WYKŁAD 13

1

GMO – genetyczne ulepszanie

entomofagów

Wykład 13

WYKŁAD 13

2

Wiele integrowanych

programów ochrony roślin

w szklarniach i sadach

opiera się na chronieniu

miejscowych wrogów

naturalnych lub

stosowaniu selektywnych

pestycydów, których liczba

nie jest wielka.

Rozwiązanie problemu

widzi się w wykorzystaniu

populacji drapieżnych i

pasożytniczych

stawonogów odpornych na

chemiczne pestycydy.

Genetyczne ulepszanie

entomofagów

GMO

WYKŁAD 13

3

Zainteresowanie tym

zagadnieniem jest

bardzo żywe i znamy

obecnie 15 gatunków

entomofagów i

akarofagów o różnym

stopniu odporności na

różne grupy

pestycydów:

fosforoorganiczne,

karbaminiany i

pyretroidy

Genetyczne ulepszanie

entomofagów

GMO

WYKŁAD 13

4

Do grupy najlepiej znanych gatunków należą

drapieżne roztocze Amblyseius fallacis,

Metaseiulus occidentalis i Typhlodromus

pyri, których odporność na wiele

pestycydów powstała wskutek presji

pestycydowej w sadach oraz dodatkowo

selekcji laboratoryjnej

Genetyczne ulepszanie

entomofagów

GMO

WYKŁAD 13

5

Metody selekcji naturalnej są jednak

pracochłonne, długotrwałe i zawodne,

gdyż odporność często szybko zanika przy

braku presji pestycydowej.

Prowadzone vv Polsce prace nad

wyselekcjonowaniem populacji kruszynka

Trichogramma oraz Phytoseiulus

persimilis odpornych na chemiczne

pestycydy nie powiodły się.

Genetyczne ulepszanie

entomofagów

GMO

WYKŁAD 13

6

Inżynieria genetyczna oparta na

technice rekombinacji DNA

zapewnia szybkie uzyskiwanie

ras stawonogów odpornych na

pestycydy, zwłaszcza jeśli

odporność jest regulowana

przez pojedynczy gen.

Pożądany gen odporności uzyskuje

się przez selekcję, mutagenezę

lub klonowanie, a genetyczne

doskonalenie entomofaga tym

sposobem obejmuje kilka

etapów przebiegających w

laboratorium oraz w warunkach

polowych.

Genetyczne ulepszanie

entomofagów

GMO

WYKŁAD 13

7

Etapy laboratoryjne

obejmują:

identyfikację i

klonowanie

określonych

genów,

opracowanie

techniki transferu

genów,

ustalenie

trwałości

transformacji.

Genetyczne ulepszanie

entomofagów

GMO

WYKŁAD 13

8

Etapy polowe obejmują:

potwierdzenie

skuteczności

transgenicznego

akarofaga lub

entomofaga w

ograniczaniu

liczebności szkodnika,

jego „fitness"

• oraz brak ujemnego

wpływu na

środowisko.

Genetyczne ulepszanie

entomofagów

GMO

WYKŁAD 13

9

Hoy uzyskała transgeniczny szczep

drapieżnego roztocza

Metaseiulus occidentalis,

wprowadzając do jego genomu

gen odporności na

fosforoorganiczne pestycydy.

Agendy rządowe USDA, FDA i EPA

zezwoliły na badania

transgeniczych entomofagów w

izolatorach polowych, które

rozpoczęto w 1996 r.

Genetyczne ulepszanie

entomofagów

GMO

WYKŁAD 13

10

Na 14 Międzynarodowym Kongresie Ochrony

Roślin w Jerozolimie Hoy, przedstawiając

tę problematykę, stwierdziła, że małe jest

jeszcze rozeznanie o bezpieczeństwie

stosowania tej metody, aby podjąć

decyzje o powszechnym uwalnianiu M.

occidentalis w sadach.

Przypuszcza się, że badania takie mogą

trwać jeszcze 8-10 lat.

Genetyczne ulepszanie

entomofagów

GMO

WYKŁAD 13

11

Genetyczne doskonalenie Bacillus

thuringiensis

Owadbójcza bakteria

Bacillus thuringiensis

została odkryta przez Ishiwatę w 1901 r. i

taksonomicznie opisana przez Berlinera w

1915 r. Jest składnikiem kilkudziesięciu

owadobójczych handlowych biopreparatów,

których roczne zużycie ocenia się na około 3

mln kg o wartości 200 mln USD, co nie jest

dużo w porównaniu z 30 mld USD, tj.

wartością całego rynku pestycydów

Genetyczne doskonalenie B.

thuringiensis

GMO

WYKŁAD 13

12

Na przykładzie bakteryjnych biopreparatów

szczególnie dobrze widać, w jak wielkim

stopniu postęp w biotechnologii

korzystnie wpływa na skalę produkcji i

doskonalenie ich form użytkowych.

Genetyczne doskonalenie B.

thuringiensis

GMO

WYKŁAD 13

13

Pierwszy biopreparat Sporeine był

produkowany krótko w latach

trzydziestych we Francji. Dopiero postęp

w mikrobiologii przemysłowej i

technologiach fermentacji wgłębnej

umożliwił w 1958 roku podjęcie masowej

produkcji biopreparatu Thuricide, a to

dało początek lawinowemu uruchamianiu

produkcji w różnych krajach

Genetyczne doskonalenie B.

thuringiensis

GMO

WYKŁAD 13

14

Najszersze zastosowanie w produkcji

znalazła bakteria Bacillus thuringiensis

ssp. kurstaki, której odkrywcą w 1962 r. -

podczas pobytu na stypendium INRA w La

Miniere pod Paryżem - był Edward

Kurstak, pracownik Instytutu Ochrony

Roślin w Poznaniu, a w okresie

późniejszym profesor na Uniwersytecie w

Montrealu w Kanadzie

Genetyczne doskonalenie B.

thuringiensis

GMO

WYKŁAD 13

15

W wyniku intensywnych badań prowadzonych

w

różnych

krajach

i

na

różnych

kontynentach, opisano wiele gatunków,
odmian i serowarów B. thuringiensis,
m.in.:

• B. t. ssp. aizawai, B. t. ssp. galleriae, B. t.

ssp. morrisoni - mających gen CryIA i
aktywnych przeciw motylom (Lepidoptera);

• B. t. ssp. israelensis - mający gen CryIIA

aktywny

przeciw

muchówkom

(Diptera),m.in. komarom i mustykom;

• B. t. ssp. tenebrionis mający gen CryIIIA

aktywny

przeciw

chrząszczom

(Coleoptera), m.in. stonce ziemniaczanej

Genetyczne doskonalenie B.

thuringiensis

GMO

WYKŁAD 13

16

Przez blisko dwadzieścia lat biopreparaty

typu B. thuringiensis zawierały szczepy

naturalne, ale zmieniło się to, gdy pod

koniec lat siedemdziesiątych Schnepf i

Whiteley jako pierwsi sklonowali gen

toksyny

B. t. ssp.

kurstaki w bakterii

Escherichia coli.

Genetyczne doskonalenie B.

thuringiensis

GMO

WYKŁAD 13

17

Dalszy postęp w technikach inzynierii

genetycznej pozwolił uzyskać

biopreparaty o wielu specyficznych

cechach, jak np. brak przetrwalników,

dzięki czemu spełniały one wymagania

krótkiej trwałości w środowisku wodnym

stawiane przez niektóre kraje, np.

Niemcy.

Takie właściwości biopreparatów były

możliwe do osiągnięcia tylko dzięki

transkoniugacji i bioinkapsulacji opartej

na inżynierii genetycznej.

Genetyczne doskonalenie B.

thuringiensis

GMO

WYKŁAD 13

18

Biopreparaty oparte na zmodyfikowanych

genetycznie podgatunkach Bacillus thuringiensis  

Genetyczne doskonalenie B.

thuringiensis

GMO

Biopreparat i technika
modyfikacji genetycznej

Podgatunek

Producent

Transkoniugacja

 

 

Condor

kurstaki

Ecogen Inc.

Cutlass

kurstaki

Mycogen Corp.

Foil

kurstaki/tenebrionis

Ecogen Inc.

Turex/Agree

kurstaki/aizawai

Novartis

Transgeniczność

 

 

M-Peril

kurstaki

Mycogen Corp.

M-Trak

tenebrionis

Mycogen Corp.

Bacillus thuringiensis

 

MVP

kurstaki

Mycogen Corp.

WYKŁAD 13

19

Biopreparaty produkowane przez Mycogen

Corporation charakteryzują się tym, że

techniką rekombinacji DNA przeniesiono

geny CryIA - kodujące produkcję delta-

endotoksyny - do niechorobotwórczej

bakterii Pseudomonas fluorescens, w

której komórce nie rozwija się

przetrwalnik, natomiast powstaje

krystaliczna endotoksyna o swym

normalnym romboedrycznym kształcie i

toksycznym działaniu na wrażliwe owady

Genetyczne doskonalenie B.

thuringiensis

GMO

WYKŁAD 13

20

Komórki P. fluorescens hodowane są na

płynnych pożywkach w zbiornikach

fermentacyjnych i zabijane metodami

fizycznymi lub chemicznymi.

Kryształki B. thuringiensis są otoczone

ściankami komórki P. fluorescens i

dlatego technika ta nazywana jest

CellCap.

Genetyczne doskonalenie B.

thuringiensis

GMO

WYKŁAD 13

21

Odznacza się ona wieloma korzystnymi

cechami

technologicznymi

i

środowiskowymi, takimi jak:

• Zwiększona trwałość - bioinkapsulacja

zapewnia lepszą trwałość i większą
skuteczność.

Giętkość genowa - ekspresja jednego
genu w transgenicznej bakterii ułatwia
opracowanie biopreparatu.

Bezpieczeństwo środowiskowe - brak
chorobotwórczości dla niezwalczanych
owadów wskutek braku przetrwalników.

Genetyczne doskonalenie B.

thuringiensis

GMO

WYKŁAD 13

22

Rejestracyjne ułatwienia - biopreparaty
CellCap

zostały

zarejestrowane

w

kategorii „zabite mikroby".

Trwałość przechowywania - zwiększona
trwałość

wskutek

braku

żywych

mikroorganizmów.

Trwalsza forma użytkowa - toksyczny
kryształ jest w mikrokapsułce.

Genetyczne doskonalenie B.

thuringiensis

GMO

WYKŁAD 13

23

Genetyczne doskonalenie

bakulowirusów

Obecnie znamy 595 bakulowirusów, z

których wiele jest wysoce przydatnych w

biologicznym zwalczaniu szkodliwych

owadów, gdyż powodują one

spektakularne epizoocje i załamywanie

się gradacji wielu szkodników, np.

brudnicy mniszki (Lymantria monacha)

Genetyczne doskonalenie

bakulowirusów

GMO

WYKŁAD 13

24

W świecie produkuje się około 30

biopreparatów wirusowych metodą

in vivo lub zbierając martwe

zakażone owady, rozcierając ich

ciała i sporządzając proszki lub

zawiesiny wodne z wirusowych ciał

wtrętowych (poliedry i granule)

Genetyczne doskonalenie

bakulowirusów

GMO

WYKŁAD 13

25

Dzięki biotechnologicznym metodom

jest także możliwe namnażanie

bakulowirusów w komórkach

owadów hodowanych in vitro, ale

sposób ten stosuje się - jak dotąd -

tylko dla celów badawczych lub

przy produkcji lekarstw, z uwagi na

wysoki koszt pożywek do hodowli

tkanek i komórek.

Genetyczne doskonalenie

bakulowirusów

GMO

WYKŁAD 13

26

Śmierć owadów zakażonych przez

wirusy następuje dopiero po 4-7

dniach, co nie jest zadowalające z

punktu widzenia ochrony roślin,

gdyż w tym czasie żerujące chore

owady z reguły wyrządzają

gospodarcze szkody w uprawach.

Genetyczne doskonalenie

bakulowirusów

GMO

WYKŁAD 13

27

Dostępne techniki inżynierii

genetycznej umożliwiają znaczne

zwiększenie wirulencji u

genetycznie zmodyfikowanego

szczepu bakulowirusa, a tym

samym przyspieszenie śmierci

owada

Genetyczne doskonalenie

bakulowirusów

GMO

WYKŁAD 13

28

Najwięcej badań w tym kierunku

dotyczy bakulowirusa motyla- sówki

Autographa californica, którego

zakres żywicieli obejmuje 43

gatunki z 11 rodzin motyli. Genom

tego wirusa jest doskonale

zbadany, co umożliwia wycinanie

oraz wklejanie genów pożądanych z

punktu widzenia biologicznego

zwalczania

Genetyczne doskonalenie

bakulowirusów

GMO

WYKŁAD 13

29

Bogata literatura z tego zakresu

wskazuje na trzy skuteczne sposoby
zwiększania wirulencji bakulowirusów
przez wprowadzanie do ich genomu
obcych genów, które:

 kodują

toksyny

ze

skorpionów

Androctonus i Buthus lub roztocza
Pyemotes, zabijając lub paraliżując
zakażone owady;

Genetyczne doskonalenie

bakulowirusów

GMO

WYKŁAD 13

30

 kodują białka regulujące produkcję

hormonalnego ekdysteroidu UDP-
glukosulfonotransferazy,
blokującego rozwój larw owadów;

 Kodują

delta-endotoksynę

B.

thuringiensis, która - powodując
paraliż

-

w

istotny

sposób

przyspiesza śmierć owadów

Genetyczne doskonalenie

bakulowirusów

GMO

WYKŁAD 13

31

Genetyczne modyfikacje

bakulowirusów mają także na celu

zmniejszenie ich przeżywania w

środowisku, co jest niekiedy

pożądane lub wymagane ze

względów środowiskowych, gdy

stosuje się transformowane

bakulowirusy.

Genetyczne doskonalenie

bakulowirusów

GMO

WYKŁAD 13

32

Zmniejszenie trwałości w środowisku

uzyskuje się przez eliminację z

genomu bakulowirusa genu

polyhedryny p 10, a w jego miejsce

wprowadza się gen Lac2 jako

marker, celem monitorowania

bakulowirusa w środowisku

Genetyczne doskonalenie

bakulowirusów

GMO

WYKŁAD 13

33

Dotychczasowe przepisy nie pozwalają

na rejestrację i stosowanie

biopreparatów opartych na

transformowanych bakulowirusach,

będzie to jednak możliwe już

wkrótce w USA.

Genetyczne doskonalenie

bakulowirusów

GMO

WYKŁAD 13

34

Dlatego w wielu ośrodkach

naukowych prowadzi się

intensywne badania rozwojowe

nad wykazaniem bezpieczeństwa

zmodyfikowanych bakulowirusów

dla środowiska. Wyniki

dotychczasowych badań nie

wykazały zagrożeń, dlatego należy

oczekiwać pozytywnych decyzji

rejestracyjnych

Genetyczne doskonalenie

bakulowirusów

GMO

WYKŁAD 13

35

Genetyczne doskonalenie nicieni

Dla praktyki najważniejsze znaczenie ma

fakt zidentyfikowania pierwszych,

indywidualnych genów

odpowiedzialnych za cechy mające

wpływ na aktywność owadobójczą larwy

inwazyjnej nicieni.

Łatwość tworzenia dużych populacji

homozygotycznych pod względem

zmutowanych alleli pozwala na dalsze

prace modyfikacyjne w obrębie tych

genów

Genetyczne doskonalenie nicieni

GMO

WYKŁAD 13

36

Poddanie takich populacji dalszej

mutagenezie daje możliwość

identyfikacji nowych alleli tych genów,

lub odkrywania innych genów,

wykazujących w stosunku do nich

działanie supresyjne, lub epistatyczne.

Genetyczne doskonalenie nicieni

GMO

WYKŁAD 13

37

Stopniowo zwiększająca się ilość

zidentyfikowanych genów oraz

związanych z nimi fenotypów pozwoli

również na konstruowanie mutantów

podwójnych i wielokrotnych na drodze

rekombinacji genentycznej

Genetyczne doskonalenie nicieni

GMO

WYKŁAD 13

38

Mogą one przyczynić się do tworzenia

dalszych, jakościowo nowych fenotypów

i określenia oddziaływania łączonych

mutacji na wzajemną ekspresję, a w

konsekwencji na aktywność

owadobójczą uzyskanych populacji.

Dzięki opracowanym metodom

indywidualnego krzyżowania partnerów,

ich mikrohodowli in vitro oraz

utrwalania wybranych połączeń alleli

uzyskać można możliwość

konstruowania szczepów o fenotypach

szczególnie pożądanych dla praktyki

ochrony roślin

Genetyczne doskonalenie nicieni

GMO

WYKŁAD 13

39

Wykorzystanie mutagenezy w identyfikacji

genów odpowiedzialnych za aktywność

owadobójczą larwy inwazyjnej S. feltiae

mogą stanowić zaledwie wstęp do

poznania genetyki nicieni

owadobójczych.

Skoncentrowanie prac nad stadium larwy

inwazyjnej pozwoliło jednak na

eksplorację najważniejszych dla ochrony

roślin obszarów genetyki tej grupy

organizmów.

Genetyczne doskonalenie nicieni

GMO

WYKŁAD 13

40

Dzięki zwiększonej skuteczności polowej

selekcjonowane szczepy mogą być

wykorzystywane w preparatach

handlowych, jak ma to miejsce w

przypadku szczepu ScP.

Utrzymanie ich wysokiej jakości wymaga

jednak zachowania niezbędnych

procedur, uniemożliwiajacych cofnięcie

się ulepszonych cech do stanu

wyjściowego

Genetyczne doskonalenie nicieni

GMO

WYKŁAD 13

41

Selekcja jest jednak procesem

czasochłonnym. Dobór czynników

selekcyjnych automatycznie ogranicza

zaś zakres przyszłego użytkowania

wyselekcjonowanego szczepu.

0pracowane i stosowane metody pozwalają

w praktyce na zwiększenie skuteczności

nicieni przeciwko stosunkowo wąskiej

grupie szkodników, w ograniczonym

zakresie warunków środowiskowych

(uprawa pieczarki, uprawa trawy,

podłoże do upraw szklarniowych).

Genetyczne doskonalenie nicieni

GMO

WYKŁAD 13

42

Podejmując nowy proces selekcyjny, trzeba

więc

wracać do populacji wyjściowej prezentującej

możliwie najszerszy zakres zmienności

genetycznej i rozpoczynać prace od

początku.

Dlatego w celu przyspieszenia procesu

doskonalenia szczepów konieczne jest

opracowanie metod umożliwiających łatwe

uzyskanie oraz wprowadzenie do

ulepszanej populacji indywidualnych cech

fenotypowych, mogących mieć znaczenie

uniwersalne dla aktywności nicieni

owadobójczych

Genetyczne doskonalenie nicieni

GMO