Metody

immunochemiczne w

endokrynologii

Monika Biguszewska

Kamil Górski

V rok Analityki Medycznej

Metody immunochemiczne

Są to metody polegające na reakcji

antygenu ze swoistym przeciwciałem w

wyniku czego powstaje kompleks antygen

– przeciwciało. Stosowane są różne

znaczniki i różne sposoby detekcji

pozwalające na pomiar ostatecznego

produktu reakcji.

Antygen

(immunogen) jest to białko lub

substancja niebiałkowa (hapten), która

wprowadzona do obcego organizmu

powoduje wytworzenie przeciwciał u

gospodarza.

Przeciwciała

są to immunoglobuliny

najczęściej klasy IgG. Wyróżniamy:

-monoklonalne produkty pojedynczych

klonów komórek

-poliklonalne mieszanina przeciwciał

różniących się powinowactwem wiązania,

mających różną swoistość

Metodami immunochemicznymi

najczęściej oznaczane są:

1. Białka i peptydy
2. Markery

uszkodzenia tkanek

3. Hormony

niebiałkowe

4. Leki
5. Witaminy

Podział metod

immunochemicznych

1. Metody z ograniczoną ilością odczynnika

(kompetycyjne) np. metoda

radioimmunologiczna (RIA)

2. Metoda ze znakowanym przeciwciałem, z

ograniczoną ilością odczynnika np.

metoda chemiluminescencyjna

3. Metoda służąca do bezpośredniego

pomiaru ilości kompleksu

immunologicznego np. metoda

strąceniowa, turbidymetryczna

Podział metod

immunochemicznych

4. Metoda w której wszystkie odczynniki są

w nadmiarze z jednym reagentem

znakowanym (np. metoda kanapkowa)

5. Metoda ilościowa do oznaczania

swoistych przeciwciał

6. Metoda, w której zmianę aktywności

znacznika obserwuje się po związaniu

przeciwciała z analitem (metoda

homogenna)

Metoda z ograniczoną ilością

odczynnika

Precyzja i dokładność oznaczenia zależy

od: dokładnego pipetowania antygenu

znakowanego i przeciwciała

wychwytującego, jak również próbki

badanej.

Metody z nadmiarem

odczynnika

W metodzie z nadmiarem odczynnika

(przeciwciała) istotne jest TYLKO

precyzyjne odmierzenie próbki.

Metody hetero i homogenne

Metody immunochemiczne (kompetycyjne i

niekompetycyjne) wymagają rozróżnienia

formy wolnej antygenu od formy

związanej z przeciwciałem.

Metody hetero i homogenne

W metodach homogennych rozróżnienie to

dokonuje się poprzez zmianę właściwości

fizykochemicznych znacznika po

połączeniu się antygenu ze znakowanym

przeciwciałem.

W metodach heterogennych rozróżnienie to

dokonuje się poprzez odpłukanie

niezwiązanych antygenów od form

związanych z przeciwciałem na fazie

stałej.

Metody bez znacznika

Do tych metod należą:

immunoelektroforeza, immunodyfuzja

radialna, metody nefelometryczne,

turbidymetryczne i strąceniowe.

Punktem końcowym tych metod jest

bezpośredni pomiar kompleksu

immunologicznego zarówno ilościowo jak i

jakościowo.

Są to jednak metody mało czułe w

badaniach endokrynologicznych.

Metody ze znacznikami

Stanowią szeroką gamę metod, znacznik

może być połączony zarówno z

antygenem jak i przeciwciałem.

Zależnie od rodzaju użytego znacznika

konieczne jest zastosowanie odpowiedniej

aparatury pomiarowej.

Rodzaje znaczników

1.Radioizotopy np. I – 125, Co – 57

2. Enzymy np. fosfataza alkaliczna,

peroksydaza chrzanowa.

3. Substancje spokrewnione z enzymami np.

inhibitor cholinoesterazy.

4. Substancje fluoryzujące np. pochodne

kumaryny, fluoresceina.

5. Ligandy np. pochodne biotyny, awidyna.

Błędy w metodach

immunochemicznych

1. Błędy manipulacyjne, instrumentalne np.

pipetowanie, przemywanie, dekantacja,

niestabilność aparatury.

2. Zbyt wysoki poziom wiązań nieswoistych

między antygenem a przeciwciałem.

3. Statystyczny błąd wynikający z samej

metody.

Całkowity błąd w metodach

immunochemicznych jest wypadkową w/w

błędów.

Błędy w metodach

immunochemiczny

ch

Błędy interpretacji

spowodowane

fałszywie dodatnimi

lub fałszywie

ujemnymi wynikami,

jeśli są nierozpoznane

mogą prowadzić do

nieodwracalnych i

poważnych

konsekwencji dla

pacjenta.

Metody immunochemiczne są bardzo

powszechne.

Duża różnorodność stosowanych metod

(RIA, IRMA, ELISA, EIA),które nie zawsze

cechują się taką samą swoistością i

czułością a także podatność na

interferencje powodują

nieporównywalnośc wyników w różnych

laboratoriach.

Materiał biologiczny zawiera różne stężenia

substancji pochodzenia endo- i

egzogennego, które mogą wpływać na

ostateczny wynik. To z kolei obniża jakość

procesu diagnostycznego, może

prowadzić do błędnej diagnozy.

Błędy przedanalityczne

Błędy fazy przedanalitycznej są

najczęstszym źródłem

wszystkich błędów laboratoryjnych

stanowią około

50-70%

Niektóre błędy wynikają z nieprzestrzegania

procedur przedanalitycznych. Dla każdego

hormonu procedury te powinny być

przestrzegane jednakże w praktyce

lekarze, osoby pobierające materiał często

o tym fakcie zapominają.

Błędy przedanalityczne

1. Wiek i płeć pacjenta:

stężenie wielu

hormonów zmienia się z wiekiem,

największe problemy występują u

niemowląt i noworodków:

-w tym okresie zachodzą zmiany

adaptacyjne do życia pozałonowego,

-z obecnością hormonów pochodzących od

matki,

-niedojrzałość wielu układów

enzymatycznych

Błędy przedanalityczne

•

W okresie

dojrzewania (burza

hormonów)

trudności z

interpretacją GH,

FSH, LH, estrogenów

i testosteronu

•

Menopauza i

andropauza –

zmiany w stężeniach

Błędy przedanalityczne

2. Stres:

wpływ stresu należy uwzględnić

przy interpretacji poziomu hormonu

wzrostu, prolaktyny, kortyzolu.

Długotrwały stres może mieć wpływ na

stężenie białek wiążących (zmiany we

frakcji wolnej hormonów)

3. Dieta:

stężenie hormonów jest

uzależnione od częstości, rodzaju i czasu

przyjmowania pożywienia.

Błędy przedanalityczne

4. Masa ciała:

stężenie hormonów np.

insuliny i kortyzolu może być rożne u ludzi

otyłych i nie otyłych.

5. Czas pobrania materiału:

wahania

dobowe wydzielania hormonów np.

kortyzol, hormon wzrostu.

6. Zmiany sezonowe:

różny poziom np.

witaminy D w okresie letnim i zimowym.

7. Postawa ciała:

pobieranie materiały

powinno odbywać się w pozycji siedzącej

po 15 min odpoczynku.

Błędy przedanalityczne

8. Rodzaj materiału i

warunki pobrania:

surowica lub

osocze.

9. Warunki

transportu,

przechowywania i

wstępne

przygotowanie

próbek.

Błędy analityczne

1. Błędy manualne.

2. Rodzaj zastosowanych odczynników.

3. Brak powtarzalności procedur.

4. Jakość odczynników i ich sposób

przechowywania.

5. Brak należytej kontroli jakości (wzorców,

kalibratorów itp.)

6. Proteoliza, czyli uszkodzenie hormonów

peptydowych na skutek działania

enzymów proteolitycznych obecnych we

krwi.

7. Obliczenia matematyczne.

Interferencje w metodach

immunochemicznych

1. Efekty matrycowe:

im mniejsza jest

objętość próbki, tym mniej wprowadza się

do mieszaniny reakcyjnej dodatkowych

składników, które mogą interferować.

2.Heterogenność

próbek:

-obecność prekursorów lub fragmentów

hormonalnych np. proinsulina

-narządowe różnice w strukturze hormonów

Heterogenność

próbek c.d.

-różnice w strukturze lub/i pofałdowaniu

hormonów wytwarzanych przez gruczoł

-różnice w modyfikacjach

posttranslacyjnych

-występowanie hormonów w kilku formach

molekularnych

-różnice wynikające ze zmian chemicznych,

np. deaminacja hormonu, utlenianie,

polimeryzacja.

Reakcje krzyżowe

Efekt niskiej dawki

• Pojawia się w metodach kompetycyjnych

(konkurencyjnych)

• Przy niskich stężeniach analitu procent

wiązania może być wyższy niż procent

wiązania dla próbki niezawierającej

analitu

• Jest to wynik niskiej czułości metody lub/i

stosowania przeciwciał o niskiej swoistości

Efekt wysokiej dawki (efekt

Hooka)

Charakteryzuje się uzyskiwaniem bardzo

niskich wartości stężeń hormonów, mimo

że w rzeczywistości stężenie jest

ekstremalnie wysokie. Efekt ten pojawia

się najczęściej w jednoetapowych

metodach immunochemicznych, w

których przeciwciało wychwytujące,

antygen i przeciwciało znakowane

dodawane są równocześnie do mieszaniny

reakcyjnej.

Efekt wysokiej dawki (efekt

Hooka) c.d.

W przypadku bardzo

wysokich stężeń

antygenu, oba

przeciwciała wiążą się z

antygenem, co

uniemożliwia

wytworzenie kompleksu

warstwowego:

przeciwciało

wychwytujące –

antygen – przeciwciało

znakowane.

Autoprzeciwciała

Dla wielu substancji

stwierdzono

obecność

endogennych

autoprzeciwciał np.

dla T3, T4, czy

insuliny.

Przeciwciała heterofilowe

Stanowią grupę słabo zdefiniowanych

przeciwciał, które reagują z szerokim

spektrum antygenów.

Źródła przeciwciał heterofilnych:

-choroby autoimmunizacyjne

-szczepienia

-infekcje wirusowe

-alergie

-specjalne diety

-medycyna niekonwencjonalna

-zakażenia E.coli

Wpływ leków

Leki mogą wpływać na syntezę,

wydzielanie, działanie czy wydalanie

hormonów.

Np. hamowanie wiązania T4 i T3 z białkami

(salicylany, fenytoina, furosemid)

Inne rodzaje interferencji

Zmiany konformacyjne miejsca wiązania

mogą być spowodowane zmianą siły

jonowej, pH środowiska reakcji, obecność

rozpuszczalników organicznych.

Identyfikacja interferencji

1.Użycie różnych metod badawczych do

oznaczeń tej samej próbki.

2. Ocena typowych czynników

interferujących jak: lipemia, hemoliza,

bilirubinemia.

3. Korzystanie z porównania wyników

pacjenta uzyskanych obecnie z wynikami

poprzednimi.

Identyfikacja interferencji

4. Porównanie fizjologicznie zależnych

zmiennych np. brak odwrotnej zależności

między TSH i FT4.

5. Ekstremalne odchylenie od wartości

prawidłowych.

6. Brak zgodności wyniku ze stanem

klinicznym pacjenta.

7. Po wykonaniu serii rozcieńczeń materiału

stwierdza się brak liniowości.

Przyszłość metod immunochemicznych

to nie tylko rozwiązania

metodologiczne, ale przede

wszystkim prawidłowa interpretacja

wyników, w której każdy lekarz i

diagnosta laboratoryjny powinien

brać czynny udział.

DZIĘKUJEMY ZA

UWAGĘ!!!