Wykład 4 dr Piasecka-Kwiatkowska 21.02.2007r
Temat: Metody immunochemiczne i ich zastosowanie w przemyśle spożywczym.
1.Wymagania dotyczące metod stosowanych w analizie żywności:
specyficzność
powtarzalność
czułość
szybkość
możliwość analizy równocześnie dużej liczby próbek
2.Metody immunochemiczne - są to metody pomiaru reakcji antygen -przeciwciało, wykorzystujące specyficzne oddziaływania pomiędzy tymi reagentami.
3.Aspekty stosowanych metod immunochemicznych w przemyśle spożywczym:
bezpieczeństwo
technologia
pochodzenie
4.Bezpieczeństwo żywności.
zanieczyszczenia biologiczne
-bakterie
-grzyby
-toksyny
-owady
-wirusy
zanieczyszczenia chemiczne
-pestycydy
-leki weterynaryjne
-hormony
-związki ropopochodne
składniki alergenne
składniki antyżywieniowe
-inhibitory
-antywitaminy
-glukozynolany
5.Przykłady komercyjnie dostępnych testów do oznaczania:
-Salmonella
-Listeria
-E.coli
6.Zalety stosownych metod immunochemicznych do oznaczania biologicznych zanieczyszczeń żywności:
-brak wyników fałszywie negatywnych
-minimalna liczba wyników fałszywych pozytywnych
- czułość na poziomie 1jtk/25g próbki
-znacząco krótszy czas wykonania oznaczenia
-niewymagana obecność personelu z zaawansowanym wykształceniem analitycznym
-jednoznaczny, prosty w interpretacji wynik
7.Przykłady dostępnych testów ELISA do oznaczania mikotoksyn w żywności:
-aflatoksyny 1-20 ppb
-aflatoksyny M1 5-100 ppt
-ochratoksyny A 2-40 ppb
-fumonizyny 250-25000 ppb
-deoxynivalerolu 0,25-5 ppm
-zearalenonu 40-1000 ppb
-T - 2 75-500 ppb
8.Co to jest 1 ppb?
-1 cząsteczka na 1.000.000.000
-1 sekunda w ciągu 32 lat
-1 ziarenko w 22 kg piasku
-1 ziarno kukurydzy na 3,5 wagonu kolejowego kukurydzy
-1 roślina kukurydzy na polu kukurydzy o powierzchni 16187,4ha
9. Przykłady dostępnych testów ELISA do oznaczania alergenów w żywności:
-gluten 10-200 ppm
-orzechy ziemne 1-20 ppm
-mleko 1,6-25 ppm
-sezam 6-100 ppm
-soja 0,35-7%
-jaja 0,5-10 ppm
-β-laktoglobulina 1-5 ppm
-migdały 1-5 ppm
-krewetki 0,05-0,5 ppm
-orzechy laskowe 0,5-5 ppm
10.Ocena technologiczna.:
przemysł zbożowy
-ω - gliadyny
-zawartość pentozanów
-wartość wypiekowa
b)przemysł piwowarski
-jednorodność kiełkowania jęczmienia
-białka odpowiedzialne za pienistość
c)przemysł mleczarski
-zawartość białek ważnych dla serowarstwa
-zawartość produktów degradacji białek
d)przemysł mięsny
-analiza białek modyfikowanych
-znaczniki jakości mięsa
11. Pochodzenie -traceability, (czyli zafałszowania)
a)odmiana zboża
-pszenica durum czy vulgare
-jęczmień jary czy ozimy
b)rodzaj mleka (uczulone dzieci)
-mleko kozie, krowie czy owcze
c)rodzaj mięsa
-wieprzowina, wołowina, drób, konina, itp.
d)GMO
12. Zalety stosowanych immunooznaczeń w analizie żywności:
-specyficzność
-czułość
-możliwość szybkiej analizy dużej liczby próbek
-odpowiednie dla złożonych biologicznych matryc, jakimi jest żywność
13.Przeciwciała (immunoglobuliny) - cząsteczki glikoproteiny wytwarzane przez plazmatyczne komórki limfocytów B, po wtargnięciu do organizmu intruza (antygenu) zdolne do swoistego wiązania antygenu.
14.Antygeny (immunogenny)są to obce makrocząsteczki, zdolne do wywołania tworzenia się przeciwciał. Efektywnymi antygenami są białka, polisacharydy i kwasy nukleinowe. Miejsce antygenu wiązane przez przeciwciała nazywa się epitopem lub determinantą antygenową.
15.Hapteny to małe, obce cząsteczki (Mcz<1kDa), które nie indukują przeciwciał, zdolność tą zdobywają po przyłączeniu wielocząsteczkowego nośnika, zazwyczaj białka. Przykłady haptenów: hormony, toksyny, małe peptydy.
16.Struktura immunoglobulin( przeciwciał).
Wszystkie przeciwciała mają podobną budowę. Są to białkowe cząsteczki o kształcie litery "Y" o masach cząsteczkowych od 150 do 970 kDa, złożone z czterech glikozylowanych łańcuchów peptydowych. Dwa z tych łańcuchów, określane mianem łańcuchów ciężkich są dłuższe i związane ze sobą wiązaniami dwusiarczkowymi. Pozostałe dwa łańcuchy, nazywane lekkimi) są związane z łańcuchami ciężkimi również za pomocą mostków dwusiarczkowych. Obydwa łańcuchy ciężkie w danej cząsteczce są identyczne, podobnie jest z łańcuchami lekkimi. 17.Immunizacja to podanie antygenu, aby otrzymać odpowiedź immunologiczną. 18.Charakterystyka oddziaływań Ag-Ab: a)teoria klucza i zamka b)wiązania niekowalencyjne - -mostki wodorowe -oddziaływania elektrostatyczne -siły Van der Waalsa -oddziaływanie hydrofobowe c)wiązania wielokrotne d)odwracalne 19.Efektywnośc reakcji Ag-Ab a)wartościowość -liczba determinant antygenowych, które może związać cząsteczka przeciwciała. b)powinowactwo -siła wiązania pojedynczej determinanty antygenowej z jednym paratopem. c)zachłanność - charakteryzuje siły wiążące jedno poliwalentne przeciwciało z jednym wielowartościowym antygenem. Powinowactwem przeciwciała nazywamy siłę wiązania antygenu przez pojedynczy paratop, co odpowiada reakcji, w której pojedyncze paratopy przeciwciał reagują z antygenami. Reakcja jest przedstawiona poniżej:
Przy małym powinowactwie tworzy się mniej kompleksów, a przeciwciała takie są mniej skuteczne. Wynika to z faktu, iż przeciwciała o dużym powinowactwie zwiążą dużo antygenów już przy ich małym stężeniu, a więc szybciej zareagują na ich obecność.
Powinowactwo zależy zarówno od szybkości tworzenia się wiązań między epitopem i paratopem, jak również od siły tego wiązania. Zachłanność oznacza ona siłę wiązania poliwalentnego antygenu z kilkoma paratopami przeciwciała. Jest to stała reakcji przedstawionej poniżej i jest obliczana w podobny sposób jak w przypadku powinowactwa:
20.Przeciwciała użyteczne w analityce: -przeciwciała poliklonalne- mieszanina immunoglobulin o różnej specyficzności i powinowactwie rozpoznające różne(liczne) epitopy użytego do immunizacji antygenu -przeciwciała monoklonalne- jednorodny typ immunoglobulin pochodzący z jednej linii komórek limfocytów mających jednakową specyficzność i powinowactwo. 21.Reakcje krzyżowe jest to wiązanie innych niż antygen substancji przez przeciwciało specyficzne dla danego antygenu; substancje reagujące krzyżowo mają zbliżone konfiguracje do determinant określonego antygenu. 22.Typy reakcji immunochemicznych : Reakcje pierwotne polegają na formowaniu kompleksu antygen -przeciwciało -chromatografia immunopowinowactwa -zastosowanie znakowanych reagentów (RIA,EIA, immunofluorescencje, biosensory) Reakcje wtórne polegają na tworzeniu precypitujących immunokompleksów -immunoprecypitacja w żelu -aglutynacja i bierna aglutynacja -immunoprecypitacja w roztworze (immunoelektroforeza, podwójna dyfuzja, immunoelektrodyfuzja, elektrosynereza) 23.Chromatografia immunopowinowactwa 24.Immunochromatografia paskowa 25.Aglutynacja 26.Elisa -immunoenzymatyczny test fazy stałej Zasada działania testu ELISA polega na tym, że przeciwciało związane z określonym enzymem może specyficznie rozpoznawać dane białko, które wcześniej zostało unieruchomione na podłożu. Po dodaniu przeciwciał następuje utworzenie kompleksów immunologicznych, zatem przeciwciało także zostaje unieruchomione. Po wypłukaniu niezwiązanego przeciwciała i dodaniu substratu dla enzymu związanego z przeciwciałem zajdzie reakcja enzymatyczna, czemu z kolei będzie towarzyszyło pojawienie się produktu. Wykrycie jego obecności świadczy o obecności danego białka w badanym materiale. Mierząc z kolei ilość powstającego produktu można także przeprowadzić analizę ilościową. Typy oznaczeń: -kompetycyjne -niekompetycyjne -kanapkowe -pośrednie -bezpośrednie 27.Enzymatyczne znaczniki przeciwciał: -peroksydaza chrzanowa -alkaliczna fosfataza 28.Immunobloting - etapy: 1.Elektroforeza w żelu poliakcylamidowym. 2. Transfer białek w żelu na matryce. Blokowania (wysycenie wolnych miejsc wiążących matrycy) 4.Wywołanie matrycy: Reakcje bezpośrednie - antygen jest wiązany bezpośrednio przez znakowane przeciwciało. Reakcje pośrednie-antygen jest wiązany przez przeciwciało wykrywane następnie znakowanym przeciwciałem antyimmunoglobulinowym.
.
