Ćwiczenie XI
Procesy życiowe drobnoustrojów – wykrywanie produktów metabolizmu
Szczepy bakteryjne:
1. Staphylococcus albus
2. Escherichia coli
3. Salmonella typhimurium
4. Proteus vulgaris
5. Enterobacter aerogenes
Ćwiczenia wykonujemy niejałowo
1. Wykrywanie acetoiny i kwasów organicznych
Odczyn Voges-Proskauera – do wykonania ćwiczenia wykorzystuje się 24 godz. hodowle w/w szczepów w płynnym podłożu Clarka. Do krótkich probówek pobrać po 1 ml hodowli
i dodać 0,6 ml 5% r-ru α naftolu w 96% etanolu, wymieszać i dodać 0,4 ml 40% KOH
z dodatkiem 0,3% kreatyny. Wstrząsnąć energicznie i wstawić do cieplarki (37°C) na
30-40 min.
Wstąpienie czerwonego zabarwienia (pierścienia) w górnej części płynu oznacza wynik dodatni. W przypadku wyniku ujemnego podłoże nie zmieni barwy lub daje zabarwienie pomarańczowe.
Odczyn polega na wykrywaniu w hodowli acetoiny, stanowiącej jeden z produktów rozkładu glukozy. Acetoina w środowisku alkalicznym (KOH), w obecności tlenu atmosferycznego i kreatyny, utlenia się do diacetylu, który w obecności α naftolu reaguje z guaniną pochodzącą z peptonu dając czerwone zabarwienie (wynik dodatni).
Odczyn z czerwienią metylową MR (Methyl Red) – próba pozwala na wykryć gromadzenia się w hodowli kwasów organicznych. Do 1 ml hodowli w podłożu Clarka dodaje się 1-2 krople wskaźnika (0,1 g czerwieni metylowej + 300 ml 96% etanolu). W wyniku rozkładu glukozy powstają kwasy organiczne, obniżając pH hodowli.
Zabarwienie czerwone oznacza wynik dodatni, zabarwienie żółte ujemny.
Podłoże Clarka
fosforan potasu dwuzasadowy 0,5 g
pepton 5,0 g
glukoza 5,0 g
woda do 1000 ml
2. Wykrywanie amoniaku (próba Nesslera)
Do krótkich probówek pobrać po 2 ml hodowli szczepów w bulionie LB dodać kilka kropli 50% r-ru winianu sodowo-potasowego oraz parę kropli odczynnika Nesslera. W obecności NH3 powstaje zabarwienie od jasnożółtego do brązowego.
Odczynnik Nesslera:
(A) NaOH 85 g
H2O 800 ml
(B) sól Nesslera (odczynnik jodowo-rtęciowy) 68 g
H2O 800 ml
3. Wykrywanie indolu
Posiej badane szczepy. Po kilku dniach inkubacji bakterii w bulionie tryptofanowym wykrywa się obecność indolu wg metody Kovácsa.
Hodowlę nawarstwić (wlać delikatnie po ściance probówki) 0,3-0,5 ml odczynnika Kovácsa.
Odczynnika Kovácsa (odczynnik ma kolor słomkowy):
p-dwumetyloaminobenzaldehyd 5 g
alkohol amylowy lub izoamylowy 75 ml
HCl stęż. 25 ml
W obecności indolu pojawia się po kilku sekundach czerwony pierścień na granicy płynów, a później cała objętość nawarstwionego odczynnika zabarwia się na czerwono.
Bulion tryptofanowy (pH 7,5):
pepton 10 g
NaOH 6 g
DL tryptofan 1 g
H2O 1000 ml
4. Wykrywanie fosfatazy
Po inkubacji bakterii w bulionie z dodatkiem odczynnika na fosfatazę (sól sodowa kwasu fenoloftaleinofosforowego) dodaje się 1-2 krople 10% r-ru NaOH. W przypadku wytwarzania fosfatazy podłoże zabarwia się na kolor amarantowy wskutek obecności fenoloftaleiny odszczepionej przez fosfatazę od kwasu fenoloftaleino fosforowego.