Produkty metabolizmu centralnego
Metabolizm – najkrócej mówiąc jest
to przemiana materii. Jest To całość
procesów biochemicznych
zachodzących w żywych organizmach
warunkujących wzrost i
funkcjonowanie organizmów.
Przemiany metaboliczne podzielono
na dwie grupy:
1.Metabolizm centralny
(pierwotny/pierwszorzędny)Obejmu
je on przemiany związków, które są
niezbędne dla funkcjonowania
komórki, czyli jej odżywiania,
oddychania, wydalania. Metabolizm
ten funkcjonuje w podobnej postaci
i zbliżonym zakresie we wszystkich
żywych organizmów. Podstawową
cechą metabolizmu centralnego jest
jego uniwersalność
2.Metabolizm peryferyjny
(drugorzędowy/wtórny)Obejmuje
on przemiany związków
chemicznych, których rola w
organizmach żywych nie jest w pełni
jasna i przemiany te nie są niezbędne
dla życia komórki. Cechą
charakterystyczną tego metabolizmu
jest to, że jest on charakterystyczny
tylko dla wybranej grupy
organizmów. Typowymi produktami
tego metabolizmu są np. antybiotyki.
Podstawowymi szlakami
funkcjonującymi w ramach
metabolizmu centralnego są:
- Glikoliza,
- Szlak heksozo-mono-fosforanowy,
- Cykl Krebsa,
- Cykl Embdena-Dougoroffa.
W ramach metabolizmu
peryferyjnego największą rolę
odgrywa szlak poliketydowy, który
jest zbliżony do szlaku związanego z
przemianami tłuszczowscow.
Katabolizm – przemiany degradacji
subst. Odżywczych do mniejszych
frag. – chodzi o to by zamienić
związki wysokocząsteczkowe
zasobne w energię w związki
prostsze. Są to przemiany związane z
uwalnianiem energii. Anabolizm –
reakcje chemiczne w których nast.
Tworzenie związkow bardziej
złożonych i reakcje te wymagają
zwykle dostarczenia energii np.
fotosynteza, chemosynteza,
biosynteza białekm lipidów,
kw.nukleinowych oraz
polisacharydów.
Metabolizm centralny
Cechy szczególne szklaków
metabolizmu centralnego w ramach
biotechnologii korzystamy
z pośredników metabolizmu
centralnego odbywającego się
zarówno w warunkach tlenowych
i beztlenowych.
Schemat glikolizy (EMP)
Cechą charakterystyczną dla szlaku
EMP jest podwójne ufosforylowanie
cząsteczki glukozy i rozbicie
powstałego fruktozo-1,6-difosforanu
do dwóch trioz:
- Pirogronianu,
- Fosfoendopirogronianu,
- Dihydroksyacetonu.
Zapewniając warunki beztlenowe
możemy uzyskać następujące
produkty:
·
Etanol,
·
CO
2
,
·
Kwas mlekowy,
·
Kw. Bursztynowy,
·
Propionowy,
·
Mrówkowy,
·
Masłowy,
·
Butanol,
·
Aceton,
·
Izopropanol,
·
Wodór,
·
Di acetyl,
·
Acetolina,
·
Butandiol.
W warunkach tlenowych
uruchamiany jest cykl Krebsa.
Pirogronian uzyskany w ramach
szlaku EMP zostaje w wyniku reakcji
dekarboksylacji przekształcony do
acetyloCoA i w tej chwili formie
zostaje wlączony do C.K. w ramach
którego tworzone są takie substancje
jak:Kwas szczawiooctowy,
Izocytrynian,JabłczanBursztynian.
Związki te stanowią punkty wyjścia
do syntezy większości aminokwasow
(w tym aomatycznych), glicerolu,
który stanowi podstawę syntezy
tłuszczu.
Regulując parametry natlenienia w
hodowli szczepów, u których
dominującym szlakiem jest glikoliza,
wpływamy w sposób zasadniczy na
tworzone produkty np. kiedy
kierujemy mikroorg. na szlaki
fermentacyjne bądź na syntezę
produktów związanych z obfitym
wzrostem komórek np. synteza AK.
Cykl EMP odpowiada za tworzenie
fragmentów trój węglowych
ulegających w warunkach tlenowych
dekarboksylacji do acetyloCoA i w tej
formie włączany jest do Cyklu
Krebsa.
W warunkach beztlenowych trioza
redukowana jest do subst. 2-
węglowej t.j etanol bądź redukowana
do kwasu mlekowego i innych
podobnych produktów.
W war. Beztl. zysk energetyczny
glikolizy wynosi 2 mole ATP ( w
wyniku fosforylacji substratu).
W warunkach tlenowych – 38 moli
ATP.
Szlak HMP
Glukoza jest utl. Do glikonianu, który
ulega dekarboksylacji do rybulozo-5-
P. Szlak ten traktowany jest jako
równoległy z glikolizą. Zysk
energetyczny wynosi 36 moli ATP.
Szlak ten dzięki powstawaniu
produktów zaw. 4,5,7 atomów węgla
stanowi wspaniały punkt wyjścia do
syntez komórkowych, a tym samym
różnorodnych produktów, których
podstawą syntezy są właśnie
szkielety węglowe.
Szlak Etnera-Doudoroffa
Szlak ten ma początek w taki jak w
szlaku HMP, koniec jak w glikolizie.
Zysk energetyczny jest niewielki,
zaledwie 1 mol NADH i 1 mol
NADPH. (bakterie Pseudomonas,
metylotroficzne)
Reakcje anaplerotyczne (Rysunek
str. A)
R-e te f-nują na pograniczu glikolizy i
Cyklu Krebsa. Są to głównie reakcje
karboksylacji trioz (pirogronianu i P-
enolopirogronianu) do
szczawiooctanu – najbardziej
reaktywnego komponentu Cyklu
Krebsa. Dzięki tym reakcjom
wspomagającym wiele procesów
biosyntezy zachodzi ze zwiększoną
efektywnością. Sztandarowym
przykładem jest biosynteza kw.
Cytrynowego oraz takich AK jak
asparaginian, glutaminian jak
również produkcja porfiryn.
Najważniejsze produkty powstające
w wyniku f-wania szlaków
centralnych.
(Tabela str. B) – produkty biosyntezy
w war. Tlenowych.
Produkty biotechnologiczne
metabolizmu peryferyjnego
Mikroorganizmy obok metabolitów
niezbędnych dla własnego rozwoju
mogą wytwarzać produkty – głównie
nisko cząsteczkowe, które
niespełnianą podstawowych f-i
metabolicznych, wykazują jednak
określone właściwości substancji
biologicznie czynnych. Produkty
metabolizmu peryferyjnego określa
się terminem idiolity, ponieważ
tworzone są w idiofazie. (rys 2-1)
- Antybiotyki – leczenie chorób
infekcyjnych i nowotworowych,
przeszczepy, konserwowanie
żywności i pasz.
- Probiotyki – stymulowanie
kiełkowania nasion i plonowania
roślin, stymulowanie wzrostu
zwierząt.
- Toksyny – zwalczanie owadów.
- Inhibitory enzymów – różnorodna
aktywność farmakologiczna
(nadciśnienie, nowotwory,
owrzodzenie żołądka)
- Polisacharydy (dekstran, pululan,
ksantyn, alginian) – zastępowanie
osocza krwi, powłoki ochronne
produktów spożywczych, środki
żelujace.
Typowe idiolity:
Alkaloidy,Aminokwasy,Antocyjany,
Fenazyny,Flawonoidy,Nitryle,Piperaz
ynya,Pirydny,Pirole,Polieny,Steroidy,
Tetracykliny,Polipeptydy
Związki te mogą wykazywać
właściwości:
Anaboliczne,cytotoksyczne,hemolityc
zne,herbicydowe,immunostymulując
e,przeciwdrobnoustrojowe,przeciwza
palne,przeciwnowotworowe,rakotwó
rcze,pobudzające,uspokajające
O ile produkty
metabolizmu centr. były niemal
ideat. u wszystkich organizmów, o
tyle metabolizm peryferyjny jest
charakterystyczny dla określonych
grup mikroorg. I np. antybiotyki
wytwarzane są głównie przez
promieniowce Streptomyces, grzyby
Penicillium, Aspergillus, Mucor i inne
oraz tylko wybrane gatunki bakterii
np. Bacillu.
Charakterystyczne
jest to, że produkty peryferyjne
pojawiają się najczęściej gdy zaczyna
brakować źródła węgla, azotu,
fosforu i szczep chcąc zabezpieczyć
swą populację, przeważnie wydziela
substancje zabezpieczające przed
rozwojem innych mikroorganizmów.
W wielu ośrodkach trwają badania
nad określeniem roli idiolitow w
przyrodzie.
Hipotezy:
1.Ekologiczna – antybiotyki
(wyrzucana broń)
2.Inny rodz. przemian
charakterystyczny dla danego
organizmu, który ma na celu
zapewnić komórce niemającej
możliwości rozwoju, utrzymanie jej
aktywności metabolicznej i staniu
równowagi z otoczeniem w
warunkach gdy typowe przemiany
metaboliczne są niemożliwe.
3.Udowodniono również, że efekt
rozregulowania przemianą materii.
4.Wolna gra ewolucyjna zachodząca
na marginesie ukształtowanych
procesów życiowych – prowadzi do
zmian ewolucyjnych
uniemożliwiających przetwarzanie
danych gatunkowych.
5.Metabolizm ten koordynuje
przemiany metabolizmu centralnego.
Jednakże należy uwzględnić fakt, że
to przemiany centralne dostarczają
energię niezbędną dla syntezy
idiolitów w postaci ATP i NADPH
2
.
Biosynteza idiolitów
jest ściśle powiązana z
podstawowymi syntezami
komórkowymi poprzez wspólne
metabolity pośrednie (rys 14-4).
Pośredniki te włączone są w szlak
poliketydowy podobny do przemian
związanych z biosyntezą kwasow
tłuszczowych (rys 2-2). Starterem
tych reakcji jest acetyloCoA, a
wydłużenie łańcucha kwasu
tłuszczowego polega na dołączeniu
kolejnych cząsteczek malonylo-CoA
z jednoczesnym uwolnieniem CO
2
.
Następny etapem jest redukcja grupy
ketonowej z jednoczesnym
wydzielaniem cząsteczki H
2
O. Kolejny
etap to redukcja podwójnych wiązań.
W zależności od
użytych prekursorów (penicylina), od
stopnia redukcji podwójnych wiązań,
włączenia reakcji cyklizacji (na rys.
tego nie ma) i wprowadzeniu różnych
podstawników istnieje szansa
uzyskiwana w ramach tego
metabolizmu praktycznie nie
wyczerpywanej ilości związków
wykazujących różnorodną
aktywność.
Tak ogromna
różnorodność struktur chemicznych
idiolitów wynika z niskiej
specyficzności substratowej
enzymów przemian specyficznych.
Różnorodność ta wynika również z
istnienia licznych rozgałęzień szlaku
polipeptydowego oraz z istnienia
węzłów metabolicznych
odpowiedzialnych za kontakt miedzy
przemianami centralnymi oraz
specyficznymi.
Biosynteza aminokwasu L-lizyny
(rysunek
A
)
Biosynteza L-lizyny
jest ściśle związana z metabolizmem
centralnym. Związki te (aminokwasy)
powstają z intermediatów glikolizy
(3-P-glicerynianu, P-
enolopirogronianu, pirogronianu),
szlaku pentozo fosforanowego
(rybozo-5-P) i cyklu kwasu
cytrynowego (2-oksoglutaranu,
szczawiooctanu).
Klasyfikacja AK. Na
podstawie związkow wyjściowych
wykorzystanych do ich syntezy
można je podzielić na 6 rodzin
biosyntetycznych:
-Z szczawiooctanu (asparaginian,
asparagina, metionina, treonina,
lizyna, izoleucyna,
- Z pirogronianu (alanina, walina,
leucyna),
- Z rybozo-5-P (histydyna),
- Z P-enolopirogronianu + erytrozo-4-
P (fenyloalanina, tyrozyna,
tryptofan),
- Z 2-oksoglutaranu (glutaminian,
prolina, arginina),
- Z 3-P-glicerynianu (seryna, cysteina,
glicyna).
(rysunek
B
)
Przemysłowa produkcja L-lizyny
Najczęściej wykorzystywana jest
metoda biosyntezy z udziałem
mikroorganizmów (Corynebacterium
glutamicum). Na początku była
produkowana z wykorzystaniem
szczepów dzikich. Jednak aktualnie
produkcja lizyny jest przy
wykorzystaniu mutantów, ponieważ
chcemy by cały węgiel był
przekserowany na produkcję lizyny.
W szczepach dzikich obserwujemy
brak „nadproduktywności” lizyny i
izoenzymów (odpowiedzialnych za
kontrolę i hamowanie produkcji
lizyny).
Do przeprowadzenia produkcji lizyny
potrzeba jest ogromna ilość węgla.
Głównym źródłem węgla są reakcje
anaplerotyczne.
Szczegółowy schemat produkcji
lizyny -> rysunek
C
.
Bakterie c.glutamicum –
uwarunkowania do nadprodukcji L-
lizyny i kwasu L-glutaminowego.
Bakterie te są przemysłowymi
producentami egzogennej L-lizyny
(800 tys. ton/rok) i endogennego
kwasu L-glutaminowego (1,2 mln
ton/rok). Posiadają one zespół
korzystnych cech sprzyjających super
syntezie tych aminokwasów.
1.Bakterie c.glutamicum dysponują
unikalnym zespołem enzymów
anaplerotycznych, które odgrywają
kluczową rolę w nadprodukcji lizyny i
kwasu glutaminowego.
Spośród tych enzymów
najważniejszymi są:
a)Karboksylaza pirogronianowa
b)Karboksykinaza
fosfenolopirogronianowa
c)Kinaza pirogronianowa
Enzymy te generują w dużych
ilościach dwa ważne metabolity:
szczawiooctanu i pirogronian, które
są węglowymi substratami do
syntezy tych aminokwasów.
2.Wytworzony pirogronian dostarcza
ponadto acetyloCoA, który
przyczynia się do generowania ATP w
procesie oksydatywnej fosforylacji.
Utworzony ATP jest energetycznym
substratem niezbędnym do syntezy
lizyny i glutaminiau. Funkcjonujacym
w Komorkach cykl pentozowy
dostarcza NADPH w ilościach
wymaganych do nadprodukcji AK.
3.Bakterie c. glutami cum dysponują
prostym systemem kontroli
enzymów, uczestniczących w
syntezie aminokwasów. Nie
posiadają one izoenzymów (enzymy
które katalizują identyczne reakcje,
ale ich aktywność jest regulowana w
zróżnicowany sposób) i związanych z
tym dodatkowych mechanizmów
regulacji.
4.Właczenie NH4+ do szkieletu
prekursorów węglowych
aminokwasów (szczawiooctan) może
przebiegać u korynobakterii
niezależnie od stężenia tych jonów.
Bakterie te posiadają bowiem dwie
drogi aminacji 2-okso-glutaranu:
a)z udzialem dehydrogenazy
glutaminianowej (duża ilość NH4+ w
podłożu)
b)oraz szlak alternatywny z syntezą L-
glutaminianową i syntetazą L-
glutaminową (ograniczona ilość
NH4+).
5.Bakterie te są naturalnymi
auksotrofami biotyno zależnymi. Ta
cecha umożliwia sterowanie
przepuszczalności osłon
komórkowych (?). Deficyt biotyny w
podłożu powoduje powstanie
niepełnosprawnej błony
cytoplazmatycznej, przepuszczalnej
dla kwasu glutaminowego, natomiast
nadmiar blokuje wypływ i syntezę
tego aminokwasu, a sprzyja syntezie i
transportowi lizyny z Komorek do
podloża.
6. Bakterie c.glutamicum nie
posiadają enzymów degradujących
aminokwasy.
LIZYNA
Bakterie c.glutamicum syntezują
lizynę z asparaginianu, utworzonego
z szczawiooctanu. Przepływ
metabolitów od asparaginianu do
lizyny jest kontrolowany tylko w 3
miejscach:
1.Działania kinazy asparginianowej
(hamowanie aktywności enzymu
przez treoinię z lizyną)
2.W dystrybucji beta-serianbla ba
(schemat):
a)Uczestniczą 2 enzymy (synteza
dihydrodipokolinianowa i
(SCHAMEAT)
b)Pierwszy enzym przekształca cos
do lizyny, drugi do homoseryny i
dalej do treoniny, metioniny i l-
lizyny.
c)Aktywność syntazy nie jest
kontrolowana natomiast
dehydrogenazy homoserynowej
hamowana przez treoninę
Transport AK z komórek do podłoża
9transport aktywny), regulowany
przez wew. Komorkowe stezeie AK.
Dzikie szczepy!! Nie mogą być
producentami lizyny – nie
wytwarzają one w zwiekszonej ilości
tego AK.i nie wydzielają go do
podłoża. Dowodem tego jest wysoka
aktywność dehydrogenazy
homoserynowej, wielokrotnie
przewyższająca aktywność syntazy
dihydrodipokilinianowej. Oznacza to
że duże ilości lizyny wytwarzaja tylko
mutanty korynobakterii. W pzmeysle
SA stosowane:
Mutanty auksotroficzne, które nie
wykazują aktywności dehydrogenazy
homoserynowej. Wymagaja one do
wzrostu homoseryny lub metioniny i
treoniny. (w ilościach
suboptymalnych dla wzrostu
komórek)
Mutanty regulatorowe –
wyeliminowano u nich 9uchylono)
system kontroli kinazy asparginowej
Mutanty auksotroficzne-
regulatorowe
Biosynteza metabolitów wtórnych
Metabolizm i
peryferyjne używane są powszechnie
w opisach fizjologii i możliwościach
biosyntezy produktu w
biotechnologii. Obydwa rodzaje
metabolizmu maja cechy szczególne
wyróżniające się, jednakże podział
ten jest w dużym stopniu umowny,
ponieważ wiele substancji
wytwarzanych w ramach
metabolizmu centralnego jest
wykorzystywana do produkcji
metabolitów wtórnych i niektóre
enzymy klasyczne dla metabolizmu
peryferyjnego wykorzystywane są do
przemian centralnych.
Cechami
wyróżniającymi metabolizm
peryferyjny są:
- produkcja na sygnał –
rozpoczynająca się pod wpływem
czynników środowiska: wyczerpanie
żródla węgla, azotu, fosforu; deficyt
tlenu.
- Niska specyficzność enzymów
szlaków peryferyjnych (!!),
- Funkcjonowanie (uaktywnienie się)
szlaków peryferyjnych w fazie
stacjonarnej – niektóre antybiotyki
szczególnie bakteryjne wytwarzane
są już w fazie wzrostu wykładniczego.
- Do syntezy idiolitów potrzebna jest
obecność prekursora.
Synteza na sygnał – zaczyna
brakować źródła węgla i azotu.
Opis: prostokąt – metabolizm
centralny
W ramach metabolizmu
peryferyjnego funkcjonują 3 podst.
Drogi biosyntezy metabolitów
wtórnych:
1.Szlak poliketydowy - droga zbliżona
do pierwszych etapów syntezy kw. Tł.
(patrz rys ^)
2.Biosynteza z wykorzystaniem AK,
na drodze innej niż wykorzystanie w
translacji i transkrypcji i polega ona
na aktywacji aminokwasów przy
udziale ATP i uaktywniona grupa
karboksylowa jest przenoszona na
resztę aminową innego ak. Powstają
w ten sposób AK. I peptydy
o budowie innej niż komponenty
typowych białek komórkowych.
3.Biosznteza z wykorzystaniem
pięciowęglowych-terpendoidów,
synteza na kondensacji 3 jednostek
acetyloCoA a następnie ich
przekształceniu na skutek reakcji
redukcji i fosforylacji do
pirofosforanu izopentylu i
pirofosforanu dimetyloallilu. Szlaki te
funkcjonują u promieniowców,
grzybów, roślin i zwierząt.
Zainteresowanie tymi związkami
dotyczy nie tylko farmacji, ale
również realizacji pomyslów
produkcji węglowodorow z udziałem
mikroorganizmów.
Zarówno metabolizm jak i
peryferyjny podlegają podlegają
podobnym zasadom regulacji
biosyntezy. Najważniejsze z nich to:
1.represja kataboliczna –
spowodowana obecnością łatwo
dostępnego źrodla węgla i to
powoduje zahamowanie biosyntezy
metabolitów wtórnych. Indukcja
substratowa – przez efektory
metaboliczne, prekursory.
2.Regulacja stężeniem i rodzajem
użytego źródła azotu węgla i fosforu.
3.Sprzężenie zwrotne (za dużo
metabolitu – zahamowanie szlaku.
4.Regulacja innymi
czynnikami:Obecność wybranych
pierwiastków śladowych (Fe, Mg,
Mn, Zn),dostęp tlenu, temperatura,
pH.
Produkcja streptomycyny
Streptomyces to
grupa promieniowców klasyfikowana
jako bakterie z uwagi na typową dla
bakterii budowę komórki. Wszystkie
szczepy Streptomyces są gram
dodatnie, tlenowe i typowym
środowiskiem ich bytowania jest
gleba i woda. Morfologia szczepów
Streptomyces jest zbliżona do
grzybów strzępkowych.
Strzępki
Streptomyces są bardziej delikatne,
cieńsze w porównaniu z strzępkami
pleśni. Strzępki mogą mieć długość
do kilku metrów i typową jest
fermentacja tych strzępek po
zakończeniu wzrostu wykładniczego.
Genom wielu szczepów Streptomyces
został w ostatnich latach
zsekwencjonowany i posiada on
formy liniowych chromosomów, w
przeciwieństwie do genomu
większości bakterii, u których
genomy przybierają formę kulistą. W
genomie Streptomyces znajdują się
duże ilości cytozyny i guaniny.
Znaczenie
przemysłowe Streptomyces wynika z
ich wyjątkowych uzdolnień do
produkcji wielu antybiotyków (2/3
produkowanych antybiotyków to
antybiotyki Streptomyces). W kilku
laboratoriach świata prowadzone są
badania by wykorzystać szczepy
Streptomyces do produkcji
rekombinowanych białek ludzkich.
Dotychczas te badania prowadzono
głównie ze szczepami E. coli (dobry
biorca obcego DNA). Jednakże
okazuje się, że w E. coli bialka ulegają
nieprawidłowej glikozylacji i również
białka nieprawidłowo się zmieniają i
prowadzi to do powstania
nieczynnych, niefunkcjonalnych
produktów. Okazuje się, że szczepy
Streptomyces równie chętnie
przyjmują obce DNA, wykazuja
zdolność do sekrecji prawidłowo
zwiniętych białek i stanowią
atrakcyjną alternatywę dla E.coli i B.
subtilis. Ta właściwość
wykorzystywana jest do opracowania
technologii produkcji tzw.
antybiotyków hybrydowych.
Szczep + obce DNA
-> Produkcja nowego antybiotyku
Streptomycyna została wykryta w
1943 r., czyli po uruchomieniu
produkcji penicyliny i wykrył ją Albert
Schatz. Proces biosyntezy
Streptomycyna i charakterystyczne
elementy.
Glukoza w podłożu,
uruchomiają się 3 szlaki
metaboliczne. Wytwarzany jest
inositol -> pośredniki (nie trzeba
umieć) -> streptydyno-6P. Drugi szlak
-> DTP-L-dihytostreptosa.
Streptomycyna –
pierwszy antybiotyk aktywny w
stosunku do prątków gruźlicy.
- Podłoże do produkcji –
streptomycyna (łatwiej i trudniej
przyswajalne źrodło węgla i azotu) –
glukoza i skrobia
- Doprowadzamy grzybnię do…
Podst. Surowcami
do produkcji streptomycyny są np.
Glukoza + skrobia oraz azotan i
amoniak. (ograniczona ilość
fosforanów!! – nadmiar blokuje
syntezę antybiotyku)
Geny –czynnik A ->
metabolizm szczepu
Szczepy
Streptomyces są wykorzystywane na
skalę przemysłową do produkcji
innych antybiotykow
(chlorotetracyklina, chloramfenikol,
neomycyna, kanamycyna). Przy
użyciu tych szczepow produkowane
są również fungicydy, insektycydy i
herbicydy. Trwają intensywnie
badania do ich wykorzystania w
walce z nowotworami i wirusami.
Bioremediacja – jest to technologia
usuwania zanieczyszczeń z gleby i
zasobów wodnych za pomocą
żywych mikroorganizmów w celu
degradacji lub przynajmniej
transformacji rożnego rodzaju
zanieczyszczeń w formy mniej
szkodliwe. W bioremediacji
wykorzystuje się naturalne zdolności
mikroorganizmów do rozkładu
związków toksycznych.
Najczęstsze zanieczyszczenia
usuwane z wykorzystaniem
mikroorganizmów to:
- związki ropopochodne zarówno
alifatyczne, cykliczne, aromatyczne
jak i poliaromatyczne.
- Pestycydy – szczególnie te
produkowane w latach 1950-1970 r.,
które zalegają do dziś w gruntach.
- Fenole (oczyszczanie wody pitnej)
- Dioksyny – powst. podczas spalania
rożnego rodz. materiału
biologicznego np. drewna, kości
- Chlorowcopochodne –
węglowodorów aromatycznych
(bifenyle)
Dwie ostatnie grupy to związki
najbardziej toksyczne. Dbamy o to by
było ich jak najmniej w środowisku.
Bioremediacja jest
procesem podpatrzonym: Rodzaje:
- Naturalna (podstawowa) –
wykorzystuje naturalne zdolności
ekosystemu do degradacji substancji
toksycznych, trwa długo kilka
kilkadziesiąt lat.
- Inżynieryjna – wspomagana przez
człowieka
+Biostymulacja – polega na
stworzeniu warunków sprzyjających
rozwojowi mikroflory naturalnej,
która zaangażowana zostaniew
rozkład zanieczyszczeń; zapewnienie
odpowiedniej wilgotności, dostępu
tlenu, substancji biogennych (źródło
azotu, fosforu), podregulowanie pH i
ewentualnie zmiany temperatury.
+Bioaugmentacja – obejmuje zabiegi
biostymulacji jak również inokulację
zanieczyszczonego miejsca
wyselekcjonowaną mikroflorą,
aktywną w stosunku do
zanieczyszczeń. Te kultury
starterowe określa się terminem
biopreparaty są to zwykle mieszaniny
kultur trzech – sześciu rodzajów
bakterii wyselekcjonowanych w
laboratoriach pod kątem określonych
grup związków np. węglowodory
polliaromatyczne (trudno ulegajace
degradacji).Procesy bioremediacji
dzielimy również na:
- In situ – dotyczą oczyszczaania w
miejscu wystąpienia zanieczyszczenia
- Ex situ – stosowane są wówczas gdy
oczyszczanie gruntu czy wód na
skutek wysokiej toksyczności
zanieczyszczeń i możliwości
rozprzestrzenienia się
zanieczyszczenia nie jest możliwe.
Zanieczyszczony grunt musi być jak
najszybciej usunięty z tego miejsca
i oczyszczanie prowadzone jest w
miejscu do tego przeznaczonym,
bezpiecznym.
Technologia bioremediacji nie jest
procesem, który można zastosować
zawsze i wszędzie. Dotyczy
określonego typu zanieczyszczeń,
występujących w danym zakresie
stężeń, pewne ograniczenie stanowią
rownież warunki klimatyczne i
geograficzne.
BIOTRANSFORMACJA
Transformacja – przekształcenie,
przeobrażenie.
Biotransformacja to jednoetapowe
(rzadziej dwuetapowe)
przekształcenie chemiczne
egzogennych związków organicznych
w strukturalnie im podobne produkty
dokonywane przez żywą komórkę.
Powstający produkt w
biotransformacji może być szkodliwy
dla komórki np. produkty
biotransformacji steroidów.
Biotransformacja nie jest celem
działania komórki; zachodzi ona
często jako proces niezależny od jej
funkcji życiowych. Biotechnolog
wykorzystuje naturalny aparat
enzymatyczny komórki, podstawia jej
pewne związki organiczne i oczekuje,
że zostaną one przekształcone
zgodnie z jego przewidywaniami.
Biotransformacja jest
procesem (reakcją) wysoce
specyficzną pod względem: kierunku,
swoistości substratowej oraz
stereospecyficzności.
Stereospecyficzność. Wiele
enzymów rozróżnia izomery
i wykazuje aktywność katalityczną
wyłącznie w stosunku do jednej z
odmian izomerycznych związku lub
też tworzy jedynie jedną z nich, np.
cis lub trans, α- lub β-, D- lub L-, itp.
Klasycznym przykładem jest
dehydrogenaza bursztynianowa,
która przekształca bursztynian do
fumaranu Można uznać, że w wielu
przypadkach „komórka nawet nie
zdaje sobie sprawy z tego, że zostaje
oszukana i wykorzystana do
przekształcenia podsuniętego jej
związku organicznego”.
Przykładem może być
reakcja kondensacji. Podstawia się
komórce egzogenny związek a
komórka nieświadomie kondensuje
go z naturalnym metabolitem
występującym w komórce np.
acetylo~SCoA. Tym egzogennym
substratem może być np. anilina:
Progesteron -
Progesteron jest syntetycznie
otrzymywanym naturalnym
hormonem ciałka żółtego jajnika. W
lecznictwie progesteron stosowany
jest zapobiegawczo przy ryzyku
poronienia, niewydolności ciałka
żółtego, zatruciu ciążowym,
zaburzeniach miesiączkowania.
Biotransformacje są odwracalne –
metody i sposób prowadzenia reakcji
wpływa na jej kierunek. np. Oksydaza
glukozowa (enzym) – technologia
Glukonolakton rzadko jest
wykorzystywany, częściej jego
pochodne mają szerokie
zastosowanie jak np.
glukoniansodowy lub glukonian
wapnia. Jak otrzymywać glukonian
wapnia -> biotransformacja !! (enz.
Przekształcenie glukozy w
glukonolakton) – Acetobacter,
glukonobacter, Pseudomonas
Jest to enzym wewnątrzkomorkowy
u grzybów, ewentualnie związany z
membraną, u Pseudomonas jest to
enzym zewnątrzkomórkowy. Jest to
enzym indukcyjny, czyli w podłożu
musi być glukoza, ponieważ:
·
do indukcji enzymu
·
jest źródłem energii i węgla
·
potrzebny jest do tej reakcji
Zatem dobranie ilości glukozy jest
bardzo istotne (ok. 300 g/dm
3
, pH
6,0-6,5, ilość tlenu w podłożu zależy
od rpm i vvm (napowietrzania i
mieszania)).
Przykłady biotransformacji
Oksydaza glukozowa -
Biotransformacja glukozy do
glukonolaktonu
Szczepy Aspergillus,
Penicillium, Acetobacter,
Gluconobacter oraz Pseudomonas
wytwarzają oksydazę glukozową (EC
1.1.3.4). Enzym ten katalizuje
utlenienie D-glukozy do δ-D-
glukonolaktonu.
Enzym jest częściowo
wewnątrz-, a częściowo
pozakomórkowy. Jest to enzym
indukcyjny – induktorem jego
biosyntezy jest glukoza. Intensywnej
biosyntezie sprzyja pH 6,0-6,5 i silne
natlenienie podłoża hodowlanego.
Zastosowanie oksydazy
glukozowej:
1.do produkcji glukonianów:
- Glukonian sodowy – środek
alkalizujący (np. myjnie butelek, itp.),
- Glukonian wapniowy – lek (w
terapii wapniowe).
1.Przemysł spożywczy, analityka
biochemiczna, biosensory,
diagnostyka laboratoryjna.
Wytwarzanie
Podłoże hodowlane:
·
glukoza (stężenie >
150g/dm3),
·
namok kukurydziany,
·
PO43-,
·
NH4+,
·
Mg2+,
·
CaCO3 lub NaOH
dozowany do pH 6,0.
Temp. 30°C, hodowla wgłębna, tlen
w podłożu około 80% nasycenia, 24
godziny. 14°C - woda głębinowa do
schłodzenia po procesie
Wyodrębnianie produktu
Bacillus przetrwalnikuje i jest
obślizgły – najlepiej oddzielić go
wirowaniem. Jest to długi proces
w zależności od produktu – glukonian
wapniowy lub sodowy;
- gdy zostaje ciecz (krystalizacja, dla
cieczy ph=7),
- gdy zostaje biomasa (co z nią? 3%
bacillusa + kazeina -> do pasz; dla
odmiany gluconobacter jest
oddzielna technologia francuska)
Z biomasy izolujemy enzym.
Następnie go zatężamy (ultrafiltracja)
i suszymy (suszenie rozpyłowe)
Kwas asparaginowy
Kwas asparaginowy znalazł
zastosowanie w lecznictwie lub
przemyśle spożywczym.
Wykorzystuje się reakcję
transformacji kwasu fumarowego do
kwasu asparaginowego katalizowaną
prze amoniakoliazę asparaginianową
(aspartazę – EC 4.3.1.1.). Enzym ten
jest mało stabilny, wrażliwy na wiele
czynników pozakomórkowych.
Dlatego w praktyce stosuje się dwa
różne typy procesu
technologicznego: z
immobilizowanymi komórkami lub
immobilizowanym enzymem
Typ I technologii.
Wykorzystuje się E.coli - szczep
specjalnie wyizolowany i
udoskonalony na drodze mutacji
genetycznej o zwiększonej
produktywności aspartazy. Komórki
immobilizuje się na poliakryloamidzie
lub wg nowszego patentu na
karaginianie aktywowanym
aldehydem glutarowym i
heksametylenodiaminą [podobne
prace z subtilizyną autorstwa
Trzmiela z 1991].
B i o p r o c e s :
bioreaktor sekcyjny w kształcie
kolumny wypełniony nośnikiem
z immobilizowanymi komórkami
E.coli przemywa się przez 48 godzin
1M wodnym roztworem substratu o
pH8,5 (powolna częściowa liza
komórek) i temp. 27°C. pH8,5 sprzyja
powolnej częściowej lizie komórek,
co zwiększa przepuszczalność błony
komórkowej. Substrat dostaje się do
wnętrza komórki, gdzie zostaje
transformowany i następnie
wydzielany na zewnątrz.
Aktywatorem reakcji są jony Mg
2+
.
Typ II technologii.
Wykorzystuje się immobilizowany
enzymu. Operacyjny okres
połowicznego zaniku aktywności
immobilizowanego enzymu wynosi 2
lata. Ogólny schemat technologiczny
procesu jak w typie I.
Kwas jabłkowy
Wykorzystuje się bądź
enzym - z cyklu Krebsa - hydratazę
fumaranową (EC 4.2.1.2) lub też
komórki Brevibacterium
ammoniogenes albo B.flavum.
Komórki bakterii immobilizuje się na
żelu poliakrylo-amidowym.
Substrat: 1M
fumaran sodu, pH 7,0- 7,3 temp.
37°C, szybkość przepływu przez
kolumnę 0,2 dm3/dm3
wypełnienia/h. Wydajność procesu
70%. Aktywatorem procesu są
związki powierzchniowo czynne
(ostatnio biosurfaktanty)
zwiększające przepuszczalność błony
komórkowej.
Produktem ubocznym jest
kwas bursztynowy:
Mikrobiologiczna
biosynteza biosulfaktanty
Bisulfaktanty wytwarzane
są przez wiele grup
mikroorganizmów: bakterie, grzyby,
rośliny (saponiny), organizmy wyższe
(kwasy żółciowe, składniki śliny).
Związki te wytwarzane są dla potrzeb
komórek ułatwiając im przyswajanie
hydrofobowych substatów
(węglowodory, oleje, tłuszcze) oraz
stworzenie siedliska rozwoju
populacji (biofilm).
Podstawowy podział
biosulfaktantów:
a)związki niskocząsteczkowe –
redukują napięcie powierzchniowe
na granicy faz woda-olej i są słabymi
emulgatorami
b)związki wysokocząsteczkowe – w
niewielkim stopniu redukują napiecie
powierzchniowe, są natomiast
dobrymi emulgatorami
Typowa budowa cząsteczki
biosulfaktantu. Cząsteczka
biosulfaktantu składa się z główki
hydrofilowej i hydrofobowego
ogonka. Główka jest rozpuszczalna w
wodzie, część hudrofobowa nie jest
rozpuszczalna. Za część hydrofilową
odpowiadają grupy cukrowe,
karboksylowe, hydroksylowe. Za
zcęść hydrofobową stanowi część
węglowodorowa kwasów
tłuszczowych.(schemat) Rammolipid
niskocząsteczkowy (Pseudomonas)
najlepiej znany i wykorzystywany.
Substancja hydrofobowa
np. olej mineralny w obecności
biosulfaktantu zostaje sukcesywnie
emulgowana do mikrokropli o
wymiarach takich, że może być
wchłonięta do komórki
mikroorganizmu i tam nastąpi
asymilacja węglowodorów.
Emulgowanie do
wytworzenia makrokropli i wówczas
mikroorganizmy zdolne do degradacji
weglowodorów i wytwarzające
biosulfaktanty związane z
powierzchnią komórki mogą
zasiedlać krople substancji
hydrofobowych. Po wyczerpaniu
przyswajalnych przez nich
składników szybko odlączają się od
makrokropli, która zostaje nastepnie
zasiedlona przez inna grupę
mikroorganizmów.
Zalety biosulfaktantow w
porównaniu do związkow sztucznymi
powierzchniowo czynnymi
1.biodegradowalność - po spełnieniu
swojej funkcji substancje te są latwo
przyswajalne dla różnych
organizmów,
2.niska toksyczność, co pozwala na
ich stosowanie w kosmetyce,
farmacji i przemysle spozywczym
3.wysoka specyficzność – są to
związki kompleksowe zawierajace
określone grupy funkcyjne,
charakteryyzujące się dużą
specyficznością w stosunku do
określonych grup związków,
Mimo, że biosynteza tych
ziązków nie wymaga stosowania
kosztownych substratów i jest
stosunkowo tania to biosulfaktanty
mimo swych zalet nie wyparły jeszcze
powszechnie stosowanych
sulfaktantów syntetycznych.
Uwarunkowania
mikrobiologicznej syntezy
biosulfaktantów
1.obecność podłożu hydrofobowego
substratu
2.limitacja łatwo przyswajalnych
źródeł węgla przede wszystkim
glukozy
3.zróżnicowane wymagania odnośnie
źródła azotu, w części prac poleca się
obecność w podłożu jonów
azotanowych. Generalnie uznaje się,
że pula związków azotowych
powinna być ograniczona
4.w syntezie biosulfaktantów sprzyja
wysokie natlenienie
Biosulfaktanty w zależności od
funkcji jakie mają pełnić
produkowane są bądź w fazie
intensywnego wzrostu bądź w fazie
stacjonarnej. Zawsze ich biosynteza
uzależniona jest ściśle od warunków
hodowli.
Mikrobiologiczna synteza
węglowodorów
Dodatki stosowane aktualne do
paliw. Etanol dodawany jest do
benzyn – nie dostarcza tyle energii na
jednostkę objętości co gazolina i
powoduje korozję i jest
higroskopijny. Następny taki dodatek
to są estry kwasów tłuszczowych
dodawane do diesela. Mają
niekorzystną charakterystykę
w niskich temperaturach – powoduje
wysoką emisję tlenków azotu i
ulegają szybciej utlenieniu od
węglowodorów. Mają dobrą smar
owalność, niską emisję dwutlenku
węgla, ale zawierają związki
aromatyczne (wśród niech
kancerogenne).
C8-C35 izoprenoidy, alkany
rozgałęzione, alkeny, cykloalkany i
węglowodory gazowe (nie metan) –
tego szukamy.
Badania skamielin z przed 3mln lat
wskazują, że w miejscach
występowania ropy naftowej
współbytowały bakterie i algi, co
wskazywało na ich udział w
powstawaniu ropy naftowej.
Pierwsze wzmianki dotyczące
wytwarzania czy gromadzenia
węglowodorów przez
mikroorganizmy dot. Lat 60, jednakże
główne badania z tego zakresu
rozpoczęto od 2005 roku.
Węglowodory mogą pełnić
przeróżne funkcje biologiczne:
1.przechowywanie energii (związki
inertne biologicznie), ochrona
komórki przed czynnikami
zewnętrznymi, rola w adhezji
komórek – tworzenie aglomeratów
2.węglowodory związane z
membrana cytoplazmatyczna chronią
spory grzybni
3.alkany wydzielane poza komórkę
przez szczepy Clostridium uczestniczą
w tworzeniu kapsuł, chroniących
komórkę przed wydzielanymi przez
nie fazami.
4.Węglowodory wydzielane przez
szczepy Pseudomonas odpowiadają
za adhezję komórek do szkła i
tworzenie agregatów
5.Lotne izotreny pełnia rolę
czynników odstraszających
drapieżniki glebowe
6.Chronią przed rozwojem
konkurencyjnej mikroflory
7.Substancje izotrenowe mogą
stymulować wzrost roślin i mogą
chronić przed atakiem grzybów
8.Izotrenoidy odgrywają dużą rolę w
komunikacji bakterii, ze względu na
dużą lotność tych związków, służą
jako nośniki informacji
Jakie mikroorganizmy brane są pod
uwagę opracowania technologii
biosyntezy węglowodorów:
Cyjanobakterie
Beztlenowe bakterie fototropiczne
Gram- bakterie redukujące siarczany
Gram- względne beztlenowce
Gram+ bakterie beztlenowe
Gram+ bakterie tlenowe
Drożdże
grzyby strzępkowe
Jakie grupy węglowodorów:
alkany (C11-C35)
estry metylow (heksa-, hepta, penta
izoprenoidy (Tristan, fitan, skwalan,
skwalene
Warunki determinujące syntezę
węglowodorów:
- obecność w podłożu związku
kierunkującego na biosytnteze,
glicerol, propanol, octan, kwas
glutaminowy izoleucyna i walina
- zalecana jest limitacja źródła azotu
- ograniczenie dostępu światła
(fotobakterie) i tlenu (bakterie
względnie beztlenowe i drożdże)
Ważnym problemem uznaje się, że
nie możliwe jest opracowanie
wydajnej technologii produkcji
węglowodorów w oparciu o ich
mikrobiologiczną syntezę. Trwają
natomiast intensywne zadania nad
znalezieniem genów
odpowiedzialnych za tą syntezę, a
następnie możliwe będzie
skonstruowanie szczepów
prawdopodobnie bakterii, których
będą intensywnie wydzielały
określone grupy węglowodorów.
Rokuje się również, że jako pierwsze
opracowana będzie technologia
produkcji węglowodorów, które
zastąpią olej diesela, nieco dłużej
trwać będzie opracowanie
technologii syntezy węglowodorów
wchodzących w skład gazolin
(benzyn). Znanych jest kilka grup
biosyntezy węglowodorów
(biosyntezy n-alkanów) i do najlepiej
znanych należy:
1.droga elongacji - patrz synteza
kwasów tłuszczowych
2.szlak nazywany head-to-head
(schemat)
a-D-glukopiranoza
OH
O H
H
H
H
OH
H
H
HO
CH
2
OH
C
C
O
C
C
C
1
2
3
4
5
6
OH
H
H
OH
H
H
HO
CH
2
OH
C
C
O
C
C
C=O
O
2
H
2
O
2
d-D-glukonolakton
oksydaza
glukozowa
K
CH COOH
HC
HOOC
fumaran
NH
3
aspartaza
CH COOH
CH
2
H
2
N
COOH
kwas asparaginowy
CH COOH
HC
HOOC
fumaran
hydrataza
fumaranowa
CH COOH
CH
2
COOH
HO
kwas jabkowy
H
2
O
CH COOH
HC
HOOC
fumaran
FADH2
FAD
dehydrogenaza
bursztynianowa
CH COOH
CH
2
COOH
kwas bursztynowy
2