Mikrobiologia

Hodowla i identyfikacja

bakterii

Metody stosowane w

diagnostyce

• Mikroskopowa

– Bezpośrednia– z materiału pobranego od

pacjenta

• Hodowlana na mikroskop– z materiału od

pacjenta i hodowla na podłożach

• Immunologiczna– serologiczna
• Biochemiczne
• Oparte na biologii molekularnej
• Ocena lekowrażliwości
• Biologiczne – eksperymenty na zwierzętach

• Mikroskopowe

– Z krwi na szkiełko podstawne

nakroplić krew i szkiełko nakrywne –
bezpośrednie

– Z hodowli 24h 37 stopni C na

podłożu mikrobiologicznym.
Wykonanie preparatu z
drobnoustrojami po dobie
nakraplamy na szkiełko nakrywne,
zakraplamy i wykonujemy zawiesinę.

• Mikroskop świetlny

Barwienie

• Bezpośrednie

– Barwienie Waysona

• Pośrednie

– Otoczki

• Gramma, Burri – Ginsa

– Przetrwalniki

• Dornera, Wirtza– Canklina

– Bakterie kwasopochodne

• Ziel– Nielsa

Metody hodowlane

• Hodowla na odpowiednim podłożu
• Ocena morfologii:

– Kształt, wielkość, zapach, kolor

• Kolonii
• Pojedynczej komórki

• Badanie cech metabolicznych kolonii,

zdolności do:

– Rozkładu laktozy
– Wzrostu w warunkach beztlenowych
– Hemolizy

Podłoża

• Cechy charakterystyczne:

– Odpowiednia zawartość składników

odżywczych

– pH
– Jałowe
– Jednorodne klarowne

• Podział ze względu na konsystencję

– Płynne – płyn mózgowo-rdzeniowy
– Półpłynne (0,5- 1% agaru)
– Stałe (1,5- 3% agaru)

• Podłoża w probówkach i na płytkach

stałe/półpłynne –agar

Ze względu na substancje

odżywcze

• Zawartość

– Syntetyczne

• Skład całkowicie zdefiniowany

– Półsyntetyczne

• Skład częściowo zdefiniowany

– Naturalne

• Skład zdefiniowany w przybliżeniu

Ze względu na substancje

odżywcze

• Ilość i jakość

– Proste

• Woda peptonowa
• Bulion mięsny
• i.t.p

– Złożone

• Agar 5%
• Krew barania

Wybiórczo– namnażające

• Rosną na nich określone drobnoustroje
• Podstawą są podłoża proste lub

wzbogacone do których dodawane są
sub. przyśpieszające wzrost
drobnoustrojów, a spowalniające lub
uniemożliwiające wzrost innych

– Np. bulion z żółcią do hodowli Salomnelli;

hamuje wzrost bakterii Gramm+

Wybiórczo– różnicujące

• Rosną bakterie, które różnicuje się na

drodze właściwości biochemicznych

• Podłoże Chapmana dla gronkowców

(Staphylococus)

– Czynnik wybiórczy 7% NaCl (chamuje

wzrost drobnoustroujów

– Czynnik różnicujący mannitol – różnicuje

gronkowce mające zdolność rozkładu

mannitolu

• Gronkowiec złocisty rosnąc odbarwia

pożywkę na żółto

• Podłoże Mac Conkeya dla pałeczek

Gramm- z rodziny Enterobacteriace

– Czynnik wybiórczy dezoksylan sodu

fiolet krystaliczny – hamuje wzrost
bakterie Gramm+

– Czynnik różnicujący laktoza

• bakterie rozkładające laktozę tworzą

głównie zabarwione kolonie, Np.
Esccherichna Coli

• Bakterie nie rozkładające laktozy

odbarwienie (przeźroczyste) podłoże

Podłoże dla paciorkowców

kałowych Enterococus

• Czynnik wybiórczy azydek sodu

– Wzrost paciorkowców

pomarańczowych

• Czynnik różnicujący eskulina

– Rozkładana przez Enterococus

faecalis daje czarne zabarwienie
podłoża

Podłoże z cytrynianem

PAY

• Dla Pseudomonas aeruginosa
• Zabarwienie żółte lub zielone o

zapachu kredek świecowych

Podłoża specjalne

• Hodowla drobnoustrojów

wybrednych o specjalnych

właściwościach

• Saburada dla grzybów

– Obniżone pH
– zawiera antybiotyki

• Cyklocheksamid
• Chloramfenikol

– Glukoza

• Agar czekoladowy
• Hemophilius, Barwienie Neissera

– Zawiera zhemolizowaną krew

baranią

• Otrzymuje się przez zagotowanie agaru

z krwią przez co wyzwalają się czynniki
wzrostu V-hemina i X-neadyna

• Podłoże Löffela– zawiera ściętą

surowicę końską

– Maczugowiec błonicy

Corynebacterium

diphtheriae

• Podłoże Lowensteina

– Prątek gruźlicy

Mycobacterium

tuberculosis

– Zawiera zieleń malchitową, która

chamuje wzrost innych bakterii

• Bulion z tiaglikoalem

– Do hodowli beztlenowców

• Podłoże transportowe

– Przeżycie baterii w czasie transportu

• Podłoże transportowo – namnażające

– Umożliwia namnażanie się bakterii w czasie

transportu

• Podłoże krwawe– agar z krwią baranią

5%

– Dla większości drobnoustrojów
– Zdolność do hemolizy– rozkładu erytrocytów

• Hemoliza α częściowa –zielone zabarwienie wokół

koloni Streptococus pneumonie

• Hemoliza β całkowita– przejaśnienie wokół kolonii

Streptocus peogenes

• Hemoliza γ brak – Gamma-

Metody immunologiczne

• Na reakcję antygen (Ag)– przeciwciało

(Ig)

• Stosowane w diagnostyce chorób

zakaźnych

• Iloścowo lub jakościowo do wykrywania

antygenów lub przeciwciał w surowicy

• Rodzaje metod immunologicznych

– Bezpośrednie połączenie antygenu z

przeciwciałem

– Odczyny radioimmunologiczne i

immunoenzymatyczne

Precypitacja

• Precypitygen (Ag)+ precypityna (Ig)precypitiat

(strąt)

• Dwa etapy

– Ig + Ag = hydrofobowy kompleks
– Ig + Ag = kompleks precypitiat (strąt)

• Precypitacja pierścieniowa pojedyńcza

– Immunodyfuzja precypitacja na żelu agarowym
– Jeden z reagentów w agarze drugi nakraplamy

• Precypitacja podwójna

– Oba reagenty drobnoustroju (Ig, Ag) nakraplamy na

agar.

– W miejscu spotkania gdzie ich stężenie jest równe

obserwujemy linie i łuki precypitacyjne

• Immunoelektroforeza

– Dyfuzja z przeciwciał i antygenów na żelu za pomocą

elektroforezy

Aglutynacja= agregacja

cząstek

• Aglutyniny (Ag) + Aglutynogeny (Ig) =

Aglutyna

• Fazy aglutynacji

– Swoista agregacja
– Faza nieswoista

• Aglutynacja bezpośrednia

– Ig reaguje z Ag występującym wyłącznie

na powierzchni komórek

• Szkiełkowa (metoda jakościowa i ilościowa)
• Mikroaglutynacja probówkowa
• Np. Aglutynacja bakteryjna

Aglutynacja

• Pośrednia– bierna

– Ag nie jest częścią komórki
– Ig reaguje z Ag rozpuszczonym i

opłaszczonym na odpowiednim nośniku

• Np. Aglutynacja lateksowa (Aglutyniny na

lateksie) szybka bardzo czuła metoda służąca

do wykrywania Ig skierowanego przeciwko Ag

(opłaszczonym na lateksie) w materiale

biologicznym

• Hemoaglutynacja bezpośrednia

– Krwinki zawierają antygen (Ag) przeciw

któremu są skierowane przeciwciała (Ig)

• Grypa
• Mononukleoza zakaźna

Zastosowanie znaczników

• Wyznakowanie jednego ze zaczników

reakcji Ag– Ig

• Służą do ilościowego oznaczania Ig, Ag
• Są to metody bardzo czułe

• Radioimmunologiczne– w których

jeden z reagentów znakowany jest

izotopem promieniotwórczym Np. I

125

• Imonnofluorescencyjna– znakowanie

fluorochromem

• Immunoenzymatyczna– aktywny

enzym np. pyroksydaza chrzanowa

Metody biochemiczne

• Hodowle na pożywkach

– Podłoże Mac Conkeya

• Pałeczki lakozofilne tworzą kolonie różowe
• Pałeczki laktozo – tworzą bezbarwne kolonie

(odbarwienie podłoża)

–

Wykrywanie katalazy

• Na szkiełko z 0,9% NaCl nakraplamy

bakterie z koloni (hodowla) i dodajemy

wodę utlenioną. Obserwujemy efekt

pienienia

– Bakterie rozkładające katalazę– pienienie

np. gronkowce

– Bakterie nie rozkładające katalazy – brak

pienienia np. paciorkowce Streptococus

• Wykrywanie oksydazy

– Na kolonię nakraplamy odczynnik Kovàsca

• Jeżeli kolonia zabarwi się na niebiesko mamy

do czynienia z bakteriami oksydacyjnymi

• Jeżeli nie odbarwi się bakterii nie są

oksydacyjne

• Szeregi biochemiczne IP i API

– Miniprobówki lub wgłębienia na 24h 37° C

inkubacja

• API– miniprobówki + klucz
• IP– wgłębienia+ komputer

• Test MIR do wykrywania obecności

ureazy i zdolności do syntezy indolu

z tryptofanu

– Obecność ureazy – brunatne

zabarwienie podłoża zawierającego

mocznik

– Synteza indolu z tryptofanu – czerwony

pierścień w wierzchniej części pożywki

• Escherichna coli –(ureaza)+
• Proteus vulgaris +(ureaza)+
• Enterobacter -(ureaza)-
• Proteus mirabilis +(ureaza)-

Metody biologii

molekularnej

• Metody amplifikacji

– Sondy molekularnej i matrycy PCR

• Wykorzystanie matrycy molekularnej i

powielanie fragmentu DNA lub RNA
drobnustroju

• Potrzebne są do tego komplementarne

polimerazy

• Etapy

– Denaturacja DNA lub RNA (dwu niciowe)
– Przyłączenie primerów
– Elongacja( synteza) łańcucha DNA

• Namnożenie tylko fragmentu potrzebnego do

elektroforezy na żelu

Ocena lekowrażliwości

• Wykonuje się na podłożu do

wykrywania antybiogramów

– Podłoże Miderhintona
– Krążki z antybiotykiem ok. 6

• Każdy z innym

– Posiewamy badany przez nas

drobnoustrój i inkubujemy doba 37°C

– Obserwujemy stopień rozwoju

drobnoustroju w pobliżu krążków