitację pierścieniową, wykrywają w roztworze obecność
np. toksyny jadu kiełbasianego
*podwójna dyfuzja (immunodyfuzja) w żelu - metoda Outcherlony,ego, jakościowa. W
agarze wycina się studzienki, do których odpowiednio nanosi się roztwór antygenu i
przeciwciał, które dyfundują w agarze. Po inkubacji powstają łuki precypitacyjne.
Studenci oglądają wykrywanie przeciwciał dla kwasów tejchojowych(antygen) w badanych
próbkach surowicy
*immunodyfuzja radialna Mancini,ego można oznaczyć niewielkie ilości antygenu. Używa
się płytek, pokrytych agarem zmieszanym z przeciwciałami. Do wyciętych studzienek dodaje
się surowicę/płyn w którym szuka się antygenu. Kompleksy antygen przeciwciało tworzą w
zależności od ilości antygenu, różnej średnicy pierścienie precypitacyjne. Stężenie antygenu
obliczamy z krzywej standardowej dla antygenów wzorcowych. Tą metodą oznacza się
stężenia immunoglobulin ludzkich, składników dopełniacza, inne białka.
Studenci oceniają poziom immunoglobulin w surowicy
*immunoelektroforeza  jest połączeniem elektroforezy i immunodyfuzji. Służy do oceny
białek surowicy. Mieszaninę białek, np. surowicy krwi rozdziela się w elektroforezie,
następnie dodaje surowicy odpornościowej. Przeciwciała dyfundują w żelu i tworzą łuki
precypitacyjne o odpowiednim kształcie i grubości. Brak niektórych linii świadczy o
niedoborze, linie pogrubiałe o nadprodukcji, np. w szpiczaku. Przy zastosowaniu
wybiórczych przeciwciał można oznaczać obecność pojedynczych białek.
Studenci oglądają immunoelektroforezę białek surowicy krwi
* immunoelektroforeza rakietkowa  elektroforezę antygenu prowadzi się w żelu
zawierającym stałe stężenie przeciwciała. Kompleksy antygen-przeciwciało tworzą w strefie
ekwiwalencji linie precypitacyjne przypominające kształtem rakietki. Wysokość rakietki jest
wprost proporcjonalna do stężenia antygenu.
Studenci oglądają wykrywanie białek układu krzepnięcia metodą imm. rakietkowej.
Złożone techniki serologiczne
Do oceny reakcji antygen przeciwciało wymagane są dodatkowe czynniki-znaczniki
immunodetekcji, systemy wykrywające czy specjalistyczna aparatura.
*odczyn lizy  wykorzystuje zdolność wiązania dopełniacza przez kompleks antygen-
przeciwciało i doprowadzenie do lizy (uszkodzenia) antygenu.
Studenci wykonują odczyn lityczny: do dwóch probówek dają: 2 krople 5% krwinek barana
lub krwinek ludzkich, dodają 4 krople surowicy z przeciwciałami,(tworzy się aglutynacja),
następnie dodają 6 kropli dopełniacza i inkubują w temp.ciała (ktoś trzyma w ręku). Liza
występuje w układzie homologicznym.
*odczyn wiązania dopełniacza (OWD)- wykorzystuje się zdolność dopełniacza do lizy
kompleksu: krwinka czerwona + swoiste przeciwciało. Odczyn jest dwustopniowy i zawiera
układ testujący: surowica badana pozbawiona własnego dopełniacza (podgrzana wcześniej do
temp. 56o C) + antygen + dopełniacz, inkubacja, następnie dodaje się system wykrywający:
krwinki czerwone owcy + przeciwciała swoiste (amboceptor króliczy). Brak hemolizy
świadczy o obecności poszukiwanych przeciwciał  odczyn dodatni, obecność hemolizy 
odczyn ujemny. Prawidłowe wykonanie odczynu wymaga odpowiednich kontroli i
precyzyjnej standaryzacji. Do niedawna był stosowany w diagnostyce kiły jako tzw. odczyn
Wassermana (jakosciowy) lub Kolmera (ilościowy)
Studenci ogladają schemat wykonania odczynu Wassermana.
*odczyny immunofluorescencyjne  wykorzystuje się znaczniki fluorescencyjne (np.
izotiocjanian fluoresceiny) widoczne w mikroskopie fluorescencyjnym. Można znakować
antygen lub przeciwciało  odczyn bezpośredni lub do kompleksu antygen-przeciwciało
dodawać znakowanej surowicy antyglobulinowej  odczyn pośredni. Odczyny bezpośrednie
częściej stosuje się szeroko do wykrycia antygenów bakteryjnych (Chlamydia trachomatis,
Chlamydia pneumoniae, Legionella pneumophila, Mycoplasma pneumoniae..) i wirusowych
(wirus wścieklizny, grypy, paragrypy...) w komórkach zakażonych i tkankach. Odczyny
pośrednie stosuje się do wykrycia przeciwciał swoistych w kile a także do wykrycia
przeciwciał przeciwjądrowych.
*odczyny immunoenzymatyczne ELISA (enzyme linked immuno-sorbent assay) antygeny
lub przeciwciała opłaszcza się (adsorbuje) na fazie stałej (płytka polipropylenowa,
polistyrenowa, kuleczki). Jako znacznika dodaje się enzymu związanego z przeciwciałem
(peroksydaza chrzanowa, fosfataza zasadowa). Następnie dodaje się substratu dla enzymu,
dającego w reakcji z enzymem barwny produkt (badanie jakościowe). Zmianę zabarwienia
można mierzyć ilościowo w specjalnym czytniku  należy wtedy każdorazowo ustalić
graniczną wartość dodatnią   cut-off-value . Metoda ta jest bardzo prosta technicznie
posiada wysoką czułość i swoistość. Stosowana jest bardzo szeroko w diagnostyce
wirusologicznej, do wykrywania autoprzeciwciał, różnych białek, hormonów itp. Powstało
wiele modyfikacji metody ELISA
Studenci oglądają wykrywanie antygenu HbsAg metodą ELISA
*odczyny RIA (radioimmunoassay)  do wykrycia reakcji antygen-przeciwciało wykorzystuje
się znaczniki radioizotopowe, np.jod 125 czy jod 131 i mierzy radioaktywność powstałego
kompleksu lub supernatantu powstałego po oddzieleniu utworzonego kompleksu.
*techniki immunoblotting (Western-blotting)  b. czułe, pozwalają wykryć antygeny lub
przeciwciała poniżej 0,01 ug/ml. Składa się z 3 etapów: elektroforezy białek na żelu,
elektrotransferu rozdzielonych białek na nitrocelulozę, wykrycia białek na nitrocelulozie z
zastosowaniem surowicy mającej przeciwciała oraz surowicy antyglobulinowej znakowanej
enzymem (np. peroksydaza chrzanowa). Po dodaniu substratu dla enzymu powstaje produkt
barwny widoczny jako prążek. Jest to często metoda weryfikująca, np. test potwierdzający dla
metody ELISA przy wykrywaniu przeciwciał anty-HIV czy przeciwciał anty-H. pylori.
Studenci oglądają oznaczanie przeciwciał anty-Helicobacter pylori.
ĆWICZENIE 6
Reakcje nadwrażliwości,
Reakcje nadwrażliwości typu I (anafilaksja) powstają w wyniku powtórnego podania
antygenu/alergenu i krzyżowego(sieciowego) wiązania się z przeciwciałami IgE
opłaszczonymi na komórce tucznej lub bazofilu a następnie uwolnieniu aktywnych
mediatorów. W zależności od drogi wniknięcia alergenu może być wstrząs anafilaktyczny,
astma atopowa, katar sienny, alergie pokarmowe (atopowe zapalenie skóry). Rozpoznanie
alergii atopowej (uwarunkowanej genetycznie) opiera się głównie na wywiadzie i badaniu
klinicznym oraz testach skórnych. W praktyce dodatkowo mierzy się in vitro poziom
całkowitego IgE, poziom swoistych przeciwciał IgE oraz wykonuje się testy świadczące o
aktywacji komórek.
* oznaczanie całkowitego IgE  stężenie IgE w surowicy osób zdrowych jest bardzo niskie,
poniżej 0,005% wszystkich Ig. Do oznaczania wykorzystuje się testy radioizotopowe RIST
(radioimmunosorbent test - kompetencyjny), PRIST (paper immunosorbent test 
kanapkowy), testy ELISA wykorzystujące znaczniki immunofluorescencyjne lub
chemiluminescencyjne. Normy dla ludzi zdrowych wynoszą 40  70 IU/ml. Podwyższenie
całkowitego IgE obserwuje się szczególnie w atopowym zapaleniu skóry i alergii
wieloważnej, ale także w innych stanach patologicznych. 30% chorych na astmę i 60% na
alergiczny nieżyt nosa a także uczuleni na pojedynczy alergen, penicylinę czy jady owadów
błonkoskrzydłych mogą mieć stężenia prawidłowe.
*oznaczanie swoistego IgE  wykorzystuje się czułe techniki radiodetekcji  RAST
(radioimmunosorbent test) i CAO-RIA lub enzymatyczne ze znacznikiem fluorescencyjnym
FAST czy luminescencyjnym MAST-CLA. Często stosowane są panele do oznaczania
przeciwciał dla najczęstszych alergenów wziewnych czy pokarmowych. Pewnym
uproszczeniem są testy paskowe, oparte o zasadę immunoenzymatyczną (Visagnost, Allergo-
Dip). Jednak niewykrycie swoistych IgE w surowicy chorego, mimo ewidentnych objawów
klinicznych nie przesądza o ich braku w narządzie wstrząsowym (mogą być zwiaząne z
komórkami, mogą tworzyć kompleksy). Podstawową metodą badania swoistych IgE są testy
skórne.
*testy skórne  alergen może być podawany śródskórnie, naskórnie lub metodą prick.
Równocześnie można badać reakcje na wiele alergenów. Co najmniej 24 godziny przed
wykonaniem testu nie należy podawać leków przeciwhistaminowych. W zależności od
charakteru odczynu i czasu odczytu można określić typ nadwrażliwości lub jej brak.
- odczyn wczesny powstaje w ciągu sekund lub minut (należy odczytać po 10 - 15 min.) i
charakteryzuje się wystąpieniem obrzęku, zaczerwienienia i tzw. bąbla pokrzywkowego, co
spowodowane jest miejscowym uwolnieniem mediatorów zapalenia gł. histaminy, po 30 - 40
min. zanika. Mogą być wyniki fałszywie dodatnie jak i fałszywie ujemne. Celem kontroli
można wykonać test z histaminy w rozcieńczeniu 1:10000. Odczyn dodatni  bąbel powinien
być większy niż 5 mm średnicy
- odczyn opóz
niony powstaje po 6 - 8 godz. i świadczy o tworzeniu się kompleksów antygen-
przeciwciało (gł. IgG) i odkładaniu się ich w ścianie naczyń. Obserwuje się zaczerwienienie i
obrzęk, nie ma bąbla.
- odczyn póz
ny powstaje po 24  72 godz. i jest przykładem nadwrażliwości typu póz
nego
(komórkowej). Początkowo powstaje zaczerwienienie i naciek neutrofili a następnie komórek
jednojądrzastych (limfocyty, makrofagi), które powodują stwardnienie w miejscu podania
antygenu. Klasycznym przykładem nadwrażliwości typu póz
nego jest reakcja na tuberkulinę.
Reakcje póz
ne mogą dawać inne bakterie (brucella, listeria, gronkowce..), grzyby, alergeny
kontaktowe, np. chrom, nikiel.
*oznaczanie eozynofilów  może być miarą zapalenia alergicznego ale nie tylko. Można
oceniać w krwi (we wzorze Schillinga prawidłowo 1  3%, wyniki powinny być podawane w
wartościach bezwzględnych) lub w wymazach z nosa, popłuczynach pęcherzykowo-
oskrzelowych, bioptatach śluzówki.
Studenci oceniają preparatyi zdjęcia z BAL-u od różnych pacjentów (alergia  naciek
eozynofilów, sarcoidoza - limfocytoza, infekcja bakteryjna - granulocyty, prawidłowe 
przewaga makrofagów) pod kątem obecności eozynofili i innych komórek zapalnych.
*metody oceny aktywacji komórek
- oznaczanie tryptazy w surowicy - w procesie degranulacji komórki tucznej, w mniejszym
stopniu bazofila  100x mniej, z ziarnistości uwalniana jest oprócz histaminy także tryptaza,
pozostająca w kompleksie z heparyną i proteoglikanem chondroityny, co powoduje
póz
niejsze pojawienie się w surowicy. Można oznaczać metodą RIA i ELISA we krwi w
uogólnionej reakcji anafilaktycznej a także w popłuczynach oskrzelowych, ślinie, wydzielinie
z nosa.
- uwalnianie histaminy z bazofilów  testy stosowane w celach naukowych, pomiar stężenia
histaminy można oceniać fluorymetrycznie, radioenzymatycznie i immunoenzymatycznie.
- uwalnianie leukotrienów  test CAST-ELISA
ĆWICZENIE 7
Choroby z autoimmunizacją
Związane są z występowaniem w organizmie autoreaktywnych przeciwciał oraz limfocytów
skierowanych przeciwko własnym antygenom gospodarza. Autoprzeciwciała mogą być
skierowane przeciwko antygenom występującym powszechnie (antygeny jądrowe  DNA,
RNA, histony, antygeny cytoplazmatyczne, występujące w organellach, błonie komórkowej)
lub specyficznym dla określonej tkanki czy narządu. Stąd mówimy o chorobach narządowo-
swoistych (choroba Hashimoto, Gravesa-Basedowa, Adisona, cukrzyca typu I, miastenia
gravis), i narządowo-nieswoistych - układowych (reumatoidalne zapalenie stawów-RZS,
toczeń rumieniowaty układowy-SLE, zespół Sjogrena, twardzina układowa).
Wśród przyczyn chorób z autoimmunizacji wymienia się: nieprawidłowa selekcja klonów
autoreaktywnych, zaburzenia mechanizmów regulacji, poliklonalna stymulacja przez
superantygeny wirusowe, bakteryjne, leki, enzymy, powstawanie krzyżowo-reagujących
przeciwciał pod wpływem antygenów drobnoustrojów wykazujących podobieństwo w
strukturze I-rzędowej z antygenami gospodarza (mimikra antygenowa).
U chorych można stwierdzić w surowicy: podwyższone stężenie gamma-globulin, obniżone
stężenie dopełniacza i komórek Ts, kompleksy odpornościowe, uszkodzenia w bioptatach (np.
kłębuszki nerkowe) powstałe w wyniku odkładania się kompleksów.
Diagnostyka immunologiczna polega głównie na wykrywaniu autoprzeciwciał, rzadziej
przeciwciał przeciw antygenom drobnoustrojów a także na oznaczaniu antygenów zgodności
tkankowej  choroby są uwarunkowane genetycznie i związane z występowaniem genów
kodujących antygeny HLA kl. I i częściej II klasy.
Chorzy mogą mieć więcej niż jeden rodzaj autoprzeciwciał i kilka chorób
autoimmunizacyjnych. Poziom autoprzeciwciał wzrasta z wiekiem, mogą być wykrywane w
innych chorobach, np. gruz
licy, nowotworach.
Znanych jest kilkadziesiąt autoprzeciwciał, z których tylko kilkanaście ma znaczenie w
diagnostyce różnicowej i uznawane jest za markery choroby. Związane jest to z niską
częstością występowania w danej chorobie, występowaniem w innych jednostkach a także
zróżnicowanymi metodami wykrywania, co prowadzi do uzyskiwania różnych jakościowo
wyników, nietrafnych rozpoznań i niewłaściwego leczenia.
Standardową, przeglądową techniką rozpoczynającą diagnostykę autoprzeciwciał jest:
*metoda immunofluorescencji pośredniej  daje ona duże możliwości poprzez zastosowanie
różnych substratów tkankowych i komórkowych i pozwala na dokładną mikroskopową ocenę
rozłożenia barwnika (fluoresceina) w jądrze czy cytoplazmie. Każde z autoprzeciwciał ma
typowy wzór fluorescencji, np. homogenny, brzeżny, jąderkowy, drobnoplamisty czy typy
pośrednie.. Najczęściej stosowane są ludzkie komórki nabłonkowe z raka krtani Hep-2,
służące przede wszystkim do wykrywania przeciwciał przeciwjądrowych ANA (antinuclear
antibody). Ponieważ komórki Hep-2 są w różnych stadiach rozwoju można wykryć
przeciwciała dla białek centromerowych, wrzeciona kariokinetycznego. Innym substratem są
skrawki wątroby małpy czy szczura, które wykrywają przeciwciała przeciwko cytoplazmie
granulocytów (cANCA, pANCA) a także specyficznym antygenom wątrobowym. Substraty
te można łączyć jednocześnie. Badanie rozpoczyna się zwykle od rozcieńczenia surowicy
1:10  1:100 w zależności od testu.. Wysokość miana niektórych przeciwciał odzwierciedla
aktywność procesu chorobowego i może mieć znaczenie prognostyczne. Do ostatecznego
różnicowania używa się metody ELISA (do różnicowania ANCA, SCL 70, SSA, SSB,
SM/RNP), bloki tkankowe (głównie do wykrywania przeciwciał ANA, AMA, ASMA,
APCA) lub westernblot. Do określania narządowo-swoistych przeciwciał stosowane są
odpowiednie substraty narządowe.
Studenci oglądają przeciwciała przeciwjądrowe na Hep-2 oraz przeciwciała dla natywnego
DNA na Crithidia lucilla (pierwotniak) i zwracają uwagę na różne formy świecenia.
ĆWICZENIE 8
Niedobory odpornościowe
W przebiegu choroby angażującej układ odpornościowy lub w przypadkach niedoborów
pierwotnych (wrodzone) czy wtórnych (nabyte) upośledzenie (np. brak przeciwciał czy
komórek) czy zaburzenia normalnych funkcji (np. produkcja autoprzeciwciał) układu
odpornościowego może obejmować mechanizmy odporności wrodzonej (fagocytoza,
dopełniacz) jak i nabytej (przeciwciała, zaangażowane komórki), humoralnej i komórkowej.
Ponadto ciągły ruch komórek (układ limfatyczny, krew, tkanki), obecność różnych
receptorów, cząstek adhezyjnych, cytokin... stwarza duże możliwości badawcze ale i
ograniczenia. Do oceny immunologicznej stosowana jest krew  ocena komórek, surowica lub
osocze (przeciwciała, antygeny, dopełniacz, cytokiny, kompleksy immunologiczne,
rozpuszczalne cząstki adhezyjne...), inne płyny (stawowy, mózgowo-rdzeniowy, opłucnowy,
BAL, mocz...), rozmazy komórkowe z biopsji, skrawki tkanek. Można przeprowadzać ocenę
jakościową (np. wykrycie czynnika reumatoidalnego), półilościową (miano przeciwciał w
surowicy), ilościową (immunoglobuliny, subpopulacje komórek), czynnościową
(transformacja blastyczna limfocytów), badać antygeny zgodności tkankowej (genetyczne
uwarunkowania niektórych chorób), testy skórne (określenie typu odpowiedzi
immunologicznej/nadwrażliwości lub jej brak) a także oceniać wpływ stosowanych metod
leczniczych czy rokowanie. Zestawy testów często są dostosowane do rodzaju choroby, nie
mniej wszystkie badania laboratoryjne powinno się rozpoczynać od badań podstawowych.
Niektóre objawy kliniczne wskazujące na upośledzenie funkcji immunologicznych to:
nawracające lub przewlekłe infekcje, często florą oportunistyczną lub normalną, powolne
zdrowienie, zła odpowiedz
na leczenie, przewlekłe biegunki, wyprysk atopowy, brak
prawidłowego rozwoju i wzrostu, hepatosplenomegalia, autoprzeciwciała, choroby
autoimmunizacyjne.
Badania podstawowe zlecane przez lekarza rodzinnego:
*morfologia krwi  spadek lub wzrost ilościowy leukocytów, przesunięcia we wzajemnych
proporcjach krwinek białych. Limfocytoza poza zakażeniami wirusowymi i przewlekłymi
stanami zapalnymi może sugerować proces autoimmunizacji, eozynofilia z nadwrażliwością
typu I lub chorobami pasożytniczymi
*stężenie białka całkowitego i rozdział elektroforetyczny z podaniem odsetka poszczególnych
frakcji. Hyperglobulinemia może sugerować choroby z autoimmunizacji, brak gamma-
globulin lub ich niskie stężenie  niedobory wrodzone lub nabyte.
*ocena ilościowa IgG, IgM i IgA  pozwala wykryć niedobory Ig. W zespole Brutona
stwierdza się śladowe stężenia surowiczych IgG, IgM, IgA, co wynika z ich upośledzonej
syntezy. W pospolitym zmiennym niedoborze odporności (CVID) stężenia IgG i IgA są
niskie, IgM często niewykrywalne. W niedoborze IgA (poniżej 5 mg/dl) IgG i IgM mogą być
w normie ale u 20% chorych nie ma podklas IgG2 i IgG4.
*ocena białka C-reaktywnego  świadczy o toczącym się procesie zapalnym
*test NBT ujemny lub obniżony wskazuje na upośledzoną zdolność bójczą neutrofilów
*testy skórne  najczęściej wykonywana i najważniejsza jest próba tuberkulinowa, oceniająca
nadwrażliwość typu póz
nego DTH. Odczyn ujemny lub bardzo słaby po 48-72 godz wskazuje
na upośledzenie mechanizmów odpowiedzi komórkowej i anergii na dany antygen
limfocytów T (wszystkie noworodki są szczepione BCG). Można wykonać również Multitest
zawierający 7 wystandaryzowanych antygenów (tężec, błonica, paciorkowiec gr. C,
tuberkulina, Candida albicans, Trichophyton mentagrophytes, Proteus mirabilis). Testów
skórnych nie wykonuje się u dzieci poniżej 1 roku życia.
Dodatkowo w specjalistycznych ośrodkach można określać odsetek/liczby bezwzględne
limfocytów T i B, subpopulacje T, odpowiedz
proliferacyjną limfocytów pod wpływem
mitogenów (np. PHA), przeciwciał anty-CD3, anty-TCR, chemotaksję neutrofilów,
chemiluminescencję, obecność ekspresji różnych receptorów CD na powierzchni
neutrofilów, cytotoksyczność NK, badanie obecności i aktywności enzymów ADA 
dezaminaza adenozyny, PNP  fosforylaza nukleozydów purynowych, ZAP-70  kinaza
tyrozynowa, stężenie składowych dopełniacza, aktywność hemolityczną układu dopełniacza.
W ciężkim złożonym niedoborze odporności (SCID) w zależności od rodzaju zaburzenia
może być: SCID T-B-, T-B+, TCD8-, TCD4-, odpowiedz
proliferacyjna: brak lub bardzo
słaba.
Przypadek kliniczny 1:
S.K. Chłopiec lat 2, poród o czasie, cięcie cesarskie, waga 4750 g, w czasie pobytu na
oddziale wystąpiły nieliczne potówki, dziecko rozwija się bardzo dobrze, ma nadwagę, nie
choruje, jednak od 3 tygodnia życia pojawiają się okresowo ropnie w różnych miejscach:
tułów, przedramię, twarz, nos, spojówki. Leczenie antybiotykiem bez efektu. Matka zdrowa,
ojciec od lat ma okresowo czyraczność.
Badania: wydzielina z ropnia  Staphylococcus aureus MSSA.
Badanie ogólne moczu  bez zmian
Poziom cukru  94 mg/dl
Morfologia i rozmaz: w załączeniu (granulocytopenia).
Rozpoznanie: ropnie mnogie
Postępowanie: wobec utrzymywania się procesu ropnego wykonano autoszczepionkę.
Test skórny wykonany z zawiesiny własnych gronkowców: wczesny  ujemny, póz
ny  słabo
dodatni  ok. 5 mm
Wskazane leczenie autoszczepionką ojca.
Przypadek kliniczny 2:
H.T. Młodzieniec lat 20, szczupły, od 8 miesięcy czyraczność, zmiany występują 1  2 razy w
miesiącu. W wywiadzie w dzieciństwie kilkakrotnie zapalenie płuc i oskrzeli. Od roku
pracuje fizycznie w warsztacie samochodowym. Wywiad rodzinny bez znaczenia. Leczony
chirurgicznie (nacięcia) i antybiotykami bez efektu. Wykonano autoszczepionkę. W okresie 3
miesięcznego leczenia wystąpił jeden czyrak, który bardzo szybko się zagoił. Pacjent będzie
brał przypominające dawki autoszczepionki do pół roku, winien zwrócić uwagę na większą
higienę w pracy.
Badania: w posiewie Staphylococcus aureus MSSA
Badanie ogólne moczu: w normie
Poziom glukozy: 100mg/100
Morfologia: w załączeniu (przed leczeniem granulocytopenia, po podaniu autoszczepionki
wyraz
ny wzrost odsetka granulocytów)
Test skórny z zawiesiny własnych gronkowców: wczesny  ujemny, póz
ny  naciek ok. 7 mm
Przypadek kliniczny 4:
Chłopiec 8 miesięcy, poród o czasie, siłami natury, 3350 g, początkowo dziecko rozwijało się
prawidłowo, ostatnio słabo przybywa na wadze, karmione cały czas piersią, od 4 miesiąca
utrzymują się infekcje dróg oddechowych, początkowo o lekkim przebiegu, ostatnio średnio
ciężkie zapalenie ucha środkowego z ropnym wyciekiem, dwukrotnie wystąpiło zapalenie
płuc, utrzymuje się ropny katar, leczenie antybiotykami początkowo skuteczne, obecnie bez
wyraz
nej poprawy. Po szczepieniu DiTePer i Polio (tylko jedna dawka) w 2. miesiącu życia
dziecko miało stany podgorączkowe i wolne stolne. Wywiad rodzinny: siostra 5 lat rozwija
się prawidłowo. Brat ojca zmarł w wieku 4 miesięcy.
Badania dodatkowe:
Posiew z nosa: Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus
Badanie ogólne moczu: ślad białka, 5  10 leukocytów w osadzie
Morfologia: E  3,9 L  10,2 rozmaz: neutrofile 54%, eozynofile 5%, limfocyty 35%
monocyty 6%, OB  10
Immunoefektroforeza białek surowicy: bardzo słabo zaznaczona frakcja gamma-globulin
Immnuglobuliny: IgG  wyraz
nie obniżone (30mg/dl), IgA i IgM - brak
Miano przeciwciał przeciwtężcowych  ujemne
Odsetek limfocytów CD19 - O%, CD3  75%
Rozpoznanie: zespół Brutona, występuje tylko u chłopców, defekt chromosomu X  brak
genu dla kinazy tyrozynowej warunkującej dojrzewanie limfocytów pre-B w B, siostra
zdrowa, objawy nasilają się po wyczerpaniu przeciwciał IgG pochodzących od matki,
zakażenia bakteriami ropotwórczymi, które niszczone są w procesie fagocytozy przez
granulocyty, wspomaganej swoistymi przeciwciałami.
Leczenie: co 4 tygodnie dożylnie lub podskórnie podaje się preparaty immunoglobuliny G
celem uzyskania stężenia ochronnego 400-500 mg/dl, unikanie zakażeń, leczenie celowanym
antybiotykiem
Przypadek kliniczny 5:
Dziewczynka 2 lata, ciąża, poród bez powikłań, psychicznie rozwija się prawidłowo, je dość
dobrze, jest szczupłe, od ok. 6-7 miesiąca życia, wg matki po zamieszkaniu w mieście, często
się przeziębia zwłaszcza po kontaktach z innymi dziećmi, okresowo miewa wolne stolce. Od
2 tygodni ma stany podgorączkowe, katar śluzowo-ropny, kaszle. Fizykalnie lekko
zaczerwieniona tylna ściana gardła, płuca bz.
Badania dodatkowe:
Morfologia: Hb - 12,3 E - 3,9 L - 12,3 (neutrofile 32%, eozynofile 2%, bazofile 1%,
limfocyty 60%, monocyty 5%) , płytki 225 tys.
IgG  750mg/dl, IgA  15 mg/dl, IgM  81 mg/dl
Limfocyty B  20%, limfocyty T  64%, stosunek CD4/CD8  1,8
W posiewie z nosa: Staphylococcus aureus, Moraxella catarrhalis
Rozpoznanie: Znaczne obniżenie IgA, przy prawidłowym poziomie innych klas,
limfocytoza, częste infekcje błon śluzowych (najprawdopodobniej wirusowe) przemawiają za
selektywnym niedoborem IgA. Jest to najczęstsza hypogammaglobulinemia (1 na 700 osób),
może ustąpić samoistnie, u niektórych chorych może nie być objawów. Immunoglobulin nie
podaje się ponieważ w handlowych preparatach nie ma IgA. Unikać kontaktów z chorymi,
stosować leczenie celowanym antybiotykiem.
Przypadek kliniczny 6:
Mężczyzna 30 letni, po studiach, pracuje w dużej firmie, często wyjeżdża za granicę. Stan
wolny. Od roku czuje się bardzo zmęczony, miewa stany podgorączkowe. Wcześniej raczej
nie chorował. Przyznaje się do przebycia rzeżączki przed 7 laty oraz do kontaktów
homoseksualnych. Stałego partnera nie ma. Narkotyków nie bierze. Nie zgadza się na
wykonanie testów w kierunku HIV. Po roku zgłasza się ponownie: od 2 miesięcy ma stały
kaszel, odpluwa niewiele, zauważył powiększone węzły chłonne szyjne i pachwinowe, nie
może pracować, każdy wysiłek go męczy. Zgadza się na wykonanie badań.
Badania dodatkowe:
Test Elisa w kierunku HIV dodatni, w teście Western blot prążki p24, gp 41, gp 120.
Stosunek CD4/CD8  1,0
Rtg klatki piersiowej: rozlane nacieki w płucach. W plwocinie: preparat barwiony metodą
Grama  w granicach fizjologii, metodą Ziehl-Neelsena ujemny, metodą IF  wykryto
trofozoidy Pneumocystis carinii.
Rozpoznanie: Zakażenie HIV, obecność p24 wskazuje na aktywną replikację HIV, zmiany
w płucach i powiększone węzły są objawem rozwijania się zespołu AIDS.
ĆWICZENIE 9
Immunologia transplantacyjna
Antygeny zgodności tkankowej inaczej zwane antygenami transplantacyjnymi występują na
powierzchni komórek i warunkują zgodność lub niezgodność przeszczepionej tkanki z
tkankami biorcy. Najważniejsze antygeny transplantacyjne (silne) są kodowane przez geny
tzw. głównego układu zgodności tkankowej  major histocompatibility complex - MHC.
U ludzi ściśle sprzężony kompleks genów MHC znajduje się na krótkim ramieniu 6
chromosomu a antygeny tego układu nazwane zostały ludzkimi antygenami leukocytarnymi -
human leucocyte antigens  HLA, inaczej cząsteczkami MHC. Istnieją antygeny HLA kl. I 
HLA-A, HLA-B, HLA-C, klasy II  HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR. Antygeny klasy I
występują na wszystkich komórkach jednojądrzastych i płytkach krwi, klasy II głównie na
powierzchni limfocytów B, makrofagów, monocytów, komórek dendrytycznych, komórek
Langerhansa, mogą się pojawić dodatkowo na komórkach aktywowanych cytokinami:
limfocyty T, komórki śródbłonka, nabłonka jelitowego, tarczycy i inne. Najważniejszą rolą
cząsteczek klasy I i II jest prezentacja antygenu limfocytom T. Antygeny kl. I reagują z
cząsteczką CD8, kl. II z CD4  tzw. restrykcja MHC.
Układ HLA jest wybitnie polimorficzny, istnieje wiele alleli w obrębie pojedynczego locus,
co daje w populacji bardzo dużą liczbę kombinacji.
Geny HLA są kodominujące, dziedziczone wg praw Mendla. Każdy osobnik posiada 2
haplotypy genów, każdy dziedziczony od jednego z rodziców, może być heterozygotą
(obydwa allele tego locus ulegają ekspresji) lub homozygotą.
Metody identyfikacji antygenów HLA
- metody serologiczne: wykonuje się test limfocytotoksyczny - z krwi lub węzła chłonnego
izoluje się limfocyty (do badania kl. I wszystkie, do badania kl. II  tylko limfocyty B), kapie
do płytki Tarasaki i inkubuje się z zestawem surowic zawierających przeciwciała
monoklonalne o znanej swoistości, np. anty-HLA- B8, które wiążą się z antygenem na
powierzchni komórki, dodaje dopełniacz, inkubuje (dopełniacz uszkadza komórki pokryte
antygenem+przeciwciało) a następnie błękit trypanu lub eozynę. Komórki martwe pochłaniają
barwnik, są ciemne co świadczy, że posiadały one testowany antygen B8. Komórki żywe nie
pobierają barwnika  świecą. Na tej podstawie można wykazać, czy dana kombinacja
surowicy z dopełniaczem jest cytotoksyczna dla limfocytów. Antygeny HLA na komórkach
oznacza się na podstawie obserwacji, która z surowic spowodowała perforację błony
badanych limfocytów. W przypadku typowania antygenów HLA używa się przeciwciał
monoklonalnych, w przypadku testów cross-match limfocyty dawcy pozyskane z węzła
chłonnego inkubuje się z surowicami biorcy oceniając liczbę zabitych limfocytów.
Studenci oglądają płytkę Tarasaki z typowaniem antygenów HLA klasy I ( kontrola dodatnia i
ujemna, przykładowe reakcje dodatnie) oraz protokół z przeprowadzania badania.
- metody molekularne:
*hybrydyzacyjna - PCR-SS0, zwana oligotypowaniem, stosuje się sondy molekularne
wyznakowane dla odpowiednich alleli HLA, które hybrydyzują i wiążą się tylko z tym
allelem, który jest obecny w DNA izolowanym z komórek testowanej osoby. Wcześniej DNA
amplifikuje się z użyciem metody PCR
*PCR-SSP  wyizolowane DNA amplifikuje się z odpowiednimi sondami i po amplifikacji
wykrywa się produkty PCR metodą elektrofortyczną. Na podstawie układu prążków ustala się
obecne antygeny np. DR.
Prezentacje ww metod w Pracowni biologii molekularnej oraz w ciemni (elektroforeza w żelu
 ocena prążków- oznaczenie antygenów np DR).
Identyfikację antygenów HLA przeprowadza się przy doborze dawcy i biorcy przeszczepu,
przy wykluczeniu ojcostwa (obecnie rzadziej) oraz w diagnostyce wielu chorób, np.
autoimmunizacyjne.
Dobór dawcy i biorcy nerki
Aby zoptymalizować przeżycie przeszczepu i zminimalizować reakcję odrzucenia ustala się
(poza wskazaniami klinicznymi):
- nerki od dawcy < 15 r życia powinny być przeszczepiane dzieciom do 15 r
- zgodność w układzie ABO
- zgodność w zakresie HLA  oblicza się wg punktów:
6 wspólnych antygenów  priorytet przeszczepienia
HLA-A  1 punkt za każdy zgodny antygen
HLA-B  4 punkty za każdy zgodny
HLA-DR  7 punktów za każdy zgodny antygen
- obecność w surowicy biorcy przeciwciał limfocytotoksycznych przeciwko antygenom
HLA dawcy) w tzw. próbie krzyżowej  cross-match (powinna być ujemna), przeciwciała te
powstają w wyniku wcześniejszych przetoczeń krwi, transplantacji, ciąży, surowice do
cross-match pobiera się co 6 tygodni, wcześniej u każdego potencjalnego biorcy nerki
wykonuje się co 12 tygodni test limfocytotoksyczny z jego surowicą i panelem limfocytów
(20 dawców) celem określenia PRA (panel reactive antibody), wysoki procent PRA
zwiększa szansę odrzucenia przeszczepu  sa one odpowiedzialne za nadostre odrzucenie
przeszczepu
- czas tzw. zimnego niedokrwienia  gdy są duże odległości korzystniej jest przeszczepić
nerkę choremu nieco gorzej dobranemu tkankowo, lecz znajdującemu się bliżej
Studenci oglądają cross-match - test limfocytotoksyczny wykonany z surowicami
oczekujących biorców nerek a limfocytami dawcy i oceniają reakcje o różnym stopniu
nasilenia.
Prezentacja przykładowego protokołu z doboru najodpowiedniejszego biorcy dla dawcy o
danych antygenach HLA przy użyciu programu HLAMATCH oraz oceną testu
limfocytotoksycznego.
Przeszczepianie serca, wątroby, trzustki wykonuje się bez dobierania biorców w zakresie
HLA, jedynie w zakresie układu ABO. Tkanki uprzywilejowane, które nie są odrzucane to:
kość, chrząstka, ścięgno, odcinki głównych naczyń krwionośnych oraz tkanki nieunaczynione
 rogówka.
ĆWICZENIE 11
Immunologia rozrodu
Immunoterapia kobiet z samoistnymi poronieniami nawykowymi (co najmniej trzecie
następujące po sobie poronienie przed upływem 28 tygodnia ciąży)
Istnieje kilka hipotez tłumaczących współistnienie immunologiczne matka-płód i istniejącą
tolerancję na odmienne antygeny transplantacyjne płodu pochodzące w połowie od ojca.
Mimo, że początkowo sądzono, że macica nie podlega kontroli immunologicznej, ciążę
należy potraktować jako przeszczep allogeniczny. W ciąży pojawiają się przeciwciała
cytotoksyczne skierowane przeciw antygenom transplantacyjnym płodu, nie powodując
jednak widocznych skutków, Ilość ich wzrasta u wieloródek (kiedyś surowice wieloródek
były z
ródłem przeciwciał anty-HLA stosowanych w typowaniu tkankowym). Powstają
również przeciwciała typu blokującego, które wydają się mieć znaczenie biologiczne  nie
powstają one u pacjentek, które ronią. Przeciwciała te mają ograniczoną zdolność wiązania
dopełniacza i opłaszczają powierzchnię trofoblastu nie wywołując jego uszkodzenia, chronią
przy tym przed działaniem limfocytów cytotoksycznych wobec antygenów ojcowskich.
Poronienia samoistne częściej występują u par posiadających wspólne allele HLA Kl. I i II a
także homozygotyzm u matki i płodu. Próbuje się podawać podskórnie kobietom roniącym
wyizolowane z krwi obwodowej limfocyty męża w celu wytworzenia u żony przeciwciał
blokujących działających protekcyjnie wobec płodu.
Konflikt serologiczny matczyno-płodowy (choroba hemolityczna noworodków)
Obejmuje głównie antygeny układu Rh, ABO (słabszy przebieg), rzadko inne.
Klasyczny konflikt: antygen D (Rh+) występuje na erytrocytach dziecka, nie ma go matka,
która wytwarza przeciwciała anty-D. W czasie trwania ciąży ok. 0,1  0,2 ml krwi dziecka
przedostaje się do matki, więcej w czasie porodu zwłaszcza zabiegowego. U matki
przeciwciała anty-D powstają od 6 tygodni do 3 miesięcy po porodzie. Każda następna ciąża
zwiększa ich miano. Obecnie matce po urodzeniu dziecka Rh+ podaje się przeciwciała anty-
D. (Zmniejsza to ryzyko powikłań u dziecka o 90%, a dodatkowe podanie surowicy anty-D w
28 tygodniu ciąży zmniejsza wystąpienie choroby hemolitycznej do 0,1%). Przeciwciała anty-
D łącza się z erytrocytami Rh+ pochodzącymi od dziecka. Powstałe kompleksy są wiązane
przez swoiste limfocyty B i przekazują sygnały supresyjne.
Diagnostyka konfliktu serologicznego  test antyglobulinowy (odczyn Coombsa).
Studenci oglądają odczy Coombsa bezpośredni (wykrywa przeciwciała opłaszczone na
krwinkach badanego np. choroba hemolityczna noworodków, niedokrwistości
autohemolityczne, odczyny potransfuzyjne) i pośredni odczyn Coomsba (wykrywa
przeciwciała u matki przeciwko antygenom krwinkowym płodu lub u biorcy przeciwko
krwinkom dawcy)